H3K9甲基化与乙酰化修饰在小鼠睾丸发育过程中的动态表达模式

Dynamic expression patterns of H3K9 methylation and acetylation modifications during mouse testicular development

摘要

针对组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9）甲基化修饰在小鼠睾丸组织中的时空动态特征尚不明确这一问题，采用Western blot和石蜡切片免疫荧光技术，系统解析了H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K9ac在小鼠生精细胞不同发育阶段的表达规律。结果显示：H3K9me1与H3K9me3呈现相似分布模式，在细线期、偶线期精母细胞和长形精子中高表达，而在精原细胞、粗线期、双线期精母细胞和圆形精子细胞中显著降低，成熟精子中未检测到表达；H3K9me2在所有生精细胞类型中均存在表达，但早期长形精子与减数分裂前期细胞中表达水平显著高于其他阶段；H3K9ac则在细线期、粗线期精母细胞和长形精子头部呈现特异性富集。值得注意的是，H3K9me3在减数分裂启动期的阶段性沉默，而H3K9ac在染色质重塑期的特异性激活，H3K9不同修饰形式在精子发生关键阶段的动态差异提示其可能通过差异化的表观调控机制参与生殖细胞分化。首次绘制了H3K9修饰在小鼠生精上皮周期中的全景表达图谱。

Abstract

To address the ambiguous spatiotemporal dynamics of histone H3 lysine 9 （H3K9） methylation modifications in murine testicular tissue， the expression patterns of H3K9me1， H3K9me2， H3K9me3 and H3K9ac across various developmental stages of mouse germ cells were systematically analyzed by Western blot and paraffin section immunofluorescence techniques. The findings indicated that H3K9me1 and H3K9me3 shared similar distribution patterns， characterized by elevated expression in leptotene， zygotene spermatocytes and elongated spermatids， with a marked reduction in spermatogonia， pachytene， diplotene cells and round spermatids. Notably， no expression was observed in mature spermatozoa. In contrast， H3K9me2 was expressed across all spermatogenic cell types， with significantly higher levels in early elongated spermatids and pre-meiotic cells compared to other stages. H3K9ac demonstrated specific enrichment in leptotene， pachytene spermatocytes and the heads of elongated spermatids. Importantly， H3K9me3 was silenced during the initiation of meiosis， whereas H3K9ac was specifically activated during chromatin remodeling. The observed dynamic variations in H3K9 modification formed during critical stages of spermatogenesis implied a potential role in germ cell differentiation via distinct epigenetic regulatory mechanisms. The first time， a comprehensive expression profile of H3K9 modifications was offered throughout the mouse spermatogenic epithelial cycle.

Graphical abstract

关键词

精子发生 / 组蛋白修饰 / H3K9甲基化 / H3K9ac

Key words

spermatogenesis / histone modification / H3K9 methylation / H3K9 acetylation

0 引言

哺乳动物精子发生是雄性生殖的核心生物学过程，主要包括精原细胞的有丝分裂、精母细胞的减数分裂和精子细胞的变形等3个阶段，每个阶段均受到基因表达的精确调控^［1］。每一阶段分化程序不仅依赖于基因组的精确调控，更受到表观遗传修饰的动态引导^［2］。作为表观遗传调控的核心机制之一，组蛋白修饰通过重塑染色质结构直接调控生殖细胞基因组的可塑性，是解析精子发生分子机制的关键突破口^［3］。其中，组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9）的甲基化修饰（me1/me2/me3）因参与异染色质形成、转座子沉默及基因组稳定性维持，被证实为真核生物中高度保守的表观调控标记。然而，H3K9甲基化在精子发生各阶段的动态变化规律、功能特异性及其与其他修饰的协同作用，尚未形成系统性认知，这极大限制了对生殖细胞命运决定分子网络的理解。因此，解析H3K9甲基化修饰在精子发生中的表达特征与调控机制，对阐明雄性生殖障碍的病理基础具有重要理论价值。

近年研究表明，H3K9甲基化修饰通过其甲基化程度（me1/me2/me3）差异形成空间特异性的调控网络：H3K9me1主要富集于活性常染色质区域，参与基因转录激活^［4］；而H3K9me2/me3则作为异染色质标记，通过招募异染色质蛋白1（Heterochromatin Protein 1，HP1）家族蛋白介导转录沉默^［5］。在雄性生殖细胞中，多种甲基转移酶通过时空特异性表达调控H3K9甲基化状态：SET结构域分支型组蛋白赖氨酸甲基转移酶1（SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1）负责减数分裂期性染色体相关异染色质的形成，其缺失可导致性染色体失活异常及减数分裂停滞 ^［6］；G9A/GLP（G9A/G9a-like protein，G9A/G9A样蛋白）复合体主要催化H3K9me2，其缺陷会引发胚胎期生殖细胞发育受阻^［7］；SUV39H1/2（Suppressor of variegation 3-9 homolog 1，杂色抑制因子3-9同系物1）则通过催化H3K9me3维持减数分裂后期染色质浓缩^［8］。上述研究初步证实H3K9甲基化修饰对精子发生的必要性，但多聚焦于单一修饰酶的功能解析，缺乏对不同甲基化状态（me1/me2/me3）在生精细胞全发育周期中动态分布的系统描绘。

尽管H3K9甲基化在精子发生过程中的重要性已得到验证，但不同H3K9甲基化动态分布规律和不同修饰间协同调控机制仍不清楚，以下核心科学问题亟待解答：

1） H3K9me1/me2/me3在精原细胞、精母细胞及精子细胞各亚阶段的表达水平与亚细胞定位如何变化？

2） 不同H3K9甲基化状态之间是否存在交叉调控（如me1向me2/me3的转化）？其与其他组蛋白修饰（如H3K9ac）如何协同调控染色质状态与基因表达？

针对上述问题，本研究通过整合Western blot定量分析（WB）与石蜡切片免疫荧光定位技术（IF），系统探究了H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3及H3K9ac在小鼠睾丸生精上皮周期中的表达特征，发现H3K9me1/me3在减数分裂前期（细线期、偶线期）及长形精子中呈现阶段性高表达，而在精原细胞及圆形精子中显著下调，提示其可能参与减数分裂启动与染色质最终浓缩；H3K9me2维持广泛表达但存在核质定位差异，推测其在不同阶段承担异染色质维持的基础功能；H3K9ac作为协同标记，特异性富集于染色质重塑活跃阶段（如精原细胞增殖期），与甲基化修饰形成功能互补。这些发现首次揭示了H3K9修饰在精子发生关键节点的特异性调控模式，为阐明表观遗传修饰介导的基因表达层级调控提供了新视角，也为解析雄性不育的表观遗传机制提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

实验所用动物是饲养在信阳师范大学生命科学学院的实验动物房中的C57BL/6小鼠，饲养环境适宜小鼠生长，温度20~22 ℃，湿度50%~70%，光照与黑暗比1∶1，自由进食。所有动物实验均经信阳师范大学机构审查伦理委员会审查批准（XFEC-2021-011）。

1.1.2 实验主要设备与试剂

倒置荧光显微镜尼康Ti2-U（尼康），化学发光成像系统（天能）。

Western封闭液（Beyotime）、Western 抗体稀释液（Beyotime）、DAPI染色液（Servicebio）、封闭山羊血清（Beyotime）、抗荧光淬灭封片液（Beyotime）、Triton X-100（Servicebio）、二甲苯（上海生工）、抗原修复液（Servicebio）和抗体（见表1）。

1.2 实验方法

1.2.1 Western Blot

采集出生后不同发育时期（7、14、21、28、42、56 d）野生型小鼠睾丸组织，每个时期3只小鼠，利用Western Blot 技术检测H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K9ac在小鼠睾丸发育过程中的动态表达。

取冻存于-80 ℃冰箱的睾丸组织，使用RIPA裂解液提取蛋白质，BCA法检测蛋白质浓度。将蛋白质样品煮沸变性，加入5×SDS上样缓冲液。制备12%分离胶和5%浓缩胶，根据蛋白质浓度点样，进行SDS-PAGE电泳，全程80 V。电泳后切下目标胶带，300 mA转膜2 h；将膜放入5%脱脂奶粉中封闭2 h；一抗4 ℃孵育至少12 h，孵育后TBST洗3次，每次10 min；二抗室温摇床孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。最后进行ECL检测，在化学发光成像系统中曝光拍照。

1.2.2 石蜡切片免疫荧光

采集3只56 d野生型小鼠睾丸制备组织石蜡切片，利用组织免疫荧光技术检测H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K9ac和γH2A.X信号，确定H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K9ac在不同类型雄性生殖细胞中的表达定位。

主要采用的实验技术方法是石蜡切片免疫荧光法。使用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次脱蜡5 min，然后在100%、90%、80%、70%乙醇中依次浸泡3 min，再用超纯水清洗3次，每次5 min；将抗原修复液加热至沸腾，再进行玻片修复10 min，放置冷却到室温，TBS清洗3次，每次5 min；用山羊血清室温封闭2 h；玻片放置在湿盒中，加一抗4 ℃过夜孵育；次日恢复至室温后，TBS清洗3次，每次5 min；二抗室温孵育2 h，TBS清洗3次，每次5 min；DAPI染色10 min，TBS清洗3次，每次5 min；加抗荧光猝灭剂后封片，荧光显微镜下观察及拍照分析。

2 结果与分析

2.1 H3K9在出生后小鼠睾丸中的蛋白表达谱

为探究H3K9甲基化和乙酰化在小鼠精子发生进程中的动态作用，选取出生后7、14、21、28、42和56 d的小鼠睾丸组织作为研究对象。这些时间点分别对应小鼠睾丸发育的关键阶段：7~14 d处于生精小管结构初步形成期；21~28 d是精原细胞开始大量分化、减数分裂启动的关键时期；42~56 d则接近性成熟，精子逐渐成熟。通过蛋白提取和Western Blot实验，系统检测H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3及H3K9ac 的表达情况。结果显示，H3K9甲基化和乙酰化水平在小鼠睾丸发育过程中呈现显著动态变化（图1）：出生后7~14 d，伴随生精小管的初步构建，二者表达逐渐减弱，这可能与该阶段细胞以基础增殖为主，对基因转录的精细调控需求相对较低有关；当小鼠生长至21~28 d，随着减数分裂的启动和精原细胞的大量分化，H3K9甲基化和乙酰化水平显著升高，暗示其可能在调控减数分裂相关基因表达、推动精子发生进程中发挥关键作用；而在 42~56 d接近性成熟阶段，其表达再次减弱，推测这与精子成熟过程中基因表达模式的转变相关。上述动态表达特征表明，H3K9甲基化和乙酰化蛋白水平与小鼠睾丸发育及精子发生的关键进程紧密相关，极有可能在小鼠精子发生的复杂调控网络中占据重要地位。

2.2 H3K9me1在成年小鼠睾丸中的表达与定位

为进一步明确H3K9甲基化和乙酰化修饰在精子发生关键节点的具体作用，选用精原细胞、减数分裂期精母细胞、圆形精子及长形精子等不同发育阶段的代表性生殖细胞。这些细胞类型涵盖了精子发生过程中减数分裂Ⅰ前期的关键进程，其中精原细胞是精子发生的起始细胞，精母细胞各阶段则对应减数分裂过程中DNA重组、染色体配对等重要事件^［9］。通过免疫荧光技术，系统检测了H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3及H3K9ac的表达模式。结果显示，H3K9me1在精原细胞、细线前期精母细胞、细线期精母细胞、偶线期精母细胞中呈现较强的荧光信号（图2）。已有研究表明，H3K9me1修饰水平与基因转录抑制密切相关^［10］，由此推测在上述细胞阶段，多数基因的转录可能受到抑制，这或许与维持细胞干性、调控精原细胞增殖及准备减数分裂相关基因表达的前期调控有关。与之形成鲜明对比的是，在粗线期精母细胞和双线期精母细胞中检测到极低的H3K9me1的荧光信号。结合H3K9me1的转录抑制功能，这一现象提示在此阶段细胞内多数基因转录处于活跃状态，以满足减数分裂过程中同源染色体配对、重组等复杂事件对基因表达的需求。

2.3 H3K9me2在成年小鼠睾丸中的表达与定位

H3K9me2抗体染色结果揭示了其在小鼠生殖细胞发育进程中的动态表达图谱（图3）。在精子发生的起始阶段，精原细胞中H3K9me2呈现较弱的荧光信号，暗示其低表达状态。随着细胞进入减数分裂阶段，在细线期和偶线期精母细胞中，H3K9me2的荧光信号显著增强。已有研究表明，H3K9me2修饰通常与基因转录抑制相关^［11］，据此推测在此阶段，细胞内多数基因的转录活动可能受到抑制，这或许有助于维持减数分裂前期细胞的特定状态，为后续的染色体配对和重组等重要事件做好准备。

当细胞发育至粗线期、双线期精母细胞以及M期精母细胞和圆形精子细胞阶段时，H3K9me2的荧光信号强度再次减弱，表明其表达水平下降。结合H3K9me2与转录抑制的关联，此时细胞内多数基因转录可能趋于活跃，以满足减数分裂进程推进和精子细胞早期形态构建的需求。

值得注意的是，在早期变形期的长形精子中，H3K9me2的荧光信号再度增强，提示其表达上调，基因转录抑制状态可能重新建立，这一现象可能与精子变形过程中染色质高度浓缩和基因表达模式的重塑密切相关。而在成熟精子中，H3K9me2荧光强度显著减弱，维持在较低表达水平，这可能与成熟精子高度特化的结构和功能相适应，仅保留必要的基因表达，以维持其基本活性。

整体来看，H3K9me2在生殖细胞中的表达呈现出明显的阶段特异性，这种动态变化可能通过精细调控基因转录，在精子发生的各个关键环节发挥重要作用。

2.4 H3K9me3在成年小鼠睾丸中的表达与定位

H3K9me3抗体染色结果呈现出其在小鼠生殖细胞发育进程中独特的时空表达特征（图4）。在精子发生的起始阶段，精原细胞和减数分裂早期的细线期、偶线期精母细胞中，H3K9me3展现出较强的荧光信号，表明这些细胞中H3K9me3处于高表达状态。已有研究证实，H3K9me3作为一种典型的抑制性组蛋白修饰，常与基因转录沉默密切相关^［10］。由此推测，在此阶段细胞内多数基因的转录活动可能受到抑制，这或许有助于维持精原细胞干性，保障减数分裂前期细胞特定基因表达程序的有序进行，为后续染色体的配对和重组奠定基础。

随着细胞进入减数分裂中后期，在粗线期、双线期、M期精母细胞及圆形精子细胞中，仅能检测到局部微弱的H3K9me3荧光信号，这意味着H3K9me3的表达水平显著降低。结合其转录抑制功能，此阶段细胞内基因转录可能更为活跃，以满足减数分裂进程推进、染色质重塑和精子细胞形态早期构建等过程对基因表达的需求。

值得关注的是，在早期变形期的长形精子中，H3K9me3的荧光信号再次增强，表明其表达上调。这一现象可能与精子变形过程中染色质高度浓缩、基因表达模式的重塑密切相关，H3K9me3的重新激活或许参与调控相关基因，以实现精子形态和功能的特化。而在成熟精子中，完全检测不到H3K9me3的荧光信号，提示该修饰在成熟精子中基本不表达，这可能与成熟精子高度特化的结构和功能相适应，仅保留必要的基因表达以维持其活力和受精能力。

综上，H3K9me3在小鼠生殖细胞中的表达呈现出显著的阶段特异性，这种动态变化模式可能在精子发生的不同关键环节，通过精准调控基因转录，发挥着不可或缺的作用。

2.5 H3K9ac在成年小鼠睾丸中的表达与定位

H3K9ac抗体结合减数分裂标志蛋白γH2A.X染色结果（图5）显示，在第Ⅰ—Ⅳ期曲细精管管腔中，H3K9ac主要在精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子中呈现表达；第Ⅶ—Ⅷ期管腔中，其表达于细线前、粗线期精母细胞和长形精子；第Ⅸ期管腔里，H3K9ac在细线期、粗线期精母细胞和长形精子中呈现高表达；到了Ⅺ—Ⅻ期管腔，H3K9ac则在偶线期、双线期、M期精母细胞及长形精子中均有表达。

深入分析这一结果可知，H3K9ac的表达具有明显的时空特异性，这种选择性表达模式与精子发生的关键进程高度契合：在精子发生起始阶段（如第Ⅰ—Ⅳ期），H3K9ac在精原细胞中的表达，可能参与维持精原细胞的自我更新与分化平衡；在减数分裂活跃的阶段（如第Ⅸ期、Ⅺ—Ⅻ期），其在各类精母细胞中的高表达，结合H3K9ac通常与基因转录激活相关的特性^［12］，推测其可能通过激活减数分裂相关基因，推动染色体配对、重组等关键事件的进行；而在精子形态发生阶段（如在各期的长形精子中表达），H3K9ac或许参与调控染色质重塑和精子特异性蛋白表达相关基因，助力精子形态和功能的成熟。

综上，H3K9ac在不同类型生殖细胞及曲细精管不同发育阶段的特异性表达模式，提示其在精子发生的多个关键环节发挥重要调控作用。

3 讨论

表观遗传学的研究内容包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、基因组印记、X染色体失活、表观隔代遗传与其他涉及染色质重塑的调节机制。在雄性睾丸及其生殖细胞中，大量表观因子已被发现，部分功能及调控机制已经阐明^［13］。总体而言，如DNA甲基化、组蛋白修饰等表观修饰对精子发生过程以及受精过程的完成具有重要作用^［14］。在众多表观修饰中，组蛋白甲基化作为重要的调控机制，其动态变化在细胞周期调控、DNA损伤应答等过程中至关重要，尤其在精子发生中具有独特调控作用^［15］。

通过Western blot和石蜡切片免疫荧光技术，系统揭示了H3K9甲基化（H3K9me1/me2/me3）与乙酰化（H3K9ac）在小鼠精子发生过程中的动态表达模式，为表观遗传调控在生殖细胞分化中的作用提供了重要证据。研究结果显示，H3K9me1与H3K9me3在减数分裂前期（细线期、偶线期）及长形精子中显著富集，而在减数分裂中期（粗线期、双线期）及圆形精子中表达降低，提示二者可能协同调控减数分裂同源重组与染色体重塑。该结果与文献［16］通过低细胞量ChIP-seq技术揭示的H3K9me3在粗线期精母细胞中参与基因表达调控的结论一致。

值得注意的是，H3K9me3通常与基因转录抑制相关^［17］，H3K9me3在减数分裂启动期的阶段性沉默可能与其在重复序列区域的富集相关，而其在圆形精子期的功能转向基因启动子调控，暗示H3K9me3通过动态重编程参与基因组稳定性维护与转录激活的双重角色。H3K9me2在所有生精细胞类型中均有表达，但在早期长形精子与减数分裂前期细胞中表达水平更高，这表明H3K9me2在维持生精细胞的基本功能以及支持减数分裂前期和精子变形早期的细胞活动中具有重要意义。

H3K9ac在细线期、粗线期精母细胞及长形精子头部的特异性富集，鉴于H3K9ac通常与活跃的基因转录相关^［18］，其在这些阶段的特异性激活可能与染色质重塑以及精子头部结构形成相关基因的表达调控密切相关，可能通过松弛染色质结构促进重组热点的形成或精子形态建成。这一结果与山东大学陈子江团队^［19］的研究相一致，该团队发现H3K9ac在减数分裂重组热点处的富集依赖于H3K4me3阅读蛋白ZCWPW1（Zinc finger CW-type and PWWP domain containing 1，锌指CW型结构域1），并通过拮抗HDAC（histone deacetylase，组蛋白去乙酰化酶）活性维持染色质开放状态，从而促进同源重组修复。此外，H3K9ac在长形精子头部的定位可能与其参与鱼精蛋白替换过程中的染色质浓缩调控相关，但其具体机制仍需进一步验证。上述发现进一步丰富了对组蛋白修饰在精子发生过程中表观遗传调控机制的认识，为后续深入研究精子发生的分子机制提供了重要线索。

4 结束语

尽管本研究绘制了H3K9修饰在小鼠生精上皮中的表达谱，但仍存在一些局限性。首先，研究仅聚焦于修饰的时空分布，未明确H3K9修饰动态变化的分子驱动因素。例如，H3K9me3的阶段性沉默是否与甲基转移酶（如SUV39H1/2）或去甲基化酶（如KDM4B）的活性变化相关。近期同济大学高绍荣团队^［20］发现，克隆胚胎中H3K9me3异常富集可通过Kdm4b过表达部分修复，提示酶活性调控在修饰动态中的核心作用。其次，修饰动态与生殖细胞功能（如重组效率、染色质浓缩）的直接关联尚未通过基因敲除或过表达实验验证。例如，H3K9me2的广泛表达是否与SETDB1或G9A/GLP复合体的功能冗余相关？此前研究显示，SETDB1缺失导致减数分裂期性染色体沉默异常，而G9A缺陷则引发胚胎致死，暗示不同甲基转移酶的阶段特异性分工^［19］。基于以上局限性，未来应深入探究H3K9不同修饰形式在精子发生中的具体作用机制，可以通过基因敲除、过表达等技术手段，联合ATAC-seq、RNA-seq与修饰组学，研究H3K9修饰异常对精子发生相关基因表达和细胞功能的影响，明确其上下游调控关系。

总之，本研究通过时空图谱揭示了H3K9修饰在精子发生中的表达，H3K9修饰的动态差异表明，H3K9me3可能通过阶段性沉默转座子维持基因组稳定性，H3K9ac通过调节染色质可及性促进重组热点形成，而H3K9me2可能作为“缓冲修饰”维持基础转录抑制，为深入理解表观遗传与生殖细胞发育的互作机制奠定了重要基础，同时也为男性不育的精准诊疗提供了新思路。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31972537)

河南省科技攻关项目(242102111015)

河南省研究生教育改革与质量提升工程项目(YJS2025KC33)

信阳师范大学南湖学者计划项目