调控猪骨骼肌卫星细胞分化关键lncRNAs鉴定及功能研究

Identification and functional study of key lncRNAs regulating the differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells

摘要

猪骨骼肌发育状况直接影响畜牧业经济收益，针对猪骨骼肌发育问题，探究关键lncRNAs对猪骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用。采用RNA-Seq方法构建了猪骨骼肌卫星细胞的转录图谱。结果表明：3849个基因在不同分化时期骨骼肌细胞中差异表达，其中3557个为mRNAs，292个为lncRNAs；上述差异基因显著富集在轴突引导和致心律失常性右室心肌病等生物学过程及通路中；3个候选lncRNAs（MSTRG.13015、MSTRG.7609、MSTRG.18703）可能在猪骨骼肌卫星细胞分化过程中发挥重要调控功能，MSTRG.13015在猪骨骼肌卫星细胞分化60 h时表达量较高；MSTRG.7609在分化0、48 h时表达量相对分化60 h时较高，MSTRG.18703的表达量高于前两个lncRNAs，且随分化时间增长表达量持续升高。

Abstract

The development of porcine skeletal muscle can directly affect the economic benefits of the livestock industry. Aiming at the problem of porcine skeletal muscle development， the regulatory role of key lncRNAs was explored in the myogenic differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells. The RNA-Seq method was used to construct the transcriptional atlas of porcine skeletal muscle satellite cells. The results showed that： 3849 genes were differentially expressed in skeletal muscle cells at different differentiation stages， among which 3557 were mRNAs and 292 were lncRNAs； These differentially expressed genes were significantly enriched in biological processes and pathways such as axon guidance and arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy； Three candidate lncRNAs （MSTRG.13015， MSTRG.7609， MSTRG.18703） might play important regulatory functions during the differentiation of porcine skeletal muscle satellite cells. MSTRG.13015 had a relatively high expression level at 60 hours of porcine skeletal muscle satellite cell differentiation. MSTRG.7609 had relatively higher expression levels at 0 hours and 48 hours of differentiation compared with that at 60 hours of differentiation. The expression level of MSTRG.18703 was relatively higher than that of the previous two lncRNAs and continued to increase with the increase of differentiation time.

Graphical abstract

关键词

猪 / lncRNAs / RNA-seq / 鉴定 / 骨骼肌卫星细胞

Key words

pig / lncRNAs / RNA-seq / identification / skeletal muscle satellite cells

0 引言

猪肉是我国的主要肉食来源，其品质与产量对于保障优质蛋白质供给至关重要。猪肉的产量和品质受猪骨骼肌特性影响，猪骨骼肌卫星细胞是骨骼肌细胞生长、发育与维持所必需的^［1］。骨骼肌卫星细胞存在于成熟骨骼肌纤维周围，在正常状态下，骨骼肌卫星细胞处于静息状态，当骨骼肌受到运动等条件刺激后，卫星细胞被激活，经过增殖、分化，融合形成新的肌纤维，实现肌纤维的增大和肌肉损伤修复^［2-3］。卫星细胞对骨骼肌发育的重要性，使其成为研究骨骼肌发育调控机制的重要材料，同时是提高猪肉产量的关键所在。

骨骼肌卫星细胞的发育过程受多种成肌调控因子的调控，如肌源性分化抗原（Myogenic differentiation antigen， MyoD）、生肌因子５（Myogenic factor 5， Myf5）、肌细胞生成素（Myogenin， MyoG）、肌细胞增强因子2（Myocyte enhancer factor 2， MEF2）家族和转录因子Pax3、Pax7等。卫星细胞激活过程中，Pax7、Pax3及生肌调节因子（Myogenic regulator factors， MRFs）成员起重要作用，Pax7在所有的卫星细胞内都有表达，它能控制MyoD的表达，调控细胞的增殖、分化。动物出生后，Pax7持续表达在卫星细胞内，而Pax3表达水平较低^［4］。MRFs在卫星细胞肌源性分化中起重要作用，包含4种典型的bHLH转录因子，包括Myf5、MyoD、MRF4及MyoG。通常来说，Myf5和MyoD基因在分化过程中扮演关键角色。虽然MyoG和MRF4基因并不参与卫星细胞的增殖、成熟及稳定状态维持，但MyoG基因对于成肌细胞的终末分化以及肌管形成和肌纤维生成至关重要^［5］。

随着高通量测序技术的发展，发现仅有2%的基因有蛋白质编码能力，其余部分存在大量的非编码RNA（Noncoding RNA， ncRNA）。近年来，已报道ncRNA参与骨骼肌发育过程，ncRNA包括长链非编码RNA（Long noncoding RNA， lncRNA）、环状RNA（Circular RNA，circRNA）T和微小RNA（Micro RNA，miRNA）等多种类型，大量lncRNAs参与调控骨骼肌卫星细胞的增殖分化、肌肉再生和能量代谢等环节，例如lncRNA SYISL是一种肌肉发育的抑制因子，促进成肌细胞增殖及融合，但抑制其肌源性分化，在PRC2调控肌生成中起重要的作用^［6］。MyoD诱导MEG3表达，MEG3可作为分子支架以促进DLST蛋白表达，DLST促进猪骨骼肌卫星细胞的分化^［7］。过表达lncMREF可促进肌源性分化，在小鼠体内敲除后不影响肌肉正常发育，但导致肌肉再生减少^［8］。除上述骨骼肌发育相关lncRNAs外，还有许多报道表明lncRNAs参与骨骼肌生长发育调控。因此，发掘参与调控猪骨骼肌卫星细胞生长发育的新lncRNAs，揭示其调控功能和分子机理，可为我国猪遗传改良提供新分子标记和新思路^［9-10］。

本研究以猪骨骼肌卫星细胞为材料，收集分化0、48和60 h的卫星细胞进行转录组测序（RNA-seq）。通过RNA-seq数据分析，结合lncRNAs的分子特征鉴定新的lncRNAs，并对新鉴定的lncRNAs进行差异表达分析、加权基因共表达网络分析和功能注释，期望为探索猪骨骼肌卫星细胞增殖分化的分子调控机制提供重要的候选基因。

1 材料与方法

1.1 猪骨骼肌卫星细胞的分离

（1）取3日龄的大白猪仔猪，采用割颈法处死，待血液流尽后用流水冲洗全身，然后用75%乙醇充分消毒。所有动物实验均经信阳师范大学机构审查伦理委员会审查批准（XFEC-2022-015）。

（2）待仔猪转入生物安全柜后，取后腿从腹股沟到胫骨的肌肉组织，用加三抗的 PBS 漂洗肉样3次，并去除肌肉上附着的筋膜。

（3）将肉块转移到绞肉机内，选择孔径最细筛网，并添加少量的PBS防止阻滞。

（4）将肉糜放置于干净的15 cm大皿内，使用巴氏吸管吸除多余的PBS。

（5）向肉糜内加入双倍体积的300 U/mL的Ⅱ型胶原酶，37 ℃、160 r/min水浴摇床消化2.5 h 左右。

（6）在消化过程完成后，向培养瓶内加入等体积的终止消化液，吹打混匀，通过100目筛网进行过滤。

（7）将过滤后的溶液倒入50 mL的离心管中，在室温下以2500 r/min的速度离心15 min，然后弃去上层清液。

（8）用含有三抗的PBS溶液重新悬浮沉淀物，在室温下以1800 r/min的速度离心15 min，以去除上清液。

（9）用10 mL已提前预热至37 ℃的RPMI 1640基础培养基进行沉淀物的重新悬浮。

（10）用37 ℃预热的生长培养基重新悬浮沉淀物，并将悬浮液转移到10 cm的培养皿中。

（11）在37 ℃、5% CO₂的环境下进行贴壁培养2.5 h后，轻轻吹打培养皿底部，弃去上清液，并将上清液转移到已经用Matrigel预处理的培养皿中继续培养。

1.2 猪骨骼肌卫星细胞的复苏与传代培养

（1）提前将预冷的10 cm皿用Matrigel包被后放于37 ℃，5% CO₂的培养箱备用，预热生长培养基。

（2）从液氮罐中取出猪骨骼肌卫星细胞，放入一次性PE手套中，迅速放置于37 ℃水浴锅中摇晃，1~2 min内完成化冻。

（3）取出提前包被的10 cm皿，沿壁缓缓加入8 mL生长培养基，均匀滴加细胞液，十字摇匀后放置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。

（4）卫星细胞生长至60%~70%密度时，弃培养基，PBS洗1~2次，加1.2 mL预热胰蛋白酶消化2~3 min。显微镜下60%细胞变圆时，加等体积生长培养基终止消化。

（5）将细胞液转移到1.5 mL EP管，室温下1000 r/min离心5 min，弃上清。

1.3 猪骨骼肌卫星细胞的诱导分化

（1）纯化细胞接种于六孔板。

（2）细胞密度达60%~70%，PBS清洗后换分化培养基诱导分化。

（3）每2 d换液，分化持续4 d。

1.4 猪骨骼肌卫星细胞RNA提取及测序

（1）细胞处理：PBS洗２次，加Trizol裂解，吹打后转EP管，准备RNA提取。

（2）加氯仿振荡，室温静置15 min。

（3）4 ℃下离心，吸上清至新EP管。

（4）加异丙醇沉淀RNA，室温静置15 min。

（5）离心弃上清，保留沉淀。

（6）用75% 乙醇清洗沉淀2次，离心弃上清。

（7）吹干沉淀，DEPC水溶解，-80 ℃保存。RNA测序由上海元莘生物医药科技有限公司完成。

1.5 RNA-seq数据质控及分析

首先，用FastQC（Version 0.11.5）软件对下机数据进行质量检测，判断RNA-seq数据质量是否合格；然后，用Trimmomatic（Version 0.33）软件按照默认参数对RNA-seq数据进行过滤，使用hisat2（Version 2.1.0）软件将过滤后的数据比对到猪参考基因组（Sscrofa11.1），利用samtools将sam文件转换为bam文件并排序；最后，利用stringtie（Version 2.0）软件进行转录本组装，并合并成为一个新的注释文件。

1.6 新lncRNAs的鉴定及特征分析

按照如下参数对注释文件进行lncRNAs的鉴定，从而获得卫星细胞中的新lncRNAs。提取长度大于200 bp及至少在一个样本中FPKM大于0.5的转录本；提取与注释外显子无交集且距离单外显子转录本大于2 kb的转录本；筛选编码潜力小于0的转录本。然后，对新鉴定的lncRNAs、已注释的lncRNAs及蛋白编码基因的转录本长度、表达水平、编码潜力进行分析和比较，将得到的结果用R软件绘制分布图。

1.7 差异表达分析

使用DESeq2包，对筛选的lncRNAs、基因组注释基因进行差异表达分析，以padj<0.05、abs（log2FoldChange）≥1为筛选条件筛选差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）。

1.8 加权基因共表达网络分析和基因模块的功能注释

使用加权基因共表达网络分析对差异表达基因进行共表达网络分析，将差异基因聚集到基因模块中。挑选感兴趣的基因模块，进行生物学功能注释并绘制富集分析结果气泡图。

2 结果

2.1 猪骨骼肌卫星细胞的分离鉴定

将体外分离的骨骼肌卫星细胞贴壁纯化后接种于48孔板，增殖48 h后用猪骨骼肌卫星细胞的标志基因Pax7进行细胞免疫荧光标记，对猪骨骼肌卫星细胞的纯度进行检测。结果表明，分离的猪骨骼肌卫星细胞中95%以上为Pax7⁺ 阳性细胞，表明贴壁后猪骨骼肌卫星细胞纯度较高（图1）。猪骨骼肌卫星细胞在增殖培养基中培养至密度90%左右，更换为分化培养基，体外诱导分化48 h，用肌球蛋白重链基因MyHC（骨骼肌卫星细胞分化末期特异性表达的基因）特异性抗体进行免疫荧光染色，结果显示卫星细胞呈较明显的肌源性分化特征，说明分离纯化的卫星细胞有较好的分化潜能（图1）。

2.2 RNA-seq数据质控

对RNA-seq测序数据进行质量检测，结果表明，RNA-seq数据质量值均在30以上，且GC含量与理论值相近（图2a—d），表明RNA-seq数据合格。主成分分析结果表明，3个时期的测序结果分别聚在一起，表明测序数据的重复性较高（图2e、2f）。上述结果表明RNA-seq数据可靠，可以用于后续分析。

2.3 lncRNAs鉴定及特征分析

对转录组数据进行过滤、比对、组装和再组装，对组装转录本进行lncRNAs鉴定，共筛选到1465个新鉴定的lncRNAs。然后对新鉴定lncRNAs、已注释lncRNAs和编码基因进行特征分析，结果表明，相比于编码基因，新鉴定lncRNAs和已注释lncRNAs具有相似的特征，新鉴定的lncRNAs表达水平较低、转录本长度较长和编码潜力较低（图3），表明新鉴定的lncRNAs可靠，可用于进一步分析。

2.4 差异表达分析

为了筛选差异表达基因，对分化不同时期的细胞RNA-seq数据进行差异表达分析。首先，对分化48 h和分化0 h数据进行差异分析，发现3179和3480个基因分别上调和下调（图4a）。对分化48 h和分化60 h差异分析共鉴定出1228个上调和2024个下调基因（图4b）。对分化60 h和分化0 h的数据进行差异分析，发现1980和1533个基因分别上调和下调（图4c）。对所有样本数据进行差异分析，共筛选到3849个基因在3种不同分化时期骨骼肌细胞中表达有差异，其中292个lncRNAs在猪骨骼肌卫星细胞分化过程中差异表达（图4d）。

2.5 加权基因共表达网络分析

对上一步获得的3849个差异表达基因，进行加权基因共表达网络分析，样本聚类结果不存在明显的异常值（图5a）。无尺度拓扑最适指数结果图表明，软阈值即β取值为4时，随β取值的增加，无尺度拟合曲线不再改变（图5b）。无标度拓扑图展示了无尺度网络的连通性有幂律分布，因此无尺度拓扑结果图呈线性（图5c）。基因聚类树状图下面部分展示了12种颜色基因模块（图5d）。加权基因共表达网络热图展示了所有基因之间的拓扑重叠矩阵，矩阵的行和列都是基因，亮点越亮表示每个基因与其他基因的相关性越强（图5e）。

2.6 基因模块的功能注释

选择蓝色基因模块的基因在DAVID中做生物学功能注释，显著富集的GO生物过程中p-value值最小的是轴突引导（图6a上），显著富集的GO细胞组分中p-value值最小的是细胞质（图6a中），显著富集的GO分子生物学功能中p-value值最小的是蛋白质同源二聚化活性（图6a下），显著富集的KEGG通路中p-value值最小的是致心律失常性右室心肌病（图6b）。

2.7 候选lncRNAs功能预测

用筛选出的292个DE_lncRNAs在其上下游2 kb范围内，寻找其可能作用的靶基因及其转录本，将得到的靶基因转录本与黑色基因模块的mRNA比对，发现3个lncRNAs（MSTRG.13015、MSTRG.7609和MSTRG.18703）可能与骨骼肌卫星细胞分化相关。MSTRG.13015在分化0、48 h时表达量不高，在分化60 h时表达量升高（图6c）。MSTRG.7609在分化0、48 h时表达量相对较高，分化60 h时表达量降低（图6d）。MSTRG.18703相对前两个lncRNAs表达量较高，且随着分化时间增长表达量不断升高（图6e）。此外，3个候选lncRNAs可能分别调控其靶基因HSD17B7、ATG16L1、ABCG2，进而调控猪骨骼肌分化过程（图6f）。

3 讨论

lncRNAs具有物种间保守性差、表达丰度低、发育阶段和组织特异性等特点。因此，不同物种中lncRNAs调控存在较大差异^［10］。在猪骨骼肌卫星细胞分化发育过程中，lncRNAs差异表达情况尚不清楚，因此深入筛选并鉴定猪骨骼肌卫星细胞不同分化时期关键lncRNAs并分析其调控功能，显得尤为重要。

通过分析新鉴定的lncRNAs、已注释的lncRNAs和蛋白质编码基因的特征，发现相比于蛋白编码基因，lncRNAs具有较短的转录本长度、较低的表达水平和较低的编码潜力，上述结果符合lncRNAs的特征^［11］。此外，对筛选到的292个差异DE lncRNAs和3557个DE mRNA进行了基因共表达网络分析和功能注释，分析其调控功能。

最后筛选并鉴定了3个候选lncRNAs（MSTRG.13015、MSTRG.7609、MSTRG.18703），其作用的靶基因均在猪骨骼肌卫星细胞分化发育过程中发挥了重要的调控作用。MSTRG.13015的靶基因HSD17B7敲除后，小鼠心肌发育严重受阻^［12］。MSTRG.18703的靶基因ABCG2在骨骼肌再生过程中必不可少^［13］。同样地，MSTRG.7609的靶基因ATG16L1可以通过自噬调控骨骼肌再生^［14］。此外，MSTRG.7609还可能作用于另一靶基因SAG，进而调控猪骨骼肌卫星细胞分化进程。据报道，SAG是锌环指蛋白编码基因，在人类骨骼肌、心肌组织中高表达，可以作为E3泛素连接酶的重要组成部分，在细胞周期调控中发挥重要作用^［15-17］。尽管已有研究证明候选lncRNAs靶基因在骨骼肌分化调控过程中具有重要调控功能，但后期还需要对这3个关键lncRNAs进行进一步的实验验证，以明确候选lncRNAs、靶基因及相关转录因子和信号通路在猪骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用及分子调控机制，期望为猪遗传改良研究提供新的理论和实验证据。

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基金资助

国家自然科学基金青年项目(32202654)

河南省自然科学基金项目(212300410230)

信阳师范学院高层次人才科研启动基金项目(18155)