FgFabD基因对禾谷镰孢菌生长、发育和致病的影响

The effect of FgFabD gene on the growth， development and infection of fusarium graminearum

摘要

丙二酰辅酶A-酰基载体蛋白转酰酶 （malonyl-CoA：ACP transacetylase， FabD） 催化丙二酰辅酶A生成丙二酰ACP，为脂肪酸合成中的第二步反应，对禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）生长具有重要作用。为揭示FgFabD的生物学功能，以禾谷镰孢菌野生型菌株PH-1为材料，采用同源重组技术，构建FgFabD基因缺失突变体ΔFgFabD和回补菌株ΔFgFabD-C，在不同培养条件下，检测PH-1、ΔFgFabD和ΔFgFabD-C的生长状况，探究基因缺失对禾谷镰孢菌生长、发育、致病和产毒的影响。结果显示，FgFabD基因缺失对禾谷镰孢菌的菌落形态和菌丝生长没有影响；但在0.7 mol/L NaCl、0.03% H₂O₂、0.01% SDS和 300 μg/mL Congo-Red胁迫条件下，突变体ΔFgFabD菌丝直径显著低于野生菌PH-1，表明FgFabD基因在细胞壁和细胞膜的形成中具有重要作用；此外，FgFabD基因缺失后，禾谷镰孢菌分生孢子产量显著低于野生菌，且突变体在小麦胚芽鞘和麦穗上的致病力也显著低于野生型菌株。产毒实验证明，突变体DON毒素产量显著低于野生型菌株，表明FgFabD的缺失，对禾谷镰孢菌的无性生殖、致病和产毒具有重要影响。

Abstract

Malonyl-CoA-ACP transacetylase （FabD） catalyzes the conversion of malonyl-CoA to malonyl-ACP， the second step in the fatty acid synthesis pathway， playing a crucial role in the growth of Fusarium graminearum. To reveal the biological function of FgFabD， the wild type strain of Fusarium graminearum PH-1 was used. FgFabD deletion mutants （ΔFgFabD） and complementary strains （ΔFgFabD-C） were constructed by Split-Marker gene knockout technology. PH-1， ΔFgFabD and ΔFgFabD-C were individually inoculated in different cultural conditions to analyze the growth characters， and to reveal the effect of FgFabD on the growth， development， pathogenesis and mycotoxin productions. The results demonstrated that the growth rate and colony phenotype of ΔFgFabD showed no significant difference to wild strain PH-1 in regular medium. In the stress selection medium containing 0.7 mol/L NaCl， 0.03% H₂O₂， 0.01% SDS and 300 μg/mL Congo-Red， the growth of ΔFgFabD mutant was significantly lower than wild-type strain PH-1. The evidence demonstrated that FgFabD gene played important roles in the formation of cell membrane and cell wall. The conidia production of fusarium graminearum was significantly reduced compared to wild strain PH-1. Inoculation experiments showed that the pathogenicity of the mutant on wheat coleoptiles and wheat heads was significantly lower than that of the wild-type strain. Rice medium inoculation tests further demonstrated that the DON produced by ΔFgFabD was significantly lower than that produced by wild strain. These results demonstrated that FgFabD played key roles in the asexual reproduction， pathogenicity and DON biosynthesis of F. graminearum.

Graphical abstract

关键词

禾谷镰孢菌 / 小麦赤霉病 / FgFabD基因 / 基因敲除 / 致病性

Key words

Fusarium graminearum / fusarium head blight / FgFabD gene / gene knockout / pathogenicity

0 引言

禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）是一种腐生性的植物病原真菌，可侵染小麦、玉米、大麦、水稻和燕麦等多种作物，造成严重的经济损失，该病原菌被《Molecular Plant Pathology》杂志认定为世界范围内的十大重要真菌病害之一^［1］。由禾谷镰孢菌侵染引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是一种毁灭性的真菌病害，对粮食生产和食品安全危害严重^［2］。在我国，赤霉病主要集中在长江中下游地区，但随气候变暖，呈现出向北蔓延的趋势^［3］。病原菌侵染过程中还产生多种真菌毒素，易引发神经毒性、肝毒性、肾毒性、生殖和发育毒性等危害，对人类健康造成严重损伤^［4‑5］。

目前，针对小麦赤霉病的防治主要依靠化学防治，长期使用易造成病原菌耐药性增强，并引发环境污染。此外，化学药剂的不合理使用，易诱发真菌毒素积累，在一定程度上威胁粮食的安全生产^［6］。因此，开发新型安全低毒的杀菌剂，对赤霉病的防控具有重要意义。

病原菌的侵染和致病是非常复杂的生物学过程，受到众多基因的调控，许多基因已被证明对禾谷镰孢菌的侵染和致病具有重要作用。因此，关键基因的编码蛋白被视为赤霉病防控的潜在靶点，用于抑菌剂的研发^［7‑8］。开展基因功能研究，揭示关键基因在禾谷镰孢菌生长、发育和致病过程中的重要作用，有助于筛选新型抑菌靶点，为新型抑菌剂的研发提供参考。

脂肪酸合成是生命体不可缺少的基础代谢途径，在细胞的生长和代谢过程中起着核心作用，对于磷脂合成、细胞膜组装、信号转导、能量储备和基因表达调控必不可少^［9］。在真菌中，脂肪酸被用来合成甘油磷脂或脂滴，为真菌细胞膜的形成、孢子萌发和渗透提供膨胀压力^{［10‑11］}，同时，脂肪酸的合成对部分真菌的致病和产毒具有重要影响，以近平滑假丝酵母为例，脂肪酸可调控其致病性和毒素的合成。在黄曲霉中，黄曲霉毒素的生物合成、转运和分泌等，与脂肪酸的合成密不可分^［12］。禾谷镰孢菌中，脂肪酸的合成是由脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase， FAS）催化的。该酶由6个酶活性中心和1个酰基载体蛋白（Acetyl carrier protein， ACP）组成，前期研究表明，氧酰基载体蛋白还原酶参与脂肪酸的生物合成，缺失后导致禾谷镰孢菌抗逆性降低，分生孢子产量和致病力显著降低，在一定程度上反映了脂肪酸合成对禾谷镰孢菌生长、发育和致病的影响。

FgFabD编码丙二酰辅酶A-ACP转酰酶，催化丙二酰-CoA生成丙二酰-ACP，在真菌脂肪酸合成过程中具有重要作用。例如，弓形虫中FabD基因缺失后，虫体生长减慢，但入侵、逸出和急性毒力不受影响^［13］。然而，在病原真菌中FabD基因的功能尚未被研究揭示。

为揭示该基因对植物病原真菌的生物学功能，本研究以禾谷镰孢菌野生型菌株为研究对象，构建FgFabD基因缺失突变体及其互补菌株，分析突变体在表型、显微结构、压力培养、无性生殖、有性生殖和致病力等方面与野生型菌株的差异，探究FgFabD基因在禾谷镰孢菌生长、发育和致病过程中的重要作用，为抑菌剂新型靶点的筛选和小麦赤霉病的防治提供策略依据。

1 材料与方法

2020年6月—2023年5月，在信阳师范大学生命科学学院应用与环境微生物学实验室完成实验。

1.1 材料

禾谷镰孢菌野生型菌株PH-1 （NRRL 31084），ΔFgFabD（FGSG-13675）突变体，ΔFgFabD-C回复突变体，大肠杆菌菌株DH10B。含有潮霉素抗性基因hph的pCB1003质粒，本实验室保存。

试剂、酶及培养基KOD-plus高保真DNA聚合酶、dNTPs、KOD-Plus-buffer均购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；崩溃酶（Driselase）、溶壁酶（Lysingenzyme）均购自Sigma公司；2×TaqMix购自宝生物工程（大连）有限公司；KpnⅠ限制性内切酶、HindⅢ限制性内切酶均购自赛默飞世尔科技。

PDA培养基（土豆200 g煮沸20 min，双层纱布过滤收集滤液，葡萄糖20 g、琼脂15 g，ddH₂O定容至1 L）用于真菌培养；CM培养基（葡萄糖3 g、蛋白胨0.60 g、酵母提取物0.30 g、酸水解酪蛋白0.30 g、硝酸钠1.80 g、氯化钾0.15 g、无水硫酸镁0.15 g、磷酸二氢钾0.45 g、琼脂4.5 g，ddH₂O定容至300 mL）用于禾谷镰孢菌的胁迫培养实验。YEPD培养基（酵母提取物3 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、ddH₂O定容至1000 mL）和CMC培养基（羧甲基纤维素钠6 g、酵母提取物0.4 g、磷酸二氢钾0.4 g、硝酸铵0.4 g、无水硫酸镁0.1 g、ddH₂O定容至400 mL）用于禾谷镰孢菌分生孢子制备；胡萝卜培养基（胡萝卜40 g、琼脂粉4 g，ddH₂O定容至200 mL）用于有性生殖实验。

1.2 方法

1.2.1 禾谷镰孢菌FgFabD 基因缺失突变体和回

复突变体的构建

应用Split-Marker基因敲除技术和同源重组法，构建禾谷镰孢菌FgFabD基因缺失突变体。在NCBI数据库中获得禾谷镰孢菌PH‑1的FgFabD基因，以该基因编码区上游、下游1000~2000 bp核苷酸序列作为同源区，设计引物扩增上游同源片段A和下游同源片段B；将A、B和潮霉素磷酸转移酶基因hph进行重叠PCR扩增，得到重组片段。PEG介导法将重组片段转入禾谷镰孢菌原生质体。在含潮霉素培养基上筛选转化子，PCR验证转化子准确性，获得基因缺失突变体ΔFgFabD。

使用Gaprepair方法构建回补片段。限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ对pKNTG质粒进行双酶切，使pKNTG载体线性化。设计目的基因回补引物，引物5'端加上pKNTG酶切后两端的同源序列，将扩增片段与线性化pKNTG载体连接得到重组质粒，将重组质粒转化至突变体原生质体中构建互补菌株ΔFgFabD-C，PCR验证回补菌株准确性。

1.2.2 菌株在不同筛选压力下的培养性状

将PH‑1、ΔFgFabD和ΔFgFabD-C菌株分别接种到PDA培养基上培养3 d，用0.5 cm打孔器在菌丝边缘打孔，将菌丝块转接于含0.7 mol/L NaCl、0.03% H₂O₂、0.01% SDS和300 μg/mL刚果红的CM培养基上，不同压力条件下进行培养^{［14‑16］}，每个处理重复3次，25 ℃培养箱培养3 d，用十字交叉法测量菌落直径，记录菌丝形态。

1.2.3 分生孢子萌发与有性生殖

将PH-1、ΔFgFabD和ΔFgFabD-C菌株于PDA培养3 d，打孔取新鲜的菌丝块，分别转接于50 mL的CMC培养基中，震荡摇培5 d，用无菌尼龙滤布过滤收集分生孢子，计算分生孢子浓度。接种相同浓度的孢子液于50 mL的YEPD培养基中，25 ℃、175 r/min摇培处理，显微观察培养4 h孢子萌发形态。实验重复3次，每个处理统计30个孢子，计算孢子的萌发率以及萌发产生的芽管长度。

为检测突变体有性生殖情况，将活化的PH-1、ΔFgFabD和ΔFgFabD-C菌丝块接种于胡萝卜培养基上，25 ℃培养6 d；等待菌丝长满培养皿后加入1 mL 0.1%的Tween 20，用无菌药匙压倒菌丝使其融合，25 ℃黑暗处理（黑暗12 h，黑光灯12 h），培养10 d观察子囊壳的产生，解剖镜下观察子囊孢子的释放。

1.2.4 脂肪酸含量测定

制备PH-1、ΔFgFabD孢子液（1×10⁵个/mL），分别取50 μL新鲜的孢子液涂布PDA培养基，培养4 d后收集菌丝，用于脂肪酸的测定^［17］。菌丝干燥后液氮研磨，取100 mg置于玻璃瓶中，分别加入十七烷酸（10 μL，25 g/L）作为内标，加入1.5 mL溶解液（V_氯仿∶V_甲醇=2∶1），震荡处理10 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，静置分层。取1 mL上清液于新的玻璃管中，加入0.2 mL KCl（0.75%，W/V），震荡10 min静置分层，取下层液体400 μL于新的玻璃管中，加入2 mL浓硫酸和甲醇混合液（V_氯浓硫酸∶V_甲醇=5∶95），95 ℃酯化处理1.5 h。加入1 mL超纯水和1 mL正己烷，混匀后静置10 min分层。取上层液进行GC-MS/MS脂肪酸测定，每个处理重复3次，计算脂肪酸相对含量。

1.2.5 菌株的致病性和产毒性分析

选用赤霉病高感小麦品种安农8455，进行菌株致病性检测。选取大小均匀一致的小麦籽粒，用次氯酸钠进行表面消毒，于25 ℃保湿催芽3 d，待胚芽鞘长出3 cm左右，剪去胚芽鞘尖端造成斜面损伤。收集不同菌株的分生孢子，将2.5 μL分生孢子（5.0×10⁵ 个/mL）接种至胚芽鞘尖端，每个处理重复3次，在25 ℃相对湿度80%条件下光照12 h培养7 d，实验重复3次，测量小麦基部褐色病斑长度。收集分生孢子，将10 μL孢子（2×10⁵ 个/mL）接种抽穗期麦穗中部小花，套袋保湿。每个处理重复3次，接种14 d后统计发病小花数量，计算发病率（发病小花数/每穗总小花数）。

为进一步分析FgFabD基因对镰刀菌毒素合成的影响，将PH-1、ΔFgFabD菌株接种PDA培养基，培养3 d后制备新鲜的菌丝块（5 mm直径），分别取3个菌丝块接种到灭菌的大米培养基中（6 g大米籽粒，置于50 mL锥形瓶，加入2 mL蒸馏水浸泡1 h后灭菌处理），加入1 mL无菌水，25 ℃培养箱培养21 d。将发病的大米籽粒冻干并液氮研磨，称取3 g粉末加到16 mL乙腈/水（84/16，V/V），在25 ℃摇床中振荡2 h，静置后取4 mL上清液，浓缩后重溶于1 mL甲醇中，用于DON毒素检测^［18］，每个处理重复2次，取平均值用于比较突变体和野生型菌株的产毒差异。

1.2.6 FgFabD基因在禾谷镰孢菌不同培养条件

下的表达量分析

制备野生型菌株PH-1分生孢子；孢子接种到YEPD培养基培养12、24、36和48 h后收集菌丝；孢子接种胡萝卜培养基中，培养1周后压平菌丝，置于黑光灯下诱导有性生殖，收集诱导3 d、6 d的菌丝；孢子接种麦穗小花24、36和48 h；将新鲜孢子液、有性生殖菌丝、无性生殖菌丝和接种麦穗产生的菌丝，进行RNA测序，检测基因在PH-1菌株不同生长阶段的基因表达情况。

1.2.7 统计学分析

采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析，测定结果为3次重复数据的平均值，采用独立性t检验进行方差分析，计算标准差和显著性差异。

2 结果

2.1 FgFabD缺失突变体菌株的形态观察

同源重组构建禾谷镰孢菌FgFabD基因缺失突变体（ΔFgFabD）和回补菌株（ΔFgFabD-C）。接种PDA、5×YEG和CM固体培养基培养3 d后，观察表型变化，如图1所示。

在PDA培养基上，野生型菌株的菌落直径为（7.60±0.18） cm，ΔFgFabD突变体的菌落直径为（7.50±0.11） cm，ΔFgFabD‑C互补菌株的菌落直径为（7.50±0.16） cm。在5×YEG培养基上，野生型菌株的菌落直径为（5.90±0.09） cm，ΔFgFabD突变体的菌落直径为（5.80±0.16） cm，ΔFgFabD‑C互补菌株的菌落直径为（5.80±0.15） cm。

在CM培养基上，野生型菌株的菌落直径为（5.60±0.15） cm，ΔFgFabD突变体的菌落直径为（5.50±0.21） cm，ΔFgFabD‑C互补菌株的菌落直径为（5.50±0.11） cm（图1a、 b）。ΔFgFabD突变体在3种基础培养基上的生长状况与野生型菌株和ΔFgFabD‑C互补菌株没有明显差异。在1/2 CM培养基上生长36 h后，ΔFgFabD突变体的菌丝边缘及菌丝疏密程度及分支等，与野生型菌株和互补菌株没有明显差异。这表明FgFabD基因对菌丝的极性生长无影响（图1c）。

2.2 菌株在不同压力胁迫培养条件下的生长测定

将菌株分别接种到含0.7 mol/L NaCl、0.03% H₂O₂、0.01% SDS和300 μg/mL Congo-Red的CM培养基，进行胁迫培养，观察表型差异。在0.7 mol/L NaCl的筛选压力下，野生型菌株和ΔFgFabD-C菌株的菌落直径分别为（6.50±0.18）cm和（6.60±0.20） cm，ΔFgFabD突变体的菌落直径为（5.20±0.23） cm，与野生型相比，突变体菌落直径减小了20.0%（图2a、 b），表明ΔFgFabD突变体对渗透压力响应更敏感；在0.01% SDS和300 mg/L Congo‑Red的培养基上，ΔFgFabD菌落直径比野生菌减小22.9%和13.6%（图2a、 b），表明FgFabD基因与禾谷镰孢菌的细胞膜和细胞壁合成相关，该基因缺失导致细胞壁和细胞膜受损；在0.03% H₂O₂的胁迫条件下，ΔFgFabD突变体的菌落直径无明显差异。

上述结果表明，FgFabD基因与禾谷镰孢菌的渗透压响应以及细胞壁和细胞膜的合成有关，在不同压力筛选条件下，该基因表现出较好的生物活性，在胁迫条件下维持菌丝的正常生长发育，当该基因缺失后，胁迫条件下菌丝生长明显受抑制。

2.3 FgFabD 基因对分生孢子产生和萌发的影响

禾谷镰孢菌菌丝块接种CMC培养基培养5 d后，测定分生孢子浓度。野生型菌株产孢量为 4.8×10⁵ 个/mL，ΔFgFabD突变体产孢量为2.3×10⁵ 个/mL，回补菌株产孢量为 4.6×10⁵ 个/mL（图3b），与野生型菌株相比，突变体菌株的产孢量显著降低，表明FgFabD基因与禾谷镰孢菌的孢子形成相关，基因缺失导致分生孢子形成显著降低。

将收集的分生孢子分别接种到YEPD液体培养基中，观察孢子形态和萌发状况。野生型和突变体菌株的孢子呈镰刀状，有3~6个横隔，形态大小均匀一致（图3a），孢子均能正常萌发产生芽管，并进一步形成菌丝，二者无显著差异。表明FgFabD基因对禾谷镰孢菌孢子的生成具有重要作用，对孢子的形态和孢子萌发无影响。

2.4 FgFabD 基因对禾谷镰孢菌有性生殖的影响

将野生型菌株、ΔFgFabD突变体和ΔFgFabD-C互补菌株分别接种胡萝卜培养基，黑光灯诱导培养8 d后，均能产生子囊壳，且子囊壳数量分布均匀，大小匀称一致。子囊孢子都能从成熟的子囊壳中喷发，并且在子囊壳的孔口顶部形成黄色子囊孢子堆，子囊呈现不规则花瓣状结构，子囊孢子外有明显子囊壁包裹，每个子囊会释放8个子囊孢子，突变体与野生菌之间无显著差异（图4）。表明FgFabD基因不参与禾谷镰孢菌的有性生殖，该基因缺失对子囊壳的大小、数量、子囊孢子释放及子囊孢子形态等均无影响。

2.5 FgFabD 基因对禾谷镰孢菌脂肪酸合成的影响

收集野生型、突变体和互补菌株的新鲜菌丝，提取脂肪酸进行定量分析。检出3种常见的脂肪酸，分别为十六烷酸、十八烷酸和十八碳一烯酸，尤其以十八碳一烯酸的含量最为丰富，相对丰度达12%。与野生型菌株相比，突变体菌株的3种脂肪酸含量无明显差异，表明FgFabD基因的缺失，未能明显影响脂肪酸的合成。

2.6 FgFabD 基因对禾谷镰孢菌致病和产毒的影响

制备新鲜的PH-1、ΔFgFabD和ΔFgFabD-C孢子液，分别接种小麦胚芽鞘和麦穗小花，保湿培养后，观察发病情况。小麦胚芽鞘接种试验发现，野生型菌株PH-1侵染后发病迅速，病斑长度为（2.90±0.22） cm，ΔFgFabD突变体发病较轻，病斑长度为（0.90±0.25） cm，发病程度显著低于野生型菌株（图5a、b）。

成株期麦穗接种结果显示，ΔFgFabD突变体的发病率显著低于野生型菌株和互补菌株（图5c、d），野生型菌株侵染后，小花发病率为80%；突变体菌株接种后，小花发病率为23%，显著低于野生型菌株。小麦接种结果表明，FgFabD基因缺失后，禾谷镰孢菌对苗期和花期小麦的致病力均显著降低，表明FgFabD基因在禾谷镰孢菌侵染和致病中具有重要作用。

将野生菌和突变体菌株菌丝块接种到大米培养基上，测定DON毒素含量。结果显示，接种野生型菌株的大米培养基中，DON毒素含量为667.70 ng/g；接种突变体菌株培养基中，DON毒素含量为146.43 ng/g，毒素含量显著低于野生型菌株，表明该基因缺失后显著降低了DON毒素的合成。

2.7 FgFabD 基因表达分析

为了解FgFabD基因在不同阶段的表达情况，查阅了合作课题组已完成的转录组测序数据^{［19‑20］}，分析了FgFabD基因在禾谷镰孢菌不同生长阶段的表达情况。在培养基培养条件下，孢子中该基因的表达量（TPM）高达135.82，孢子萌发成菌丝培养12 h后，基因表达量显著降低至25.72，在菌丝生长阶段（24~48 h），该基因的表达量始终维持在较低水平。当孢子接种小麦麦穗24 h后，FgFabD基因表达量为48.81。随时间延长，表达量呈现降低趋势，在72 h时TPM值降为31.12（图6）。上述结果表明，在禾谷镰孢菌孢子生长阶段，该基因具有重要功能，活体接种小麦的表达量显著高于培养基菌丝的表达量，表明在侵染初期，FgFabD的表达受到诱导作用，表达量较高。

随发病时间延长，表达量逐渐降低，FgFabD在禾谷镰孢菌的侵染过程中具有重要作用，因此，当FgFabD基因缺失后，突变体的致病力显著降低。

3 讨论

3.1 FgFabD基因在禾谷镰孢菌响应胁迫环境压

力方面发挥着重要作用

禾谷镰孢菌中FgFabD编码蛋白催化丙二酰‑CoA生成丙二酰-ACP，在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。当FgFabD基因缺失后，禾谷镰孢菌在常规培养条件下，无明显表型变化。禾谷镰孢菌中FgFabD蛋白存在同工酶FAS1，FAS1有2个同源基因分别为FgFAS1和FGSG_05322。课题组对上述基因进行了基因敲除和表型分析，FgFAS1缺失后，禾谷镰孢菌在常规培养基和压力筛选条件下，菌丝生长稍弱于野生型菌株，而FGSG_05322为致死基因，缺失后禾谷镰孢菌死亡。由上可知，上述3个基因均参与脂肪酸生物合成，催化丙二酰-CoA生成丙二酰-ACP，但每个基因发挥的作用不同，FGSG_05322为主效基因，起主要催化作用，该基因缺失后导致病原菌死亡；FgFAS1为微效基因，对菌的生长发育作用相对较弱，该基因缺失后，在基础培养基上呈现出长势变弱；FgFabD功能最弱，在基础培养基培养过程中，无明显作用。

当转移至0.7 mol/L NaCl、0.01% SDS或300 mg/L Congo‑Red等压力筛选条件下，ΔFgFabD突变体菌株的生长受到明显抑制，菌丝生长显著弱于野生型菌株。SDS为阴离子表面活性剂，能抑制蛋白质活性，干扰细胞膜的生物合成。压力筛选条件下，FgFabD缺失突变体对SDS的响应更为敏感，细胞膜合成受到干扰，造成菌丝生长缓慢。此外，NaCl能影响细胞膜的渗透压，细胞膜受损的同时，突变体菌株在0.7 mol/L NaCl存在的条件下，菌丝生长也显著降低；Congo‑Red为几丁质合成抑制剂，而几丁质为真菌细胞壁的主要成分，其生物合成必须依赖细胞膜上的载体和蛋白^{［21‑24］}，当细胞膜受损时，细胞壁的生成受到影响。因此，突变体菌株的生长速率显著降低。

综上所述，在压力胁迫条件下，禾谷镰孢菌的生长受到限制，FgFabD基因发挥更为明显的作用，当该基因缺失后，一定程度上影响细胞膜的合成，而细胞膜上有众多蛋白，参与细胞壁合成、氧胁迫及渗透压胁迫耐受，进而导致细胞壁的生物合成受阻，对渗透压更加敏感，故在胁迫条件下突变体菌株表现出显著生长差异。

3.2 FgFabD 基因对禾谷镰孢菌的侵染和致病作用

禾谷镰孢菌通过无性繁殖产生大量的分生孢子，对其田间侵染和爆发具有重要作用。FgFabD基因缺失后，禾谷镰孢菌无性繁殖产生的分生孢子量显著低于野生型菌株，而FgFabD基因回补后菌株的产孢量恢复到与野生型一致，表明FgFabD对禾谷镰孢菌的无性繁殖过程分生孢子的产生具有重要作用。进一步实验证明，该基因缺失后，对禾谷镰孢菌的有性生殖、子囊壳的形成以及子囊孢子的产生，无明显作用。

基因表达结果同样表明，在有性生殖阶段，FgFabD基因的表达量维持在较低水平（TPM=37.00~50.00），无性生殖的分生孢子阶段表达量最高为135.82，菌丝生长阶段又再次恢复到低表达水平（48.81~31.12），孢子接种到小麦麦穗后，FgFabD基因的表达量逐渐升高，表明FgFabD基因在禾谷镰孢菌无性生殖过程中具有重要作用，但对孢子萌发、有性生殖无影响。

小麦苗期胚芽鞘接种和穗期小花接种实验显示，FgFabD基因的表达量显著高于固体培养基上的表达量，表明该基因在禾谷镰孢菌致病过程中具有重要作用，且突变体致病力显著低于野生型菌株。进一步的毒素测定显示，突变体菌株产生的DON毒素远远少于野生型菌株，表明FgFabD基因参与调控禾谷镰孢菌的侵染和产毒。该基因缺失后，病原菌的致病力与产毒力均显著降低。

前期研究结果表明，以脂肪酸为基础形成的脂类物质，对病原真菌的发育和致病具有重要作用^［25］。本研究中FgFabD基因参与脂肪酸的生物合成，当基因缺失后，常规培养条件下，3种常见的脂肪酸含量没有显著变化，但胁迫培养和活体接种实验中，禾谷镰孢菌突变体的菌株生长和致病力均显著降低，进一步表明FgFabD的功能可能受到逆境胁迫（植物抗性）诱导，对禾谷镰孢菌的侵染、致病和产毒具有重要作用。

4 结束语

FgFabD参与脂肪酸的生物合成，对菌丝细胞膜的形成具有重要作用。基因的缺失可能影响禾谷镰孢菌细胞壁和细胞膜的完整性，使细胞渗透压的敏感性增强，对小麦胚芽鞘、小麦穗、玉米须和玉米秆的致病性减弱。综上，FgFabD对禾谷镰孢菌的生长、发育和致病具有重要影响，可作为潜在的赤霉病防控靶点，用于新型抑菌剂的研发。后续研究工作中，将进一步分析逆境胁迫和生物胁迫下FgFabD的生物学功能，探究其具体分子机制。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31701740)

河南省科技攻关项目(252102111095)

河南省科技攻关项目(252102110140)

国家级大学生创新创业训练计划(202310477037)

信阳师范大学南湖学者奖励计划