牛病毒性腹泻病毒E2蛋白真核表达外分泌信号肽的筛选

Screening of signal peptides for the secretory expression of bovine viral diarrhea virus E2 protein in eukaryotic systems

摘要

为优化BVDV E2蛋白在真核细胞中的分泌表达效率，构建了8种携带不同信号肽的BVDV E2重组表达质粒，瞬时转染293T细胞，利用Western blot检测E2蛋白表达，通过比较细胞培养上清与细胞裂解液中E2蛋白水平，评估其分泌表达效率并筛选最优信号肽。基于筛选结果，扩大培养并浓缩表达产物，通过检测E2蛋白保护MDBK细胞抵御BVDV感染的效果，评价其生物学活性。结果显示，含流感病毒血凝素（Influenza Hemagglutinin）信号肽的重组质粒分泌表达E2蛋白的效率最高，分泌表达的E2蛋白能保护MDBK细胞抵御BVDV感染，且呈现浓度依赖性，表明所获E2蛋白具有良好的生物学活性。研究结果为优化BVDV E2蛋白的真核分泌表达体系、深入探究BVDV E2蛋白功能及亚单位疫苗的研发提供了实验基础与理论依据。

Abstract

To optimize the secretory expression efficiency of the BVDV（Bovine Viral Diarrhea Virus） E2 protein in eukaryotic cells， eight recombinant expression plasmids carrying different signal peptides were constructed and transiently transfected into 293T cells. E2 protein expression was detected by Western blot， and its secretory expression efficiency was evaluated by comparing E2 protein levels in the cell culture supernatant and cell lysate， through which the optimal signal peptide was screened. Based on the screening results， the expression was scaled up and the protein was concentrated， and the biological activity of the expressed E2 protein was assessed by examining its protective effect on MDBK cells against BVDV infection. The results showed that the recombinant plasmid containing the Influenza Hemagglutinin signal peptide achieved the highest secretory expression efficiency of E2 protein. The secreted E2 protein was able to protect MDBK cells from BVDV infection in a concentration‑dependent manner， indicating that the obtained E2 protein possessed favorable biological activity. An experimental and theoretical basis were provided for optimizing the eukaryotic secretory expression system of the BVDV E2 protein， as well as for further investigation of its function and the development of subunit vaccines.

Graphical abstract

关键词

牛病毒性腹泻病毒 / E2蛋白 / 信号肽 / 真核表达 / 生物学活性

Key words

Bovine Viral Diarrhea Virus（BVDV） / E2 protein / signal peptide / eukaryotic expression / biological activity

0 引言

牛病毒性腹泻（Bovine Viral Diarrhea，BVD）被世界动物卫生组织（WOAH）归为三类疫病，是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一种持续性感染性接触性传染病^［1］。妊娠母牛感染BVDV可导致流产、死胎或畸形胎，并引起胎牛免疫抑制和持续感染^［2］。牛感染该病后多呈隐性感染，且易继发其他病原感染；该病呈全球性分布，给养牛业造成了重大的经济损失，严重制约着养牛业的健康发展^［3］。根据抗原性差异，BVDV可分为3种基因型：BVDV‑1、BVDV‑2和BVDV‑3。目前，BVDV‑1可进一步分为21个亚型（1a—1u），BVDV‑2和BVDV‑3各分为4个亚型（2a—2d和3a—3d） ^［4］。BVDV基因组为单股正链RNA，全长约 12.3 kb，含有一个开放阅读框 （ORF），两侧分别为5’和3’非翻译区（UTR）。ORF编码一个多聚蛋白，经共翻译及翻译后加工，被宿主和病毒蛋白酶依序切割为4种结构蛋白（衣壳蛋白C、包膜糖蛋白Erns、E1 和 E2），以及8种非结构蛋白（Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B ^［5］）。

E2蛋白是病毒粒子表面含量最丰富的囊膜蛋白，相对分子质量约为53~55 kDa，在病毒入侵宿主细胞时参与受体的识别与吸附、介导膜融合以及诱导宿主免疫应答，是诱导机体产生中和抗体的主要靶抗原。然而，E2基因易发生变异，是BVDV基因分型的重要靶标^［6］。糖基化修饰作为E2蛋白最关键的翻译后修饰方式，在病毒吸附、免疫逃逸和抗原性维持中发挥重要作用^［7］。研究表明，BVDV E2蛋白的糖基化以N‑连接糖基化为主，不同表达系统会影响E2蛋白的糖基化模式，而哺乳动物细胞表达系统能实现更为复杂的糖基化修饰^［8］。因此，高效表达具有生物学活性的E2蛋白对于深入研究BVDV的入侵机制、免疫反应及疫苗开发具有重要意义。

原核表达系统表达E2蛋白时，蛋白易形成无活性的包涵体，需经过变性、复性步骤才能恢复生物学活性；若通过优化表达条件（如降低诱导温度）实现可溶性表达，虽可避免复性损耗，但此类蛋白仍缺乏真核翻译后修饰（如磷酸化），且存在内毒素污染风险^［9］。而哺乳动物细胞表达系统可为重组蛋白提供近似天然宿主的翻译后修饰环境，特别是在糖基化方面，从而确保重组蛋白的结构完整性与功能稳定性^［10］。已有研究表明，通过筛选能高效引导目的蛋白质分泌表达且适用范围广的信号肽，可有效提高外源蛋白的表达水平^［11］。基于此，本研究合成了8种不同信号肽，分别介导BVDV E2蛋白在293T细胞中的分泌表达，系统比较了各信号肽对BVDV E2蛋白表达水平和分泌效率的影响，从中筛选出具有高效外分泌能力的信号肽。随后，在293T细胞中扩大培养并利用超滤浓缩表达上清液，进一步检测所获E2蛋白对BVDV感染MDBK细胞的保护作用，为BVDV亚单位疫苗研发、病毒致病机制研究和免疫学检测试剂的研发提供理论依据和实验材料。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

293T细胞、MDBK细胞及pcDNA3.1质粒由本实验室保存；E2蛋白表达质粒（PCAGGS‐E2‐flag）由本实验室构建；限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ、KpnⅠ均购自NEB公司；无缝克隆试剂盒（ClonExpress^® MultiS One Step Cloning Kit ）及高保真DNA聚合酶（Phanta^® Max Super‑Fidelity DNA Polymerase）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；2×Taq PCR StarMix（Dye）购自北京GenStar公司；Lipo293^TM Plus转染试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清（FBS）购自Clark Bioscience公司；HRP标记的兔抗Flag抗体、Anti‑Flag Tag Rabbit Ab、鼠源抗β‑actin抗体、超敏ECL化学发光试剂盒均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；去内毒素质粒提取试剂盒（E.Z.N.A. ® Endo‑free Plasmid Mini Kit）购自美国Omega公司；StarPrep DNA纯化/胶回收试剂盒（StarPrep DNA Gel Extraction Kit）购自北京GenStar公司；总RNA快速抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；Magneti‐Q DYKDDDDK标签蛋白纯化试剂盒，购自常州伯仪生物科技有限公司。

1.2 BVDV E2蛋白生物信息学分析

利用 NetNGlyc 1.0在线工具预测BVDV E2蛋白的N‑糖基化位点；借助跨膜区预测工具（https：//www.detaibio.com/tools/transmembrane.html）分析BVDV E2蛋白的跨膜结构域，为分泌表达策略提供依据；应用SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）预测BVDV E2蛋白自身的信号肽序列。

1.3 引物设计与合成

选取8种在真核表达系统中常用的信号肽序列，包括高斯萤光素酶（Gaussia Luciferase，GLuc）、小鼠免疫球蛋白G2a亚型（Mouse Immunoglobulin G2a Isotype，MIgG2a）、流感血凝素（Influenza Hemagglutinin）、组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）等。为便于克隆，合成信号肽序列时，在其5’端添加与pcDNA3.1载体匹配的同源臂，3’端添加与E2序列匹配的同源臂，并在片段两端引入EcoRⅠ酶切位点。所有合成序列委托北京擎科生物科技股份有限公司完成。同时，以表达质粒PCAGGS‑E2‑Flag为模板，设计扩增E2‑Flag片段的引物对pcDNA3.1‑E2‑Flag‑F/R；针对信号肽两端同源臂，设计通用引物对F1/R1。引物序列由北京擎科生物科技股份有限公司合成（表1）。

1.4 真核表达载体的构建与鉴定

使用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切pcDNA3.1载体，回收约5 400 bp的载体片段；以合成的各信号肽序列为模板，用引物F1/R1扩增获得约120 bp的信号肽片段；以PCAGGS‑E2‑flag质粒为模板，用引物pcDNA3.1‑E2‐Flag‑F/R扩增获得约1 100 bp的E2‑Flag目的片段。上述PCR产物及酶切产物均经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取目的条带后使用胶回收试剂盒纯化回收。PCR扩增体系为50 μL：2×Phanta Mix Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，PhantaMaxSuper‐Fidelity DNA Polymerase 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，以ddH₂O补足至50 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，63 ℃退火45 s，72 ℃延伸（信号肽片段10 s、E2‑Flag片段1 min 30 s），33个循环；最后72 ℃总延伸5 min。

将胶回收后的信号肽片段、E2‑Flag片段与线性化的pcDNA3.1载体通过同源重组法进行连接。将连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送北京擎科生物科技股份有限公司测序验证。将测序正确的重组质粒分别命名为pcDNA3.1‑E2/sp1—pcDNA3.1‐E2/sp8，使用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，用于后续实验。

1.5 瞬时转染293T细胞

将293T细胞接种于六孔板中，待细胞汇合度达80%~90%时进行转染，每孔转染1 μg的质粒。分别配置DNA稀释液（125 μL无血清DMEM和2.5 μg质粒）和转染试剂稀释液（125 μL无血清DMEM与5 μL Lipo293^TM Plus），将转染试剂稀释液加入DNA稀释液中，室温孵育10~20 min。将混合物逐滴加入293T细胞培养孔中，于37 ℃、2% CO₂条件下培养4~6 h后，更换为新鲜无血清DMEM培养基，继续培养至48 h，分别收集培养上清和细胞沉淀用于后续分析。

1.6 BVDV E2蛋白的表达与鉴定

分别收集pcDNA3.1‑E2/sp1—pcDNA3.1‑E2/sp8及pcDNA3.1转染48 h的293T细胞培养上清与细胞沉淀，用于Western blot检测。细胞沉淀用PBS洗涤2次，加入100 μL的NP‑40裂解液，冰上裂解30 min，取80 μL作为细胞样；另取80 μL培养上清作为上清样品。按照4∶1比例加入20 μL的5×SDS蛋白上样缓冲液，98 ℃变性8 min。样品分别取样，用10%的分离胶进行Western Blot检测。采用兔源抗Flag标签抗体（1∶1000稀释）和鼠源抗β‐actin抗体（1∶1000稀释）为一抗，进行过夜孵育；以HRP标记的羊抗兔IgG（1∶3000稀释）为二抗进行ECL显影并曝光。采用ImageJ 2x软件对Western Blot条带的灰度值进行分析。

1.7 BVDV E2蛋白生物学活性检测

使用10 cm培养皿扩大培养293T细胞，待细胞汇合度达80%~90%时进行转染，每个培养皿转染重组质粒15 μg，同时以pcDNA3.1空载体作为对照。转染48 h后收集培养上清，用10 kDa规格的超滤管于4 ℃、4000 r/min离心浓缩，将40 mL的培养上清样浓缩至4 mL。浓缩液经0.22 μm滤膜过滤后，与漂洗好的磁珠混合，4 ℃孵育60 min；用1×PBST洗涤磁珠5次，以Elution Buffer C洗脱3次，收集蛋白样品，进行10%的分离胶及Western Blot检测。

为检测表达产物的生物学活性，将过滤浓缩的上清蛋白样品以100%、50%、25%梯度稀释，分别加入已接种好MDBK细胞的六孔板中，以pcDNA3.1空载转染所得上清为对照，并设置未经任何处理的Mock组，于4 ℃培养1 h后弃去。再将每孔接种800 μL的BVDV病毒液，于37 ℃、2% CO₂培养箱中孵育2 h。弃去病毒液，更换为新鲜的含2%血清的维持培养基，每日观察细胞病变情况，并使用倒置显微镜拍照记录。

2 结果与分析

2.1 BVDV E2蛋白生物信息学分析

对BVDV E2蛋白的信号肽、跨膜区及糖基化位点进行预测分析，结果显示该蛋白自身不携带信号肽序列；跨膜结构域位于第345~367位氨基酸，为利于蛋白可溶性表达，在扩增E2基因时对其跨膜区进行了截短；糖基化位点预测表明存在4个潜在的糖基化位点：117NTT、186NWT、230NET和298NYT（图1A—C）。

2.2 含不同信号肽序列的BVDV E2真核表达质粒的构建

分别将各信号肽片段和BVDV E2目的基因通过无缝克隆连接至pcDNA3.1载体，转化至DH5α感受态细胞，经培养筛选阳性单克隆菌落并测序验证，最终获得8个含有不同信号肽序列的重组表达质粒，命名为pcDNA3.1‑E2/sp1—pcDNA3.1‐E2/sp8（图1D）。

2.3 不同信号肽介导BVDV E2在293T细胞中上清及分泌表达效率

将8种携带不同信号肽的重组表达质粒分别转染至293T细胞，培养48 h后收集培养上清液和细胞裂解液，通过Western Blot检测BVDV E2蛋白的表达（图2A）。使用ImageJ 2x软件分析条带灰度值，以培养上清与细胞裂解液中E2蛋白的比值（S/L）评估分泌表达效率（图2B），以培养上清中E2与内参β‐actin比值（S/β‐actin）评估上清中的相对表达水平（图2C）。结果表明，pcDNA3.1‑E2/sp3质粒在上清表达水平和分泌效率方面综合表现最优，因此选择该质粒进行后续试验。

2.4 BVDV E2蛋白的生物学活性检测

经综合分析，选取含Influenza Hemagglutinin信号肽的重组质粒pcDNA3.1‑E2/sp3转染293T细胞进行扩大蛋白表达。收集培养上清，经超滤浓缩和0.22 μm滤膜过滤后，通过Western Blot在约55 kDa处检测到特异性条带，且3次洗脱产物中均可检测到目的蛋白（图3A）。

将浓缩的E2蛋白分别稀释至原液的100%、50%和25%，加入MDBK细胞培养孔中；同时设置以pcDNA3.1空载体转染上清浓缩液处理的阴性对照组和不作任何处理的Mock组。接种BVDV后，每日观察细胞状态。第4天的结果显示，阴性对照组与25%蛋白浓度梯度组细胞出现明显皱缩、碎裂及脱落等细胞病变；Mock组细胞正常生长且细胞密度有所增加，提示所表达的E2蛋白可保护MDBK细胞抵抗BVDV感染，且呈现浓度依赖性（图3B和F）。

3 讨论

目前，BVDV仍在世界范围内广泛流行，可引起感染牛的持续感染与免疫抑制。E2蛋白作为该病毒的主要抗原蛋白，是病毒粒子表面最丰富的囊膜蛋白，具有高度变异性，亦是诱导宿主免疫应答及研发亚单位疫苗的关键抗原蛋白^［12］。然而，原核表达系统在重组E2蛋白制备过程中存在明显局限性，缺乏真核生物特有的翻译后修饰，且存在内毒素污染风险。因此，采用真核表达系统进行E2蛋白的重组表达，以期获得更接近天然构象的E2蛋白，为进一步研究其免疫学功能及亚单位疫苗的开发提供可靠基础。

与胞内表达相比，蛋白的分泌表达可将目的蛋白直接释放至胞外培养基中，有效避免因胞内过度积累所致的细胞毒性，简化下游纯化流程；同时，胞外氧化环境更有利于促进目的蛋白形成具有生物活性的天然构象^［13］。信号肽是位于重组蛋白N端的一段高疏水性短肽，负责引导前体蛋白转至内质网，促进重组蛋白向细胞外高效分泌^［14］，是真核表达系统中调控蛋白定位、表达水平及产量的关键部分。研究表明，合理选用信号肽能有效提高重组蛋白分泌表达效率与正确折叠率，并维持其生物学活性^［15］。

已有研究^{［10，16-17］}证实，信号肽能有效促进目的蛋白的可溶性表达并维持其抗原活性。Wen等^［15］通过替换丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）E1/E2蛋白原有的信号肽，发现Influenza Hemagglutinin信号肽和tPA信号肽可在不改变糖基化的前提下，最大程度地提高目的蛋白的表达与分泌效率。方琪等^［18］在HEK‑293F细胞中表达猪瘟病毒（classical swine fever virus， CSFV）E0蛋白的研究表明，Insulin信号肽和IL‑2信号肽介导的蛋白分泌表达水平最高，且Influenza Hemagglutinin信号肽介导的E0蛋白亦能保持良好的糖基化修饰与抗原活性，与Wen等^［15］的结果一致。本研究中BVDV E2蛋白在真核系统中的分泌表达结果显示，Influenza Hemagglutinin信号肽能够更好地介导目的蛋白的表达，并使目的蛋白保持良好的生物学活性，进一步验证了Influenza Hemagglutinin信号肽在不同瘟病毒包膜蛋白真核分泌表达中的适用性，同时也说明信号肽与表达系统同源时，更利于目的蛋白的分泌表达^［19］。而其他信号肽介导的E2蛋白表达量较低，分析是由于信号肽与表达系统同源性不足、信号肽疏水性较强及信号肽酶切割效率低等因素有关^{［18，20］}。综上，信号肽的合理选择与优化是提高目的蛋白高效分泌表达的关键因素。

本研究选取了8种常用于分泌表达的信号肽，分别与目的基因PCAGGS‑E2‑Flag及载体pcDNA3.1进行同源重组连接，构建了8个重组质粒pcDNA3.1‑E2/sp1—pcDNA3.1‑E2/sp8。将测序正确的重组质粒瞬时转染至哺乳动物细胞293T中，进行BVDV E2蛋白的分泌表达。通过Western blot检测培养上清及细胞裂解液中的E2蛋白，利用ImageJ 2x软件分析各重组质粒介导的E2蛋白分泌表达效率和表达水平，以确定能够促进E2蛋白在293T细胞中高效分泌表达的最优信号肽序列。结果表明，GLuc‑1信号肽所介导的E2蛋白在293T中分泌表达效率及产量较高，故选取pcDNA3.1‑E2/sp3进行后续试验。为进一步验证所表达蛋白的抗原性，将培养上清经浓缩、纯化及过滤后进行梯度稀释，检测其对MDBK细胞抵抗BVDV感染的保护作用。结果显示，所获得的E2蛋白对MDBK细胞抵抗BVDV感染具有明显的保护效果，表明利用本体系表达的E2蛋白具备良好的生物学活性。

4 结束语

通过筛选不同的信号肽介导BVDV E2蛋白在哺乳动物细胞293T中的分泌表达，明确GLuc‑1信号肽表达效率最高，且所表达的E2蛋白可有效保护MDBK细胞抵抗BVDV感染，表明本研究所表达的BVDV E2蛋白具有良好的生物学活性。该研究不仅为优化外源蛋白在真核细胞中的高效分泌表达提供了有效参考，同时也为深入探究分泌性蛋白的结构与功能、BVDV E2亚单位疫苗及检测试剂的研发提供了理论依据与技术基础。

参考文献

[1] 姜海宇， 薛华平， 李家奎. 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的研究进展［J］. 养殖与饲料， 2022， 21（9）： 107-112.

[2] Wernike K， Pfaff F， Beer M. "Fading out"：Genomic epidemiology of the last persistently infected BVDV cattle in Germany［J］. Frontiers in Veterinary Science， 2024， 10： 1339248.

[3] Zhang Kang， Zhang Jingyan， Qiu Zhengying， et al. Prevalence characteristic of BVDV in some large scale dairy farms in western China［J］. Frontiers in Veterinary Science， 2022， 9： 961337.

[4] Gómez-Romero N， Arias C F， Verdugo-Rodríguez A， et al. Immune protection induced by E2 recombinant glycoprotein of bovine viral diarrhea virus in a murine model［J］. Frontiers in Veterinary Science， 2023， 10： 1168846.

[5] Yang Ningning， Zhang Jiangwei， Xu Mingguo， et al. Virus-like particles vaccines based on glycoprotein E0 and E2 of bovine viral diarrhea virus induce humoral responses［J］. Frontiers in Microbiology， 2022， 13： 1047001.

[6] 刘丹， 黄小洁， 吴华伟， 等. 牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立［J］. 动物医学进展， 2024， 45（4）： 51-56.

[7] Pande A， Carr B V， Wong S Y C， et al. The glycosylation pattern of baculovirus expressed envelope protein E2 affects its ability to prevent infection with bovine viral diarrhoea virus［J］. Virus Research， 2005， 114（1/2）： 54-62.

[8] Urbanowicz R A， Wang Ruixue， Schiel J E， et al. Antigenicity and immunogenicity of differentially glycosylated hepatitis C virus E2 envelope proteins expressed in mammalian and insect cells［J］. Journal of Virology， 2019， 93（7）： e01403-e01418.

[9] 李亚军， 茹毅， 郝荣增， 等. 牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白的中华仓鼠卵巢细胞表达及免疫原性分析［J］. 生物工程学报， 2023， 39（12）： 4861-4873.

[10] Kober L， Zehe C， Bode J. Optimized signal peptides for the development of high expressing CHO cell lines［J］. Biotechnology and Bioengineering， 2013， 110（4）： 1164-1173.

[11] 王传红， 宋旭， 刘诗雨， 等. 猪流行性腹泻病毒S蛋白外分泌信号肽筛选及稳定表达细胞系的构建［J］. 中国兽医科学， 2024， 54（7）： 873-880.

[12] Avello V， Salazar S， González E E， et al. Recombinant subunit vaccine candidate against the bovine viral diarrhea virus［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2024， 25（16）： 8734.

[13] Donofrio G， Bottarelli E， Sandro C， et al. Expression of bovine viral diarrhea virus glycoprotein E2 as a soluble secreted form in a mammalian cell line［J］. Clinical and Vaccine Immunology， 2006， 13（6）： 698-701.

[14] Schjoldager K T， Narimatsu Y， Joshi H J， et al. Global view of human protein glycosylation pathways and functions［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2020， 21（12）： 729-749.

[15] Wen Bo， Deng Yao， Guan Jie， et al. Signal peptide replacements enhance expression and secretion of hepatitis C virus envelope glycoproteins［J］. Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 2011， 43（2）： 96-102.

[16] 宋倩倩， 王文玲， 詹瑛， 等. 真核表达MERS-CoV刺突蛋白亚单位的信号肽序列优化研究［J］. 病毒学报， 2019， 35（1）： 20-26.

[17] Knappskog S， Ravneberg H， Gjerdrum C， et al. The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide［J］. Journal of Biotechnology， 2007， 128（4）： 705-715.

[18] 方琪， 罗烨， 梁彤彤， 等. 不同信号肽对猪瘟E0蛋白在HEK-293F细胞中分泌表达的影响及E0-ELISA方法的建立［J］. 中国兽医科学， 2024， 54（9）： 1195-1201.

[19] 陈龙冠， 覃锦红， 黄云娜， 等. 信号肽优化对重组抗体分泌表达的影响及研究进展［J］. 中国生物工程杂志， 2016， 36（3）： 77-81.

[20] Yang Haiquan， Ma Yingfang， Zhao Yuan， et al. Systematic engineering of transport and transcription to boost alkaline α-amylase production in Bacillus subtilis ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2020， 104（7）： 2973-2985.

基金资助

国家自然科学基金项目(32302908)

河南省科技攻关项目(242102110033)

河南省科技攻关项目(242102110052)

河南省科技攻关项目(252102111004)