赭曲霉毒素A对小鼠生长性能、氧化应激及器官蓄积的影响研究

Effects of Ochratoxin A on growth performance， oxidative stress and organ accumulation in mice

摘要

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A， OTA）是一种广泛污染谷物及其制品的重要真菌毒素，对人和动物健康构成严重威胁。已有研究虽已明确其肝肾毒性，但其对机体多器官系统的毒害作用与机制尚未完全阐明。为探究OTA的全身毒性效应，通过建立小鼠亚急性暴露模型（每日灌胃1、2、3.5 mg/kg BW OTA，持续8 d），系统评估了OTA对小鼠生长性能、血清氧化应激水平及主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）中残留分布的影响。结果表明：1） OTA暴露以剂量依赖方式显著抑制小鼠体重增长，且高剂量组肝脏脏器指数显著降低（P<0.05）；2） 中、高剂量OTA暴露可显著降低血清总超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力及总抗氧化能力（P<0.05），表明其可引发系统性氧化损伤；3） OTA在各脏器中的残留量呈器官特异性分布，其中肾脏残留量最高（高达29.4 μg/g），肺脏次之，肝脏最低，且三者均显著高于心脏与脾脏（P<0.05）。本研究证实，OTA暴露不仅损害生长性能并诱发全身性氧化应激，而且在肺脏的高蓄积现象提示肺脏可能为OTA毒理学研究的新关注靶点。上述结果为全面理解OTA的全身毒性及其机制提供了重要实验依据。

Abstract

Ochratoxin A（OTA） was identified as an important mycotoxin widely contaminating cereals and their derived products， posing a serious threat to human and animal health. Although its hepatorenal toxicity had been clarified by previous studies， its toxic effects on multiple organ systems and the underlying mechanisms were not fully elucidated. To investigate the systemic toxicity of OTA， a subacute mouse exposure model（daily intragastric administration of 1， 2， 3.5 mg/kg BW OTA for 8 days） was established， and the effects of OTA on growth performance， serum oxidative stress levels， and residue distribution in major organs（heart， liver， spleen， lung， kidney） were systematically evaluated. The results showed that：1）OTA exposure significantly inhibited mouse body weight gain in a dose‑dependent manner， and the liver organ index in the high-dose group was significantly reduced（P<0.05）；2）Medium‑dose and high‑dose OTA exposure significantly decreased serum total superoxide dismutase activity， glutathione peroxidase activity， and total antioxidant capacity （P<0.05），indicating that systemic oxidative damage was induced；3）Organ‑specific distribution of OTA residues was observed among the tested organs， with the highest residue level being detected in the kidney（up to 29.4 μg/g），followed by the lung and then the liver， and all three were significantly higher than those in the heart and spleen（P<0.05）. It was confirmed that OTA exposure not only impaired growth performance and induced systemic oxidative stress， but also the high accumulation in the lung suggested that the lung might be a new target of concern in OTA toxicology research. These findings provided important experimental evidence for a comprehensive understanding of the systemic toxicity and mechanisms of OTA.

Graphical abstract

关键词

赭曲霉毒素A / 生长性能 / 氧化应激 / 毒理学效应 / 小鼠

Key words

Ochratoxin A / growth performance / oxidative stress / toxicological effects / mice

0 引言

霉菌毒素是由曲霉、黑曲霉及某些青霉菌株产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于农产品及其制品中，因其对人类和动物健康构成严重威胁，已成为全球关注的主要食源性风险之一^［1］。在众多霉菌毒素中，赭曲霉毒素（Ochratoxin， OT）是继黄曲霉毒素（Aflatoxin， AFT）之后又一个引起广泛关注的真菌毒素。

赭曲霉毒素包含7种结构类似的化合物，其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A， OTA）毒性最强、分布最广，对农产品的污染最为严重，且与人体健康关系最为密切。OTA的分子式为 C₂₀H₁₈ClNO₆，由苯丙氨酸与异香豆素通过酰胺键结合而成，化学性质稳定，对不良环境具有很强的耐受能力^［2］。OTA已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为2B类致癌物，其污染已成为人类健康面临的主要全球食源性风险之一^［3］。研究表明，OTA及其代谢物可在多种植物源食品（如谷物、葡萄、葡萄酒、果汁和坚果等）中检出，并可在饲料加工、储存及运输过程中产生^［4］。动物摄入受污染饲料后，不仅生产性能受损，还可能导致OTA在动物组织、奶、蛋等产品中蓄积，严重威胁养殖业的健康发展。此外，OTA暴露不仅损害畜禽机体健康，还可引发人类急性肾功能衰竭、慢性间质性肾病等疾病，给人类健康构成巨大的威胁^［5］。

大量研究表明，OTA具有多种毒性，包括肝毒性、肾毒性、肠毒性、免疫毒性以及致畸、致癌、致突变等作用^［6］。其中，肾脏是OTA的主要靶器官，其毒性机制通常被认为与氧化应激密切相关^［7］。OTA侵入机体后，可调节参与活性氧（ROS）代谢的酶及相关信号通路。具体而言，OTA可通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，诱导肾小球损伤，进而产生肾小球系膜细胞毒性^［8］。一项体外细胞实验将人肾小球系膜细胞暴露于不同浓度的OTA，结果发现，随着OTA浓度升高，ERK和NF-κB的磷酸化水平显著增加，同时细胞活力明显下降，炎症因子表达上调，充分证实了该信号通路在OTA致肾损伤中的关键作用^［9］。肝脏是OTA的次级靶器官，其肝毒性机制与肾脏毒性类似，同样通过氧化应激和炎症反应诱导产生^［10］。OTA中毒期间，氧化应激会促使促炎细胞因子含量升高，同时增强炎症因子的表达^［11］。线粒体作为ROS的主要产生场所，成为氧化损伤的主要靶标。研究发现，OTA处理后的肝细胞线粒体膜电位降低，呼吸链复合物活性受到抑制，ATP合成减少，进一步加剧细胞内能量代谢紊乱和氧化应激状态，最终导致肝细胞损伤^［12］。值得注意的是，除对肝脏和肾脏的损伤外，OTA对全身多器官系统的毒理学效应尚未完全阐明，其具体机制与危害仍需深入探索。

本研究旨在通过建立小鼠模型，探究不同浓度OTA暴露对小鼠生长性能及血清氧化损伤指标的影响，并测定OTA在小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等主要脏器中的残留量，以期为评估OTA的毒性作用及其在动物体内的毒代动力学提供实验依据，为解决OTA 污染问题提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

赭曲霉毒素A标准品购自普瑞邦生物工程有限公司；总抗氧化能力（T‑AOC）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力测定试剂盒及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‑PX）活力测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 实验动物及分组

选取健康的BALB/c小鼠16只，购自郑州大学动物实验中心。各组小鼠初始体质量无显著差异（P>0.05）。适应性饲养5 d后，将小鼠随机分为4组，每组4只： ① 低剂量组，每日口服OTA 1 mg/kg BW； ②中剂量组，每日口服OTA 2 mg/kg BW；③高剂量组，每日口服OTA 3.5 mg/kg BW；④PBS组，每日口服OTA等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。实验周期8 d，每天灌胃1次（实现动物伦理编号：HAUST‑025‑M05022）。

1.3 小鼠生长性能及脏器指数的测定

实验期间每日观察小鼠的精神状态及行为变化，并记录体质量。实验结束后处死小鼠，无菌取出脏器并称质量，计算各组脏器指数：

脏器指数=\frac{\mathrm{脏器}\mathrm{质量}}{\mathrm{小鼠}\mathrm{体质}\mathrm{量}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（1）

1.4 小鼠血清抗氧化指标的检测

采用商业化试剂盒测定血清总抗氧化能力（T‑AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活力、还原型谷胱甘肽（GSH）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‑PX）活力。具体操作步骤均按照试剂盒说明书执行。

1.5 高效液相色谱法检测组织OTA残留

分别取小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织各0.05 g，加入1 mL 70%色谱级甲醇，匀浆后于-20 ℃静置2 h，再以5000 r/min离心10 min。取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，采用高效液相色谱法测定OTA含量。残留量按以下公式计算：

残留量=\frac{\mathrm{检测}\mathrm{浓度}\times \mathrm{样品}\mathrm{总体}\mathrm{积}}{\mathrm{脏器}\mathrm{质量}}。（2）

色谱条件：C18柱（5 µm，4.6 mm×150 mm）；流动相为V_乙腈∶V_水∶V_冰乙酸=48∶51∶1；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为50 µL；检测波长为激发波长333 nm、发射波长460 nm。

1.6 数据统计与分析

所有数据均使用SPSS 26.0软件进行方差分析及卡方检验，应用GraphPad Prism 8.0软件绘图。

2 结 果

2.1 不同浓度OTA暴露对小鼠生长性能的影响

不同浓度OTA暴露对小鼠生长性能的影响见表1，与PBS对照组相比，OTA处理组小鼠的平均体质量呈剂量依赖性下降趋势，其中高剂量组体质量下降最显著。各组日均采食量除高剂量组略高外，其余各组与对照组相比无明显差异。实验期间，各组小鼠均未出现死亡。

2.2 不同浓度OTA暴露对小鼠脏器系数的影响

实验结束后解剖小鼠，取各脏器称质量，按公式（1）计算脏器系数。如图1所示，不同浓度OTA暴露对小鼠的心、脾、肺、肾的脏器系数均无显著影响。然而，与PBS对照组相比，高剂量OTA组小鼠的肝脏脏器指数显著降低（P<0.05）。

2.3 不同浓度OTA暴露对小鼠血清抗氧化指标的影响

为评估不同浓度OTA暴露对小鼠抗氧化能力的影响，检测了小鼠血清中总SOD活力、总抗氧化能力、GSH‑PX活力及GSH的含量。结果如图2所示，随着OTA暴露剂量的增加，小鼠血清抗氧化指标发生显著变化。与PBS对照组相比，中、高剂量OTA组小鼠血清SOD活力和GSH‑PX活力显著降低（P<0.01），总抗氧化能力在中剂量组显著下降（P<0.05）。各OTA处理组小鼠血清GSH含量变化不显著（P>0.05）。

2.4 不同浓度OTA暴露对小鼠脏器OTA残留的测定

2.4.1 不同浓度OTA暴露对小鼠心脏中OTA残留的测定

解剖小鼠测量心脏OTA残留量的测定结果如图3所示。低、中、高剂量组的残留量平均值分别为（6.6±0.7） mg/kg、（8.6±0.3） mg/kg、（15.5±0.7） mg/kg。与PBS对照组相比，低剂量组呈现差异极显著（P<0.01）；中剂量组和高剂量组与PBS对照组相比呈现差异极显著（P<0.001）。

2.4.2 不同浓度OTA暴露对小鼠肝脏OTA残留的测定

解剖小鼠测量肝脏OTA残留量的测定结果如图4所示。低、中、高剂量组的残留量平均值分别为（7.7±0.9） mg/kg、（11.5±1.1） mg/kg、（19.6±1.2） mg/kg。与PBS对照组相比，低剂量组与中剂量组的OTA残留差异极显著（P<0.01）；高剂量组与PBS组相比呈现差异极显著（P<0.001）。

2.4.3 不同浓度OTA暴露对小鼠脾脏OTA残留的测定

对小鼠脾脏中OTA残留量进行测定，结果如图5所示。低剂量组残留量平均值为（5.3±1.3） mg/kg，中剂量组为（5.8±1.5） mg/kg，高剂量组为（9.7±0.8） mg/kg。与PBS对照组相比，低剂量组和中剂量组的OTA残留差异显著（P<0.05）；高剂量组与PBS组相比，差异极显著（P<0.01）。

2.4.4 不同浓度OTA暴露对小鼠肺部OTA残留的测定

对小鼠肺组织进行OTA残留量检测结果如图6所示。低剂量组残留量平均值为（9.8±0.5） mg/kg，中剂量组为（15.2±1.2） mg/kg，高剂量组为（22.0±2.3） mg/kg。与PBS对照组相比，低剂量组的OTA残留量差异极显著（P<0.001），中剂量组和高剂量组亦呈现显著差异（P<0.01）。

2.4.5 不同浓度OTA暴露对小鼠肾脏OTA残留的测定

对小鼠肾脏组织进行OTA残留量检测的结果如图7所示。低剂量组残留量平均值为（12.5±0.2） mg/kg，中剂量组为（13.1±0.3） mg/kg，高剂量组为（29.4±1.8） mg/kg。与PBS对照组进行比较可知，低剂量组OTA残留量的差异极显著（P<0.000 1），中剂量组和高剂量组亦呈现显著差异（P<0.001）。

3 总结

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由曲霉属和青霉属真菌产生的次级代谢产物，作为一种常见的真菌毒素，广泛污染谷物及其制品，对人类健康和动物养殖构成潜在威胁^［13］。该毒素化学性质稳定，在生物体内难以代谢和清除，长期蓄积可对多个器官产生毒性效应，因而被国际癌症研究机构（IARC）列为2B类致癌物^［14］。本研究通过建立PBS空白对照组及低、中、高三种剂量的OTA暴露组，系统探讨了不同浓度OTA暴露对小鼠生长性能、脏器指数及主要器官中OTA残留水平的影响，并进一步分析了其诱导血清氧化损伤的剂量-效应关系。

本实验研究了不同浓度OTA暴露对小鼠生长性能的影响。在OTA暴露期间，小鼠增重与攻毒剂量呈负相关，且采食量与增重率不成正比。各组小鼠精神状态均出现不同程度下降，高剂量组小鼠体重降低尤为明显。已有研究报道，赭曲霉毒素A对25~42日龄和43~56日龄肉鸡的生产性能存在影响，表现为耗料量与增重均极显著低于对照组（P<0.01）^［15］，与本实验中OTA对小鼠生长性能的抑制效应相一致。

脏器指数在毒理学研究中具有重要意义，可通过量化器官重量的相对变化，间接反映其生理或病理状态。本实验进一步探究了不同浓度OTA暴露对各器官脏器指数的影响。结果显示，各浓度OTA处理对小鼠心、脾、肺、肾的脏器指数均无显著影响；仅高剂量OTA暴露后，小鼠肝脏的脏器指数显著降低，提示长期摄入OTA污染的饲料可能导致肝脏发生病变。该结果亦进一步验证了肝脏是OTA的主要靶器官之一，肝脏作为机体主要的药物代谢器官，是OTA生物转化的重要场所，OTA经肝脏代谢后可生成活性中间体，进而诱发肝细胞损伤。

OTA还可通过诱导氧化应激显著干扰血清抗氧化系统的平衡，导致抗氧化物酶活性降低^［16］。本实验血清抗氧化指标测定结果显示，随着OTA暴露剂量的增加，实验组小鼠血清中SOD活力、总抗氧化能力和GSH‑PX活力均出现不同程度的显著下降。这表明OTA引发的氧化应激可破坏机体氧化还原稳态，产生大量活性氧自由基，进而攻击细胞脂质、蛋白质及DNA，造成肝、肾等多种组织器官损伤。文献报道，OTA暴露可诱导小鼠肝脏ROS过量生成并加剧氧化应激水平，而褐藻寡糖（AOS）可缓解OTA所致的肝脏氧化损伤^［17-18］，与本实验中观察到的OTA导致小鼠血清抗氧化能力下降的现象相吻合。

为深入解析赭曲霉毒素A在不同脏器中的毒理学效应，对暴露于不同浓度OTA饲料的小鼠主要脏器进行了毒素残留量分析。结果表明，OTA在各器官中的分布呈明显器官特异性：肝脏、肾脏及肺脏中的残留量显著高于心脏和脾脏，且以肾脏残留量最高，验证了肾脏和肝脏是OTA的主要靶器官^［19］。值得特别关注的是，肺脏的OTA残留量异常偏高，甚至超过肝脏，这为OTA器官毒性研究提供了新的方向。

本研究揭示了OTA暴露在小鼠模型中引发的系统性毒性，其不仅表现为剂量依赖性的生长抑制与脏器损伤，还涉及氧化应激及器官特异性蓄积两条关键毒理途径。值得注意的是，肺脏中异常升高的OTA残留量提示其可能成为除肝、肾外的重要毒性靶器官，为传统OTA毒理学研究拓展了新的视角。未来研究可进一步聚焦以下方面：1） 肺脏在OTA毒性中的具体损伤机制及功能影响；2） 氧化应激通路在介导多器官毒性中的上下游调控网络；3） 延长暴露周期或降低暴露剂量条件下的慢性毒性效应与累积风险；4） 不同物种间器官蓄积差异及其与毒性表现的关联性。

参考文献

[1] Stoev S D. New evidences about the carcinogenic effects of Ochratoxin A and possible prevention by target feed additives［J］. Toxins， 2022， 14（6）： 380.

[2] Yang Yan， Li Mingtao， Zhao Junxiong， et al. Production， toxicological effects， and control technologies of ochratoxin a contamination： Addressing the existing challenges［J］. Water， 2024， 16（24）： 3620.

[3] Więckowska M， Cichon N， Szelenberger R， et al. Ochratoxin a and its role in cancer development： A comprehensive review［J］. Cancers， 2024， 16（20）： 3473.

[4] McKeon H P， Schepens M A A， van den Brand A D， et al. Assessment of mycotoxin exposure and associated risk in pregnant Dutch women： The human biomonitoring approach［J］. Toxins， 2024， 16（6）： 278.

[5] Hanrui Qing， Huo Xueting， Huang Shimeng， et al. Bacillus subtilis ANSB168 producing d-alanyl-d-alanine carboxypeptidase could alleviate the immune injury and inflammation induced by ochratoxin A［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2021， 22（21）： 12059.

[6] Son Y， Lee H J， Ryu D， et al. Ochratoxin a induces hepatic and renal toxicity in mice through increased oxidative stress， mitochondrial damage， and multiple cell death mechanisms［J］. Archives of Toxicology， 2024， 98（7）： 2281‑2295.

[7] Abdelrahman R E， Khalaf A A A， Elhady M A， et al. Antioxidant and antiapoptotic effects of quercetin against ochratoxin A-induced nephrotoxicity in broiler chickens［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology， 2022， 96： 103982.

[8] Le G， Du Heng， Sylia A， et al. Ochratoxin a induced differentiation nephrotoxicity in renal tubule and glomeruli via autophagy differential regulation［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology， 2022， 95： 103973.

[9] Le Guannan， Yuan Xin， Hou Lili， et al. Ochratoxin A induces glomerular injury through activating the ERK/NF‑κB signaling pathway［J］. Food and Chemical Toxicology， 2020， 143： 111516.

[10] Zheng Qianwen， Ding Xufen， Cao Huijun， et al. Ochratoxin A induces steatosis via PPARγ‑CD36 axis［J］. Toxins， 2021， 13（11）： 802.

[11] Hui Peng， Zheng Xianrui， Dong Jiao， et al. Metabolomics and transcriptomics analyses of curcumin alleviation of Ochratoxin A‑induced hepatotoxicity［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2023， 25（1）： 168.

[12] Fu Miao， Chen Yuanyuan， Yang Anhuai. Ochratoxin A induces mitochondrial dysfunction， oxidative stress， and apoptosis of retinal ganglion cells （RGCs）， leading to retinal damage in mice［J］. International Ophthalmology， 2024， 44（1）： 72.

[13] 王晓萱， 赵琳琳， 李露露， 等. 赭曲霉毒素A对动物的危害及脱毒研究进展［J］. 动物营养学报， 2024， 36（1）： 107‑114.

[14] 张诗怡. 赭曲霉毒素A对鸡脾脏线粒体的损伤及虾青素干预作用的研究［D］. 沈阳： 沈阳农业大学， 2023：4-9.

[15] 许飞强， 林居纯， 陈雅丽. 赭曲霉毒素A及毒素吸附剂对肉鸡生长性能的影响［J］. 养禽与禽病防治， 2008（11）： 36‑37.

[16] Liu Yumei， Wang Haojie， Zhang Mengyu， et al. Protective effect of selenomethionine on T‑2 toxin-induced liver injury in New Zealand rabbits［J］. BMC Veterinary Research， 2021， 17（1）： 153.

[17] Limonciel A， Jennings P. A review of the evidence that Ochratoxin A is an Nrf2 inhibitor： Implications for nephrotoxicity and renal carcinogenicity［J］. Toxins， 2014， 6（1）： 371‑379.

[18] Wang Jiancheng， Lu Qiying， Cai Jianye， et al. Nestin regulates cellular redox homeostasis in lung cancer through the Keap1-Nrf2 feedback loop［J］. Nature Communications， 2019， 10： 5043.

[19] 梁停停， 申立泉， 姜威， 等. 赭曲霉毒素A在猪组织残留的研究进展［J］. 广东饲料， 2023， 32（6）： 37‑39.

基金资助

国家自然科学基金项目(32072771)

河南省自然科学基金项目(252300421414)