利用CRISPR/Cas9联合Cre-lox系统快速构建重组HVT-HA（Y280）

Rapid construction of recombinant HVT-HA（Y280） using CRISPR/Cas9 combined with the Cre-lox system

摘要

H9N2亚型禽流感病毒Y280谱系新型变异株的出现，对养禽业构成新的威胁，现有的商品化疫苗难以提供完全保护。旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以火鸡疱疹病毒（HVT）为载体，构建表达H9N2 Y280分离株血凝素（HA）蛋白的重组病毒。首先，设计并合成靶向HVT基因组US2非必需区的gRNA，同时构建CRISPR/Cas9表达质粒及携带红色荧光蛋白（RFP）和HA基因的供体质粒。将上述重组质粒共转染鸡胚成纤维细胞，经嘌呤霉素加压筛选后，再接种HVT。待出现表达RFP的病毒蚀斑后，通过连续3轮蚀斑纯化，获得表达HA蛋白的重组病毒HVT-RFP-HA。随后，利用Cre‑lox系统切除RFP标记基因，再经3轮无荧光蚀斑纯化，最终获得无筛选标记的重组病毒HVT-HA。通过PCR和测序对外源基因插入位点进行鉴定，并将重组病毒连续传代20次以评估其遗传稳定性。结果表明，HA基因已准确插入HVT基因组的US2位点；连续传代20次后，HA基因仍稳定保留。本研究成功建立了基于NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre‑lox系统的重组HVT载体疫苗快速构建平台，所获重组病毒HVT-HA遗传稳定性良好，为H9N2 Y280谱系变异株的防控提供了候选疫苗株，但其免疫保护效果尚需进一步验证。

Abstract

A new threat to the poultry industry was posed by the emergence of a novel variant of the H9N2 subtype avian influenza virus belonging to the Y280 lineage， and complete protection was not provided by the existing commercial vaccines. A recombinant virus expressing the hemagglutinin （HA） protein of the H9N2 Y280 isolate was constructed by using CRISPR/Cas9 gene editing technology with turkey herpesvirus （HVT） as the vector. First， a guide RNA （gRNA） targeting the US2 non‑essential region of the HVT genome was designed and synthesized， and a CRISPR/Cas9 expression plasmid as well as a donor plasmid carrying the red fluorescent protein （RFP） and HA genes were constructed. These recombinant plasmids were co‑transfected into chicken embryo fibroblasts， and after puromycin selection， the cells were infected with HVT. After plaques expressing RFP were observed， three consecutive rounds of plaque purification were performed， and the recombinant virus HVT‑RFP‑HA expressing the HA protein was obtained. Subsequently， the RFP marker gene was excised by the Cre‑lox system， and after three additional rounds of non‑fluorescent plaque purification， a marker‑free recombinant virus， designated HVT‑HA， was finally obtained. The insertion site of the exogenous gene was identified by PCR and sequencing， and the recombinant virus was serially passaged 20 times to evaluate its genetic stability. The results showed that the HA gene was accurately inserted into the US2 site of the HVT genome and was stably retained after 20 consecutive passages. In conclusion， a rapid platform for the construction of recombinant HVT‑vectored vaccines based on the NHEJ‑CRISPR/Cas9 and Cre‑lox systems was successfully established， and the good genetic stability was exhibited by the resulting recombinant virus HVT‑HA. A candidate vaccine strain was thus provided for the prevention and control of the H9N2 Y280 variant； however， its immunoprotective efficacy remained to be further validated.

Graphical abstract

关键词

H9N2 / HA基因 / NHEJ‑CRISPR/Cas9 / HVT‑HA

Key words

H9N2 / HA gene / NHEJ-CRISPR/Cas9 / HVT-HA

0 引言

流感病毒根据其核衣壳蛋白和基质蛋白抗原性的差异，主要分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型^［1］。禽流感病毒属于甲型流感病毒，归入正黏病毒科，是一种有包膜的单股负链RNA病毒。其基因组由8个节段组成，编码多种蛋白质，其中包括两种关键的表面糖蛋白：血凝素（Hemagglutinin， HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase， NA）。依据HA和NA的抗原性差异，禽流感病毒可进一步划分为16个HA亚型和9个NA亚型。根据对鸡的致病性高低，禽流感病毒又可分为高致病性与低致病性两类。其中，H5和H7亚型毒株可引起高致病性禽流感，而H9N2亚型则属于低致病性禽流感病毒^［2］。

H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从美国威斯康星州的火鸡群中分离并鉴定^［3］。此后，该病毒在全球范围内的家禽、野鸟及哺乳动物中均有检出，并逐渐成为家禽中流行的主要流感病毒亚型。该病毒不仅造成严重的经济损失，也对公共卫生构成持续威胁^［4-5］。H9N2病毒主要分为欧亚谱系和美洲谱系，其中欧亚谱系可进一步划分为G1、Y280和Y439三个分支^［6-7］。相比之下，美洲谱系主要存在于野鸟中^［8］。值得关注的是，H9N2病毒不仅具备跨种传播能力，还可为新发禽流感病毒（如H5N2、H6N1、H7N7、H7N9和H10N8等）提供内部基因片段^［9-11］。因此，有效控制H9N2病毒的传播对维护公共卫生安全具有重要意义。现有研究表明，当前商品化疫苗对Y280谱系毒株的保护效果有限，亟待研发与该流行株相匹配的新型疫苗^［12］。

火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkeys， HVT）作为一种常用的病毒载体，已被广泛用于表达多种禽类病原的保护性抗原，包括禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒及传染性喉气管炎病毒等^［13-14］。目前，重组HVT的构建方法主要包括传统同源重组、细菌人工染色体技术以及黏粒系统^［15］。尽管这些技术能够实现外源基因的整合，但普遍存在操作流程复杂、构建周期较长等局限性。

近年来，CRISPR‑Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR‑associated Protein 9）系统的问世引发了基因组编辑技术的革命性发展^［16-17］。其中，源自化脓性链球菌的Ⅱ型CRISPR‑Cas系统由Cas9核酸内切酶、单向导RNA（single guide RNA，sgRNA）及反式激活crRNA（trans‑activating CRISPR RNA， tracrRNA）组成。sgRNA通过识别靶序列下游保守的5’‑NGG‑3’PAM（Protospacer Adjacent Motif）基序，引导Cas9蛋白在特定位点精确引入DNA双链断裂^［18-19］。随后，细胞可通过高保真的同源定向修复（Homology‑Directed Repair， HDR）途径或易错的非同源末端连接（Non‑Homologous End Joining， NHEJ）途径对断裂进行修复^［16］。目前，该技术已成功应用于多种DNA病毒基因组的精准编辑，包括单纯疱疹病毒1型、腺病毒、伪狂犬病病毒、痘苗病毒、EB病毒、豚鼠巨细胞病毒、火鸡疱疹病毒、鸭肠炎病毒及传染性喉气管炎病毒等^［20-22］。

利用NHEJ介导的CRISPR‑Cas9系统，将H9N2亚型禽流感病毒Y280谱系的HA基因快速插入HVT Fc126株的US2区域，成功构建了重组病毒HVT‑HA。该策略为新型禽流感疫苗的研发提供了高效、简便的技术平台，也为其他禽类病原的多价活载体疫苗构建奠定了基础。

1 试验材料与方法

1.1 病毒、质粒及细胞

HVT Fc126株（GenBank登录号：AF291866.1）第5代毒种由本实验室液氮保存，使用前测定其病毒滴度为1×10⁵ PFU/mL。原代鸡胚成纤维细胞（Chicken Embryo Fibroblast，CEF）制备自10日龄SPF鸡胚，以1×10⁶ 个/mL的密度接种于培养瓶中。细胞采用M199培养基（1×，Gibco，美国）进行培养，培养基中添加5%胎牛血清（FBS，Peak Serum，美国）、F‑10营养混合物（终浓度0.5×，Sigma，美国）、1%抗生素‑抗真菌溶液（Gibco，美国）、10%胰蛋白胨磷酸肉汤（TPB，BD公司，美国）及7.5%碳酸氢钠溶液。细胞置于37 ℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱中培养。mRFP1‑C1质粒和HA（H9N2， Y280）表达盒均由本实验室保存。

1.2 Cas9/gRNA表达质粒的构建

靶向HVT基因组US2区域的gRNA设计及筛选依据如下^［23］：以HVT Fc126株基因组（GenBank登录号：AF291866.1）为参考，选择US2基因的编码区作为靶向区间。使用在线设计工具CHOPCHOP（https：//chopchop.cbu.uib.no/）预测潜在gRNA，参数设置为：PAM基序为5’‑NGG‑3’，gRNA长度为20 nt。初步筛选获得5条评分较高的gRNA。随后，按以下标准进行进一步筛选：①靶序列在US2基因中具有唯一性，经BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对与HVT基因组其他区域无显著同源性（连续匹配≤12 bp）；②预测切割效率（http：//crispor.tefor.net/）大于60%；③ 脱靶评分（MIT specificity score）大于70。最终选取综合评分最高的gRNA，其序列为5’‑ACACAAATTGCGTTTAGGTG‑3’，对应的PAM序列为GGG，用于后续实验。

根据设计结果，合成互补寡核苷酸链US2‑gRNA‑F和US2‑gRNA‑R，经退火处理形成双链DNA片段。将退火产物插入经BbsI限制性内切酶线性化的CRISPR表达质粒pSpCas9（BB）‑2A‑Puro （PX459） V2.0（Addgene，美国）中，使用T4 DNA连接酶于16 ℃ 连接过夜。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB琼脂平板，37 ℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，阳性克隆经测序验证，确认gRNA序列正确插入，将验证正确的质粒命名为PX459‑US2‑gRNA。

参照上述方法，合成互补寡核苷酸链sgB‑F和sgB‑R（其靶序列与人类、鸡、猪、原核生物DNA及病毒基因组均无同源性），经退火后克隆至PX459质粒，获得重组质粒PX459‑sgB‑gRNA。所构建的质粒均经限制性酶切和测序验证，验证正确的质粒用于后续实验。

1.3 供体质粒的构建

为构建含RFP和H9N2 HA基因表达盒的供体质粒pGEM‐T‐easy‐sgB‐LoxN‐PacI‐RFP‐PacI‐LoxN‐SfiI‐HA‐SfiI‐sgB，首先，通过商业基因合成服务（上海生工生物工程股份有限公司，中国），合成sgB‑LoxN‑PacI‑LoxN‑SfiI‑spacer‑SfiI‑sgB片段。该片段包含2段sgB序列、2段LoxN序列、1个PacI酶切位点和1段spacer序列。其中，PacI位点用于后续插入RFP表达盒，LoxN序列用于Cre重组酶介导的荧光标记删除，spacer序列为外源基因插入预留位点。随后，将合成片段克隆至pGEM⁃T⁃easy载体，获得中间质粒pGEM‐sgB‐LoxN‐PacI‑LoxN‐SfiI‐spacer‐SfiI‐sgB。接着，将来源于mRFP1‑C1（Addgene，美国）的RFP表达盒通过PacI位点插入该中间质粒，获得pGEM‐sgB‐LoxN‑RFP‐LoxN‐SfiI‐spacer‐SfiI‐sgB。最后，将HA（H9N2， Y280）表达盒通过SfiI位点克隆至上述质粒，获得最终供体质粒pGEM‐sgB‐LoxN‐PacI‑RFP‐PacI‐LoxN‐SfiI‐HA‐SfiI‐sgB。本研究所用引物序列见表1。

1.4 重组病毒HVT‑RFP‑HA的获得与纯化

采用NHEJ‑CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组病毒HVT‑RFP‑HA。转染前，将原代CEF细胞以4×10⁵ 个/孔的密度接种于24孔板中。使用Lipofectamine 3000^®转染试剂（Invitrogen，美国），将经预实验优化的0.25 μg PX459‑US2‑gRNA、0.25 μg PX459‑sgB‑gRNA及0.50 μg供体质粒pGEM‑sgB‑LoxN‐PacI‐RFP‐PacI‐LoxN‐SfiI‐HA‐SfiI‐sgB（该用量为最佳转染条件）共转染至CEF细胞。转染24 h后，转染效率按公式（RFP阳性细胞数/总细胞数）×100%计算，可达70%~80%。随后，加入嘌呤霉素处理细胞3 d，再以0.01 PFU/细胞的感染复数（Multiplicity of Infection， MOI）接种HVT病毒。选择该低MOI值可避免蚀斑融合，便于单个蚀斑纯化，同时保证足够的感染效率。该MOI值依据本实验室前期优化结果确定。感染后3 d，取半数细胞用于PCR鉴定基因编辑效率，其余半数细胞重新接种至新鲜CEF细胞中进行荧光蚀斑筛选与纯化。

1.5 重组病毒HVT‑HA的获得与纯化

为获得无RFP标记的重组病毒HVT‑HA，采用Cre/Lox系统介导HVT‑RFP‑HA中RFP表达盒的删除。转染前1 d，将原代CEF细胞以4×10⁵ 个/孔的密度接种于24孔板中。使用Lipofectamine 3000^®转染试剂，按照制造商说明书，将0.5 μg Cre重组酶表达质粒pCMV‑Cre转染至CEF细胞。转染后24 h，以0.01 PFU/细胞的MOI接种重组病毒HVT‑RFP‑HA。感染后3 d，收集细胞培养物。

将上述培养物接种至新鲜CEF细胞中。感染后3~5 d，在荧光显微镜下挑取无红色荧光的病毒蚀斑，转移至预先铺有新鲜CEF细胞的6孔板中进行扩增。重复上述纯化步骤3 轮，直至获得完全无RFP荧光的纯化重组病毒，命名为HVT‑HA。采用PCR方法对纯化后的HVT‑HA病毒基因组进行鉴定，以确认RFP基因已被删除，而HA基因稳定保留。

1.6 重组病毒HVT‑HA的稳定性测试

为评估重组病毒HVT‑HA的遗传稳定性，将其在CEF细胞中连续传代20次。具体步骤如下：将重组病毒接种于CEF单层细胞，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞病变（CPE）达80%以上时，收集细胞培养物作为下一代接种物。分别于第5、10、15和20代收集感染细胞，提取基因组DNA，通过PCR检测HA基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，以评估目的基因在传代过程中的稳定性。

2 试验结果

2.1 PX459‑US2‑gRNA的鉴定

以PX459‑US2‑gRNA质粒为模板，利用引物U6 forward和US2‑gRNA‑R进行PCR扩增，获得大小为98 bp的特异性条带。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与预期序列完全一致，证实PX459‑US2‑gRNA质粒构建成功（图1）。

2.2 PX459‑sgB‑gRNA的鉴定

以PX459‑sgB‑gRNA质粒为模板，以U6 forward和sgB‑gRNA‑R为引物进行PCR扩增，同样获得98 bp的特异性条带。测序结果表明，插入序列与预期序列一致，证实PX459‑sgB‑gRNA质粒构建成功（图2）。

2.3 供体质粒的鉴定

为构建含红色荧光蛋白（RFP）和H9N2 HA表达盒的供体质粒，首先通过商业基因合成服务（上海生工生物工程股份有限公司，中国）合成sgB‐LoxP‑PacI‐LoxP‐SfiI‐spacer‐SfiI‐sgB片段。将该片段克隆至pGEM‑T‑easy载体，获得中间质粒pGEM‑T‐easy‐sgB‐LoxN‐PacI‐LoxN‐SfiI‐spacer‐SfiI‐sgB，其序列结构见图3。随后，利用PacI位点将来源于mRFP1‑C1的RFP表达盒（含增强子、启动子、编码区及终止子）插入上述质粒，构建得到pGEM‐T‐easy‐sgB‐LoxN‐PacI‐RFP‐PacI‐LoxN‐SfiI‐spacer‐SfiI‐sgB，其中PacI‑RFP‑PacI片段序列见图4。最后，通过SfiI位点将H9N2（HA）表达盒（图5）克隆至上述质粒，获得最终供体质粒pGEM‑T‑easy‑sgB‑LoxN‑PacI‑RFP‑PacI‑LoxN‑SfiI‑HA‑SfiI‑sgB。测序结果证实该供体质粒构建成功。

2.4 重组病毒HVT‐RFP‐HA的鉴定和纯化

为获得重组病毒HVT‐RFP‐HA，将质粒PX459‐US2‐gRNA、PX459‐sgB‐gRNA与供体质粒共转染CEF细胞。转染24 h后观察到RFP荧光表达（图6），随后经嘌呤霉素处理3 d，再以0.01 MOI接种HVT。感染数日后，在荧光显微镜下可观察到表达RFP的红色荧光蚀斑（图7），初步表明供体序列RFP‐HA已成功插入HVT基因组。采用两对引物进行PCR鉴定：引物对US2‐F/RFP‐internal‑R和HA‑internal‑F/US2‑R用于检测RFP‑HA正向插入的重组病毒，预期片段大小分别为769 bp和1042 bp；引物对US2‑F/HA‑internal‑F和RFP‑internal‑R/US2‑R用于检测RFP‑HA反向插入的病毒，预期片段大小分别为449 bp和1362 bp。电泳结果（图8）与预期一致，测序结果亦与预期相符。以上结果表明，RFP‑HA已成功插入HVT基因组，且同时获得正向插入和反向插入的混合重组病毒群体。经连续3轮蚀斑纯化（图9），最终获得正向插入的重组病毒HVT‑RFP‑HA。

2.5 重组病毒HVT‑HA的鉴定与纯化

为去除筛选标记RFP，以获得仅表达HA基因的无标记重组病毒HVT‑HA，采用Cre‑lox重组系统对病毒进行处理。首先将Cre重组酶表达质粒转染至CEF细胞，转染24 h后，以0.01 MOI接种重组病毒HVT‑RFP‑HA。在Cre酶介导下，位于LoxN位点之间的RFP表达盒被切除。感染后96 h，开始挑取无红色荧光的病毒蚀斑进行纯化。经连续3轮蚀斑扩增，所获蚀斑均不再显示红色荧光，表明RFP基因已被有效删除。提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定，使用引物HA‐internal‐F/US2‐R可扩增出约1042 bp的预期条带（图10），与RFP切除后HA基因直接连接至US2位点的基因组结构相符；测序结果亦证实HA基因正确插入US2位点。以上结果表明，已成功获得无筛选标记的重组病毒HVT‐HA。

2.6 重组病毒HVT‑HA的遗传稳定性检测

将重组病毒HVT‑HA在CEF细胞中连续传代20次，每5代提取病毒基因组DNA进行PCR检测。结果显示，第5、10、15和20代病毒DNA样品中均能扩增出1042 bp的特异性条带（图11），表明HA基因在连续传代20次后仍能稳定整合于HVT基因组的US2位点，具有良好的遗传稳定性。

3 结束语

自20世纪90年代以来，H9N2亚型禽流感病毒已在全球多个国家和地区呈现地方性流行。该病毒致病力相对较低，单一感染通常仅引起鸡轻度呼吸道症状及短期产蛋下降。然而，与其他病原体发生共感染时，其发病率和死亡率显著升高，不仅严重威胁养禽业的可持续发展，亦构成不容忽视的公共卫生安全隐患^［24］。现有研究表明，当前商品化疫苗难以对Y280谱系病毒提供完全保护，该新型基因型对养禽业构成了新的挑战^［12］。

为有效应对该挑战，亟须研发与流行株高度匹配的新型疫苗。目前临床上广泛使用的禽流感疫苗以全病毒灭活疫苗为主，该类疫苗虽能诱导较高水平的循环抗体，但在激发细胞免疫和黏膜免疫应答方面存在明显不足，这可能是其对Y280谱系毒株攻击保护效果不足的重要原因。近年来，基于重要保护性抗原的重组活载体疫苗已成为禽流感疫苗研发的重要方向。在众多候选载体中，火鸡疱疹病毒因其独特的生物学优势而备受关注^［25］。

HVT基因组包含多个复制非必需区，为外源基因的稳定整合提供了基础。作为活病毒载体，HVT可在鸡体内建立持续感染，实现外源基因的长期表达，持久刺激机体产生特异性抗体^［26］，并能诱导强大的细胞免疫应答，单次免疫即可提供终身保护。该病毒对鸡无致病性，可突破母源抗体干扰，且适用于早期免疫（1 日龄雏鸡或18 日龄鸡胚接种）。目前，表达IBDV VP2基因的重组HVT活疫苗已实现商品化应用。基于此，本研究选取HVT为载体，表达Y280谱系HA蛋白，以期为H9N2亚型禽流感防控提供新的技术选择。

研究表明，外源基因的插入位点对其表达水平及重组病毒的生物学特性（如生长和复制能力）具有显著影响。目前，已在HVT基因组中鉴定出20余个复制非必需区，常见插入位点包括US2、US10、UL3‑4、UL22‑23、UL45‑46及US10‑SORF等^［27］。其中，US2是表达疫苗靶抗原的理想位点，其效果优于US10^［28］。以US2为插入位点构建的重组病毒rHVT‑US2‑HA与亲本HVT具有相似的体外生长动力学特征；与rHVT‑US10‑HA相比，rHVT‐US2‐HA免疫鸡可获得更好的攻毒保护效果，死亡率显著降低，且诱导的血凝抑制抗体滴度亦显著升高。另一项研究^［29］将H9N2亚型禽流感病毒的HA基因表达盒分别插入马立克氏病病毒基因组的US2、US10和meq区域，通过荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验，比较了HA基因在mRNA和蛋白质水平的表达差异。结果表明，插入US2区的HA表达盒具有最高的转录活性和蛋白表达水平。综合上述证据，US2区能够为外源基因提供高效、稳定的表达环境，且对重组病毒的复制特性影响较小。因此，选择US2区作为HA基因的插入位点，构建重组HVT‐HA候选疫苗。

CRISPR/Cas9作为一种高效的基因编辑工具，与传统方法相比，具有操作简便、编辑效率高及周期短等显著优势^［30］。本研究旨在利用该技术平台，快速构建针对H9N2亚型禽流感病毒Y280谱系的重组疫苗。在前期工作中，已采用CRISPR/Cas9系统成功将传染性法氏囊病病毒的VP2基因插入HVT基因组的UL45/46区域，获得重组病毒HVT‐VP2，并对细胞状态、sgRNA浓度、供体质粒浓度及转染条件等关键参数进行了优化。这些优化参数可直接沿用并验证：① 细胞状态，使用原代CEF细胞，控制在前3代以内、汇合度80%~90%，以保证细胞对转染和病毒感染的敏感性；②sgRNA浓度，PX459‐US2‐gRNA和PX459‐sgB‐gRNA均为0.25 μg；③ 供体质粒浓度，确定为0.5 μg，高于此浓度易因细胞毒性而降低转染效率，低于此浓度则转染效率下降；④ 转染条件，Lipofectamine 3000按总DNA（μg）与转染试剂的固定比例（1∶3）添加。在上述优化参数下，转染后24 h的转染效率可达70%~80%，转染数日后即可观察到红色荧光蚀斑，经3轮纯化获得HVT‐RFP‐HA，后续通过Cre‐Lox删除RFP得到无标记的HVT‐HA。这表明，前期建立的参数体系具有良好的可重复性和普适性，为本研究快速构建重组HVT‐HA提供了可靠的技术保障。

获得目标荧光蚀斑后，需对重组病毒进行纯化。首先，在荧光显微镜下标记并挑取阳性荧光蚀斑；随后，使用自制消化工具仅对标记蚀斑进行局部消化；最后，将消化产物接种至新鲜制备的CEF中。待新一轮荧光蚀斑出现后，重复上述步骤。经3轮连续蚀斑纯化，可获得遗传性状均一的重组病毒。除蚀斑消化法外，还尝试了流式细胞分选（FACS）纯化策略。通过荧光激活细胞分选技术分选单个红色荧光阳性细胞，接种于96孔板中增殖培养，同样成功获得纯化病毒。与传统的蚀斑纯化法相比，FACS法操作更为简便高效。因此，为快速获得纯化重组病毒，可优先考虑采用流式细胞术分选法。

后续将评估重组病毒HVT‐HA的HA蛋白在SPF鸡只的免疫原性与保护效力，以明确其作为疫苗候选株的潜力，尝试构建表达多种免疫原基因的多价HVT活载体疫苗，为最终建立“一针多防”的禽病综合防控策略提供技术支撑。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32402897)

河南省高等学校重点科研项目(25A310006)

河南省高等学校重点科研项目(25A230005)

河南省科技攻关项目(252102111004)

河南省大学生创新训练计划项目(S202510464076)

农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室开放课题(AMLKF202410)

河南科技大学大学生创新创业训练计划项目(2025293)