艾叶酶协同超声提取工艺优化及其抗氧化、抑菌活性研究

Optimization of enzyme assisted ultrasonic extraction process for Artemisia argyi and study on its antioxidant and antibacterial activities

摘要

基于层次分析-熵权法综合评分体系，结合响应面试验设计，优化艾叶酶协同超声提取工艺；采用DPPH自由基、OH自由基清除能力测定法测定艾叶提取液的抗氧化能力；利用抑菌圈法和二倍稀释法测定艾叶提取液的抑菌能力。结果表明，艾叶酶协同超声提取工艺最佳参数为纤维素酶用量3.5%、酶解温度55 ℃、酶解时间75 min、超声时间40 min，在此条件下，综合评分为96.65±1.44。艾叶提取液对DPPH自由基和OH自由基的IC₅₀值分别为（45.00±1.43） mg/mL、（47.51±1.14） mg/mL，具有较好的抗氧化活性。艾叶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为（15.20±0.40） mm、（14.10±0.20） mm、（13.16±0.18） mm，最低抑菌浓度分别为0.25、0.50和0.50 g/mL，具有良好的抑菌活性。

Abstract

Based on the analytic hierarchy process entropy weight method （AHP-EWM） comprehensive scoring system， combined with response surface test design， the enzyme-assisted ultrasound extraction process of Artemisia argyi was optimized. The antioxidant capacity of Artemisia argyi extract was determined using the determination method of DPPH and OH radical scavenging ability. The inhibition zone method and the double dilution method were used to determine the antibacterial ability of Artemisia argyi extract. The results showed that the optimal process parameters for the enzyme assisted ultrasound extraction of Artemisia argyi were cellulase dosage of 3.5%， enzymatic hydrolysis temperature of 55 ℃， enzymatic hydrolysis time of 75 min， and ultrasonic time of 40 min. Under these conditions， the comprehensive score was 96.65±1.44. The IC₅₀ values of Artemisia argyi extract for DPPH and OH radicals were （45.00±1.43） mg/mL、（47.51±1.14） mg/mL， respectively， indicating good antioxidant activity. The diameters of the inhibition zones of Artemisia argyi extract against Staphylococcus aureus， Escherichia coli， and Bacillus subtilis were （15.20±0.40） mm、（14.10±0.20） mm、（13.16±0.18） mm， respectively. The minimum inhibitory concentrations were 0.25， 0.50 and 0.50 g/mL， respectively， indicating good antibacterial activity.

Graphical abstract

关键词

艾叶 / 酶协同超声提取 / 响应面试验设计 / 层次分析-熵权法 / 抗氧化活性 / 抑菌活性

Key words

Artemisia argyi / enzyme assisted ultrasonic extraction / response surface test design / analytic hierarchy process-entropy weight method （AHP-EWM） / antioxidant activity / antibacterial activity

0 引言

艾叶为菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl. et Vant.）的干燥叶，应用历史悠久，具有广泛的药用、食用价值和浓厚的文化内涵。艾叶含有蛋白质、脂肪、维生素和微量元素等营养物质^［1］，同时还含有黄酮、酚酸、多糖和挥发油等活性物质^［2］。药理研究表明，艾叶黄酮具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤和调节脂质代谢等功效^［3］，代表性成分有棕矢车菊素、异泽兰黄素等。艾叶多糖具有抗衰老、抑菌和免疫调节等作用^［4-6］。酚酸类成分的药理活性与抗氧化、抗炎等密切相关^［7-8］，绿原酸和3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸是艾叶所含酚酸类成分的代表。

艾叶多以原粉或取其水提液使用。水提液为传统中药的应用形式，较原粉使用，可以显著减少使用量， 同时水提液中成分多样，可以起到协同作用。天然药物水提液的提取方法有煎煮法、超声辅助法、酶辅助提取法等。酶协同超声提取法结合酶解与超声空化，双重破坏细胞结构，提取效率高，但目前该方法在天然药物提取中的应用多聚焦在单一活性成分上，如银杏叶黄酮^［9］、灵芝多糖^［10］、黄芩苷^［11］、绿原酸^［12］及艾叶黄酮^［13］等，而在多成分综合提取方面的应用仍较为有限，尤其在艾叶多种活性成分的系统提取研究中尚未见报道。

天然药物的药理作用通常源于其所含多种活性成分的多靶点协同效应，因此提取工艺的优化应倾向于多指标综合评价。目前综合评价方法主要分为两类：主观赋权评价法和客观赋权评价法。层次分析法（Analytic hierarchy process，AHP）为较常用的主观赋权法，熵权法（Entropy weight method，EWM）为较常用的客观赋权法，AHP-EWM可实现两种方法的优势互补，使权重分配更具科学性与合理性，已在提取工艺优化与质量评价等^［14-15］领域得到广泛应用。

尽管酶协同超声提取技术具有明显优势，但在艾叶多成分综合提取方面仍存在以下关键问题亟待解决：一是缺乏针对艾叶中黄酮、酚酸、多糖及多种代表性单体成分，如绿原酸、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、棕矢车菊素和异泽兰黄素的系统性提取研究；二是现有工艺优化多依赖单一指标，难以反映多成分协同作用的实际需求；三是尚未建立基于主客观结合赋权法的多指标综合评价体系，以科学指导艾叶提取工艺的优化。

因此，本研究以艾叶为原料，以艾叶黄酮、酚酸、多糖、绿原酸、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、棕矢车菊素和异泽兰黄素含量为指标，基于AHP-EWM法确定7个指标的权重系数，在单因素试验基础上，采用响应面试验设计优化艾叶酶协同超声提取工艺参数，并进一步评估所得艾叶提取液的体外抗氧化与抑菌活性，以期为艾叶资源的综合开发与高值化利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

艾叶样品，2024年6月采自河南省信阳市平桥区（经度114.12°，纬度32.16°），经信阳农林学院中药资源与开发教研室鉴定为菊科植物艾（Artemisia argyi Lévl.et Vant.）的叶，除去杂质，晒干，测水分，粉碎，备用。芦丁对照品（纯度≥98%），北京索莱宝科技有限公司；没食子酸对照品（纯度≥98%），北京奥秘佳德医药科技有限公司；无水葡萄糖对照品（纯度≥98%），合肥博美生物科技有限责任公司；绿原酸、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、棕矢车菊素、异泽兰黄素对照品（纯度99%），江西佰草源生物科技有限公司；考马斯亮蓝G250，合肥千盛生物科技有限公司；纤维素酶（10 万U/g），山东隆科特酶制剂有限公司；维生素C（Vitamin C，VC），天津市科密欧化学试剂有限公司；1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），合肥千巴斯夫生物科技有限公司；硫酸亚铁、双氧水、水杨酸均为分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉，天津市华盛化学试剂有限公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，信阳农林学院药学院生物制药教研室提供。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪，美国沃特斯科技有限公司；TU-180紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004电子天平（万分之一），上海浦春计量仪器有限公司；LG-01高速中药粉碎机，瑞安市百信制药机械有限公司；KQ-500DE超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；UPT纯水机，四川优普超纯科技有限公司；智能生化培养箱，博安特仪器科技（武汉）有限责任公司；智能全温振荡培养箱，浙江美博仪器有限公司；XFH-75CA电热式压力蒸汽灭菌器，浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；TopPette手动单道可调移液器，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。

1.3 试验方法

1.3.1 艾叶酶协同超声提取工艺流程

艾叶→纯化水浸泡→酶解→杀酶→超声提取→抽滤→滤液浓缩至含药量0.2 g/mL。

1.3.2 艾叶提取工艺优化评价指标的测定

1）黄酮含量

以芦丁为对照品，采用NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH法^［16］测定黄酮含量，在510 nm波长处测定吸光度，以芦丁的质量浓度C（µg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制芦丁标准曲线A=0.420 5C+0.029 0（R²=0.998 0，线性范围16~80 µg/mL）。精密移取各试验条件下的提取液1 mL，按NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH法测定吸光度，按标准曲线法计算按艾叶干燥品（按《中国药典》通则0832水分测定法第四法甲苯法测得本研究用艾叶水分为10.0%，下同）计的黄酮含量（%）。

2）酚酸含量

以没食子酸为对照，采用福林酚法^［17］测定酚酸含量，在760 nm波长处测定吸光度，以没食子酸质量浓度C（µg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线A=85.357 0C+0.090 2（R²=0.998 6，线性范围1.76~7.04 µg/mL）。精密移取各试验条件下的提取液1 mL，稀释至5倍，取稀释液1 mL，按福林酚法测定吸光度，标准曲线法计算按艾叶干燥品计的酚酸含量（%）。

3）多糖含量

以无水葡萄糖为对照，采用蒽酮-硫酸法^［18］测定多糖含量，在波长582 nm处测定吸光度，以无水葡萄糖的质量浓度C（µg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制无水葡萄糖标准曲线A=70.078 0C-0.008 4（R²=0.998 2，线性范围3.3~19.8 µg/mL）。精密移取各试验条件下的艾叶提取液1 mL，稀释250倍，取稀释液2 mL，按蒽酮-硫酸法测定吸光度，按标准曲线法计算按艾叶干燥品计的多糖含量（%）。

4）绿原酸、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、棕矢车菊素、异泽兰黄素含量

a）色谱条件：以Luna®Omega PoLar 100-5-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈为流动相A、0.2%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~3 min，17%A；3~15 min，17%A→24%A；15~18 min，24%A；18~35 min，24%A→28%A；35~40 min，28%A→48%A；40~55 min，48%A→63%A；55~60 min，63%A→90%A）；流速为0.6 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为330 nm；运行时间为60 min；进样量为10 μL。

b）精密称取对照品绿原酸、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、棕矢车菊素和异泽兰黄素适量，用甲醇溶解定容，配制成质量浓度依次为28.8、88.0、8.3和34.2 µg/mL的混合对照品溶液。在上述色谱条件下，分别以各指标成分的质量X（ng）为横坐标，对应色谱峰的峰面积Y为纵坐标，考察4种成分的线性关系。绿原酸的线性回归方程为：Y=4 206 943.1X－44 373.2（R²=0.999 5，线性范围：5.76~115.20 ng）；3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸的线性回归方程为：Y=6 296 972.9X－24 616.2（R²=0.999 9，线性范围：17.60~352.00 ng）；棕矢车菊素的线性回归方程为：Y=4 386 468.3X－14 198.8（R²=0.999 6，线性范围：1.66~33.20 ng）；异泽兰黄素的线性回归方程为：Y=5 727 465.3X－67 385.9（R²=0.999 7，线性范围：6.84~136.80 ng）。

c）将各试验条件下的艾叶提取液稀释5倍，经0.45 µm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.3.3 AHP-EWM法确定综合权重系数

1）AHP法确定权重系数r

AHP法根据各指标重要性主观赋予数值，将复杂多指标系统层次化后，再通过逐层比较进行分析^［19］。艾叶提取工艺作为决策目标，由7类指标性成分反映，建立层次结构模型。由艾叶的功效、药理作用及各类成分含量，确定指标的重要性，可得：黄酮=酚酸>多糖>3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸>绿原酸=异泽兰黄素＞棕矢车菊素。采用1~9标度法比较指标间的重要性，并构建优先判断矩阵，见表1和表2。采用AHP法^［20］计算AHP法权重系数r，其中λ_max≈7，CI=9.23×10^－8，RI=1.36（n=7），CR=CI/RI=6.79×10^－8（<0.1），一致性检验通过，主观赋权合理，结果见表2。

2）EWM法确定权重系数ω_j

按照EWM法赋权步骤^［21］，结合本研究均为正向指标，按式（1）对数据进行标准化处理、非负平移（+0.01）；按式（3）计算信息熵值e_j 、式（3）计算信息效用值d_j 、式（4）计算EWM法权重系数ω_j。

y_{ij}=\frac{X_{ij}-X_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{X_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-X_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}，(1)

P_{ij}=y_{ij}/{\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}{y}_{ij}，(2)

e_j=-\mathrm{l}\mathrm{n}(\mathrm{1}/n){\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}(P_{ij}\times \mathrm{l}\mathrm{n}{P}_{ij})，(3)

d_j=\mathrm{1}-e_j，(4)

{\omega }_j=d_j/{\displaystyle \sum _{j=\mathrm{1}}^m}{d}_j，(5)

式中：y_{ij}为标准化后的第i样本中第j指标无量纲得分；P_{ij}为第i个样本中第j指标比重；n为样本数量；m为指标数量；X_ij 为第i个样本中第j个指标的值；X_min、X_max分别为最小、最大指标值。

3）AHP-EWM法确定综合权重系数F_j

按式（6）计算，

F_j=r{\omega }_j/{\displaystyle \sum _{j=\mathrm{1}}^m}r{\omega }_j。(6)

1.3.4 单因素试验

在预试验基础上，固定浸泡时间30 min，浸泡、酶解料液比1∶15（m∶V），超声提取料液比1∶30，提取1次，分别考察纤维素酶用量、酶解温度、酶解时间和超声时间等4个因素的影响。具体步骤为：取艾叶约5 g，精密称定，加15倍量纯化水浸泡30 min，加入纤维素酶，加入量按底物（艾叶质量）1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%，酶解温度45、50、55、60和65 ℃，酶解30、45、60、75和90 min后，煮沸10 min杀酶，冷却至室温，再加入15倍量纯化水，超声提取20、30、40、50和60 min，提取液浓缩至含药量为0.2 g/mL，备用。按照1.3.2评价指标测定项下的方法，分别测定7类成分的含量，并按AHP-EWM法确定的综合权重系数计算综合评分。

1.3.5 Box-Behnken响应面试验设计

根据单因素试验结果，以酶用量、酶解温度、酶解时间和超声时间为考察因素，以艾叶黄酮、酚酸、多糖、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸、异泽兰黄素和棕矢车菊素含量的综合评分为响应值，按照Design-Expert 13.0 软件安排的29组试验进行测定，得到艾叶提取工艺优化方案。试验设计因素水平见表3。

1.3.6 艾叶7类指标成分含量及综合评分的计算

按照1.3.2项下各方法测定7类指标成分的含量，按式（7）计算。

Q=\frac{CVK}{m}，（7）

式中：Q为质量分数，单位%、mg/g；C为质量浓度，单位μg/mL；V为样品测试液体积，单位mL；K为稀释倍数；m为艾叶按干燥品计的质量，单位g。

按式（8）计算综合评分。

Z={\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^j}(F_j\frac{Q_i}{Q_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}}\times \mathrm{100})，（8）

式中：Z为综合评分；Q_i 为第i个指标的含量；Q_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}为最大含量。

1.3.7 艾叶提取液抗氧化活性检测

1） DPPH自由基清除率检测

按参考文献［22］的方法，略作修改。将艾叶提取液用纯化水稀释配制成质量浓度分别为20、40、60、80、100、120和140 mg/mL的供试品溶液。分别取各供试品溶液、0.1 mmol/mL DPPH无水乙醇溶液各1.50 mL，混匀，室温避光反应30 min，在517 nm处测得吸光度A₁₁；以无水乙醇代替DPPH溶液测得吸光度A₁₂；以纯化水代替供试品溶液测得吸光度A₁₀，并以相同质量浓度的VC溶液作阳性对照。按式（9）计算各供试品溶液和VC对DPPH自由基（DPPH·）清除率（%），并计算艾叶提取液清除DPPH·的半数抑制浓度（IC₅₀）。

DPPH·清除率=\left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{11}}-A_{\mathrm{12}}}{A_{\mathrm{10}}}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（9）

2） OH自由基清除率检测

按参考文献［23］的方法，并略有改动。将艾叶提取液用纯化水稀释配制成质量浓度分别为25、50、75、100、125、150和175 mg/mL的供试品溶液。分别取各供试品溶液、9 mmol/L硫酸亚铁溶液、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、6 mmol/L过氧化氢溶液各1.00 mL，混匀，37 ℃恒温反应30 min，在510 nm处测得吸光度A₂₁，以纯化水代替过氧化氢溶液测得吸光度A₂₂，以纯化水代替供试品溶液测得吸光度A₂₀，并以相同质量浓度的VC溶液作阳性对照。按式（10）计算供试品溶液和VC对OH自由基（OH·）清除率（%），并计算艾叶提取液清除OH·的半数抑制浓度（IC₅₀）。

OH·清除率=\left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{21}}-A_{\mathrm{22}}}{A_{\mathrm{20}}}\right)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}。（10）

1.3.8 艾叶提取液抑菌活性检测

按艾叶酶协同超声提取最佳工艺制得质量浓度为4.00 g/mL的艾叶样品溶液，并用纯化水稀释配制成质量浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 g/mL的供试品溶液。参考蔡晨晨等^［24］的方法，采用抑菌圈法测定艾叶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性；并采用微量稀释法^［25］测定其对上述3种菌的最小抑菌浓度。

1.4 数据分析

单因素复合图、抗氧化活性检测折线图、抑菌活性检测柱形图采用Microsoft Excel 2019软件绘制，运用Design-Expert 13.0 软件进行响应面试验设计及方差分析等数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 纤维素酶用量对艾叶酶协同超声提取工艺的影响

由图1可知，酶用量显著影响艾叶多组分酶协同超声提取过程，随着酶用量的增大，7类评价指标成分含量也显著增长。

当酶用量达3.0%之后，指标成分含量呈现减小趋势。综合评分在酶用量为2.5%和3.0%时较佳，3.0%时综合评分最大94.97，且3.0%与3.5%处理组有显著差异（P<0.05）。综合考虑，确定酶用量3.0%作为单因素试验的最适条件，并选用酶用量2.5%、3.0%和3.5%等3个水平进行进一步的响应面试验设计。

2.1.2 酶解温度对艾叶酶协同超声提取工艺的影响

图2反映酶解温度对提取过程的影响，可知目标成分除3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸外， 45~55 ℃内，含量均随温度升高而升高，55 ℃后出现小幅度下降，可能是因为液体介质的表面张力与黏性下降、扩散系数变大，目标成分提取含量上升^［26］，此外酶解温度也会影响纤维素酶的活性。55 ℃时综合评分最高，为99.10，显著性分析显示55 ℃处理组与50 ℃、60 ℃处理组存在显著差异（P<0.05）。因此选择酶解温度为55 ℃作为单因素试验的最适条件，并选用50、55和60 ℃等3个水平进行后续响应面试验设计。

2.1.3 酶解时间对艾叶酶协同超声提取工艺的影响

由图3可知，随着酶解时间的增加，各目标成分和综合评分的变化基本呈先升后降的趋势，酶解时间为60 min时综合评分最大，为99.21。在60 min时，综合评分与45 min、75 min差异显著。因此选择酶解时间为60 min作为单因素试验的最适条件，并选用酶解时间45、60和75 min等3个水平进行后续响应面试验设计。

2.1.4 超声时间对艾叶酶协同超声提取工艺的影响

由图4可知，超声时间对综合评分的影响呈先上升再下降的趋势，超声时间为40 min时，综合评分最大，为99.30。超声时间在不同程度上影响目标成分溶解扩散过程，超声时间短，目标成分溶解不充分，提取效率低。提取时间长，温度不断上升，易使目标化合物在提取过程中发生降解而导致含量下降或出现反吸附，同时增加能耗^［27］。综合考虑，选择超声时间40 min作为单因素的最适条件，并选用30、40和50 min等3个水平进行后续响应面试验设计。

2.2 Box-Behnken响应面试验设计结果与分析

响应面试验设计数据及结果见表4。响应面试验设计中EWM法计算的各指标权重系数ω、结合各指标的AHP法权重系数r，按AHP-EWM法计算其综合权重系数F，结果见表5；响应面试验设计方差分析结果见表6。

采用Design-Expert13.0软件对表4中的Box-Behnken响应面试验结果进行多元二次回归，以酶用量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）和超声时间（D）为自变量，以综合评分（S）为响应值，得到回归方程为S=98.75－0.063A+1.800B+0.038C+0.110D+0.24AB+0.06AC－0.28AD+0.24BC+0.16BD－0.06CD－1.78A²－6.66B²－2.19C²－1.80 D²。对模型进行方差分析，结果见表6。如表6所示，模型P值<0.000 1，差异极显著，失拟项P值0.114 4>0.05，没有显著性差异，表明实验数据受未知因素的影响相对较小，即该模型可对艾叶提取工艺综合评分进行预测和分析。相关系数R²=0.981 3（>0.9），说明构建的模型拟合程度良好，试验误差小。由F值和P值可知，4个因素对综合评分影响显著性顺序为：酶解温度（B）>超声时间（D）>酶用量（A）>酶解时间（C），且模型的一次项B具有极显著影响（P<0.01），这表明酶解温度是艾叶酶协同超声提取工艺中的关键变量。

根据Design-Expert13.0软件拟合的艾叶酶协同超声提取工艺最优条件，结合实际操作可行性考虑，对预测的最优提取工艺参数进行微调，即得酶用量3.5%、酶解温度55 ℃、酶解时间75 min、超声时间40 min为最优提取工艺参数。

2.3 工艺验证试验

按响应面试验设计所得最佳提取工艺参数提取3份艾叶，对工艺进行验证。分别测定其黄酮、酚酸、多糖、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸、异泽兰黄素和棕矢车菊素含量，并计算其AHP-EWM法的综合评分，3份样品的平均综合评分为96.65（RSD=1.44%，n=3），结果见表7，与模型预测值98.75的偏差为2.13%，表明模型预测性较好。

2.4 艾叶提取液抗氧化活性检测结果

艾叶提取液抗氧化活性检测结果见图5。由图5可知，不同质量浓度的艾叶提取液对DPPH·和OH·具有不同的清除效果，但均低于相同质量浓度下VC的清除能力。艾叶提取液对DPPH·的清除能力在20~140 mg/mL质量浓度范围内，存在一定的剂量效应关系，艾叶提取液和VC质量浓度为140 mg/mL时，对DPPH·的清除率分别为73.48%±1.03%、91.36%±2.98%，艾叶提取液对DPPH·的IC₅₀为（45.00±1.43） mg/mL；艾叶提取液和VC质量浓度为175 mg/mL时，对OH·的清除率分别为80.73%±1.20%、93.01%±3.03%，艾叶提取液对OH·的IC₅₀为（47.51±1.14） mg/mL。

2.5 艾叶提取液抑菌活性检测结果

艾叶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌作用效果见图6。由图6知，艾叶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果，且随着质量浓度的增加抑菌圈的直径逐渐变大。当艾叶提取液质量浓度为4.00 g/mL时，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为（15.20±0.40） mm、（14.10±0.20） mm、（13.16±0.18） mm。

由表8可知，艾叶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.25、0.50、0.50 g/mL。综合图6和表8可知，艾叶提取液对3种试验菌的抑制活性为：金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>枯草芽孢杆菌。

3 结论与讨论

基于AHP-EWM综合评分法，对艾叶酶协同超声提取工艺进行优化，通过响应面法优化得到的最佳工艺条件稳定可靠，验证了酶协同超声技术用于艾叶多成分综合提取的可行性。最佳提取工艺条件为纤维素酶用量3.5%、酶解温度55 ℃、酶解时间75 min和超声时间40 min。在此工艺条件下，艾叶黄酮质量分数为3.73%±1.23%、酚酸质量分数为3.73%±0.68%、多糖质量分数为1.62%±2.17%、3， 5-O-二咖啡酰奎宁酸质量分数为（4.60±0.55） mg/g、绿原酸质量分数为（1.66 ±3.64） mg/g、异泽兰黄素质量分数为（2.27±3.76） mg/g和棕矢车菊素质量分数为（0.69±3.62） mg/g。

与现有研究的对比发现，测得的艾叶有效部位或有效成分的含量与某些文献报道相当或略低。如张小凤等^［2］采用80%乙醇超声提取测得艾叶黄酮含量为3.53%，与本研究结果相当；赫丁轩等^［28］以1-丁基-3-甲基咪唑溴盐（［C₄mim］Br）乙醇水溶液作为离子液体超声提取，艾叶黄酮的含量为14.36%，高于本试验；也有采用超声辅助双水相提取艾叶总黄酮的报道^［29］，含量差别较大，多糖、酚酸等其他指标成分也差别较大。本研究的核心亮点与研究价值并不在于追求单一成分的极限含量，相较于以往大多聚焦于单一活性成分的提取研究，本研究的创新性与意义在于采用了“多指标综合评价”的优化理念，更契合天然药物多成分协同作用的物质基础，其目标是获得一个各种活性成分总体得率更优、更为均衡的提取物，而非某个单一成分的“冠军”；建立并验证了AHP-EWM主客观结合的权重分配方法，使工艺优化过程更为科学、合理，避免了单一赋权法可能带来的偏差，为复杂体系的工艺评价提供了方法学参考。

本研究明确了优化工艺条件下制得的艾叶提取液具备良好的体外抗氧化与抑菌双重生物活性，其对DPPH·和OH·的清除率分别为73.48%±1.03%、80.73%±1.20%，IC₅₀值分别为（45.00±1.43） mg/mL和（47.51±1.14） mg/mL；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有显著抑制效果，可为其后续综合开发利用提供依据。

同时，本研究也存在一些有待深入探讨的问题：不同文献间艾叶活性成分含量差异较大，这除与提取方法本身有关外，可能更深刻地受原料产地、采收季节及储存条件等复杂因素的影响，导致不同研究间的横向对比存在困难。此外，个别成分，如绿原酸、棕矢车菊素含量测定结果的标准差相对较大，提示提取工艺或分析方法的稳定性有待进一步提高。

基于此，未来应首先在固定原料批次的前提下，系统比较本研究建立的酶协同超声法与传统方法在多指标成分综合得率及生物活性上的优劣。其次，应深入探究艾叶中各活性成分在抗氧化、抑菌过程中的相互作用是简单的叠加还是存在协同增效。最后，推动本研究所得艾叶提取物向天然防腐剂、功能性化妆品添加剂或植物源抗菌剂等实际应用方向进行转化研究。

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