氧化克班宁促进人乳腺癌MCF‑7细胞微管解聚的机制研究

Study on the mechanisms of promoting microtubule depolymerization by oxocrebanine in human breast cancer MCF‑7 Cells

摘要

目的 探究氧化克班宁通过Rho/ROCK信号通路，促进人乳腺癌MCF‑7细胞微管解聚的作用机制。 方法 首先采用免疫荧光法，研究氧化克班宁对MCF‑7细胞骨架关键蛋白F‑actin的影响；其次，采用Western Blot法检测氧化克班宁作用MCF‑7细胞后，F‑actin的蛋白表达水平、Rho/ROCK信号通路关键性蛋白Rho A、ROCK1和ROCK2的蛋白表达水平，以及经氧化克班宁和抑制剂GSK429286A联用处理后，MCF‑7细胞内Rho/ROCK下游蛋白MYPT和LIMK的磷酸化水平。 结果 氧化克班宁作用MCF‑7细胞48 h后，与空白对照组相比，F‑actin蛋白荧光强度逐渐降低，F‑actin蛋白表达水平显著降低（P<0.01），Rho A、ROCK1和ROCK2蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；氧化克班宁与抑制剂GSK429286A联用，MCF‑7细胞内pMYPT1及pLIMK1蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。 结论 氧化克班宁可破坏细胞骨架，干预Rho/ROCK通路，调控其下游蛋白MYPT和LIMK磷酸化水平，促进微管解聚，抑制人乳腺癌MCF‑7细胞生长。

Abstract

Objective This paper explores the mechanism of oxocrebanine in promoting microtubule depolymerization of human breast cancer MCF‑7 cells through the Rho/ROCK signaling pathway. Methods Firstly， immunofluorescence was used to study the effect of oxocrebanine on F‑actin， a key protein in the skeleton of MCF‑7 cells. Secondly， the Western Blot method was used to detect the protein expression levels of F‑actin and Rho A， ROCK1 and ROCK2， key proteins of the Rho/ROCK signaling pathway. At last， the phosphorylation level of Rho/ROCK downstream proteins MYPT and LIMNK were detected by Western Blot method while MCF‑7 cells were treated with GSK429286A and oxocrebanine. Results After MCF‑7 cells were treated with oxocrebanine for 48 h， the fluorescence intensity of F‑actin protein gradually decreased， the expression level of F‑actin protein was also significantly reduced （P<0.01）， and the expression levels of Rho A， ROCK1 and ROCK2 protein were significantly reduced （P<0.01）. After MCF‑7 cells were treated with GSK429286A and oxocrebanine， the phosphorylation levels of MYPT and LIMK， Rho/ROCK downstream proteins， were reduced in a dose‑dependent manner （P<0.01）. Conclusion Oxocrebanine can destroy the cytoskeleton， interfere in the Rho/ROCK pathway， regulate the phosphorylation levels of its downstream proteins MYPT and LIMK， promote microtubule depolymerization and inhibit human breast cancer MCF‑7 cells growth.

Graphical abstract

关键词

海南地不容 / 氧化克班宁 / MCF‑7细胞 / 微管 / Rho/ROCK通路

Key words

Stephania hainanensis H. S. Lo et Y. Tsoong / Oxocrebanine / MCF‑7 cell line / Microtubule / Rho/ROCK pathway

黎族在海南岛有3 000多年的悠久历史，善于识别和使用天然药用植物，在与疾病的斗争中积累和传承了一套治疗经验，形成了独特的黎族医药文化。黎族传统药物海南地不容为防己科植物海南地不容（Stephania hainanensis H. S. Lo et Y. Tsoong） 的块根，分布于海南省白沙、琼中、儋县等地，又名金不换、山乌龟，味苦性寒，具有清热解毒、抗菌抗炎、消肿止痛等功效^［1‑4］。海南地不容主要含有异喹啉型生物碱、阿朴菲型生物碱、原小檗碱型生物碱和吗啡型生物碱，这些生物碱具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥、抗血小板凝集等多种生物活性^［5‑7］。

美国癌症协会期刊CA发布的2023年癌症报告指出，乳腺癌仍居女性癌症患病率首位，且每年增加约0.5%^［8］。抗乳腺癌药物与乳腺癌细胞特定位点相结合，诱导细胞自噬、凋亡和周期阻滞，抑制乳腺癌细胞的生长、增殖和转移。课题前期从海南地不容分离得到了阿朴菲类生物碱—氧化克班宁（oxocrebanine， Oxo），经MTT和CCK8细胞毒性试验，发现氧化克班宁对人乳腺癌MCF‑7细胞生长有抑制作用，IC₅₀为16.66 µmol/L^［9］。氧化克班宁作为双重拓朴异构酶抑制剂，嵌入DNA，诱发MCF‑7细胞阻滞在有丝分裂期。氧化克班宁可作用于秋水仙碱位点，下调STAT3、PAK1、CAMK4和PKA蛋白的表达，从而破坏微管结构及微管蛋白动态平衡，促进MCF‑7细胞的微管解聚^{［10，11］}。但是，氧化克班宁促进MCF‑7细胞微管解聚的具体机制有待进一步探究。

经查阅文献可知，F‑actin可以与其他肌动蛋白结合蛋白（如筋膜蛋白）相互作用，也可以与肌动蛋白核蛋白通过分支交联形成更大的结构，是细胞骨架的重要组成部分^［12］。促进微管动力的关键因子Stathmin蛋白，通过激活Rho A/ROCK信号通路和重组F‑actin进而影响微管动态平衡，在微管解聚过程中起到调控作用。Rho家族是一组小的GTPase，在调节Rho下游肌动球蛋白细胞和骨架重排中起着重要作用^［13］。本论文在前期研究基础之上，旨在探究氧化克班宁是否引起F‑actin重组来破坏微管动态平衡，是否激活RhoA/ROCK通路进而促进微管解聚，同时观察氧化克班宁或通路抑制剂GSK429286A作用后，Rho/ROCK通路下游蛋白MYPT和LIMK磷酸化情况，阐明氧化克班宁促进微管解聚，抑制人乳腺癌MCF‑7细胞生长的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MCF‑7细胞由哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心提供；氧化克班宁（Oxocrebanine，98%）由海南医学院张小坡教授惠赠；紫杉醇（B21695，上海源叶生物科技有限公司），N，N´‑亚甲基双丙烯酰胺（BA09167173，博奥森生物集团有限公司），Triton‑X‑100（V900502，南通锦莱化工有限公司），彩色预染蛋白marker（MA0342，大连美伦生物），Tween‑20（S0901C，大连美伦生物科技有限公司），蛋白浓度测定试剂盒（P0006C，碧云天生物科技有限公司），SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液（P0015，碧云天生物科技有限公司），Rabbit Anti‑GAPDH （bsm‑33033M，博奥森生物集团有限公司），Rabbit Anti‑Rho A （WL02853，万类生物科技有限公司），Rabbit Anti‑ROCK1 （WL01761，万类生物科技有限公司），Rabbit Anti‑ROCK2 （WL00550，万类生物科技有限公司），Rabbit Anti‑pMYPT1 （bs‑20264R，博奥森生物集团有限公司），Rabbit Anti‑pLIMK1 （bs‑18256R，博奥森生物集团有限公司），FITC标记山羊抗兔IgG （bs‑0295G‑FITC，博奥森生物集团有限公司），Rabbit Anti‑F‑actin （bs‑1571R，博奥森生物集团有限公司）；荧光显微镜（德国LEICA公司），垂直电泳转印槽（DYCZ‑40D，北京六一生物技术有限公司），电泳仪（DYY‑7C，北京六一生物技术有限公司），凝胶成像系统（ImageQuant LAS500，GE美国通用电气公司）。

1.2 方法

1.2.1 荧光显微镜和Western Blot法检测氧化克班宁对MCF‑7细胞内F‑actin的影响

氧化克班宁给药浓度为8.33、16.66、33.32 µmol/L，阳性药紫杉醇（Taxol）的浓度为6.80 µmo/L，作用MCF‑7细胞48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1% TritonX‑100透化30 min，1 mL小牛血清白蛋白封闭2 h，F‑actin抗体4 ℃孵育过夜，FITC标记的山羊抗兔IgG，室温避光结合2 h，PBS洗三次后，荧光显微镜下观察各组MCF‑7细胞内F‑actin蛋白的分布，并拍照记录。

Western Blot实验中氧化克班宁及紫杉醇给药浓度同上，作用MCF‑7细胞48 h后，提取蛋白。蛋白样品经10% SDS‑PAGE电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶中封闭60 min，加入兔抗F‑actin一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，加入二抗孵育60 min；TBST洗3次，ECL发光成像系统显影，采用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析。

1.2.2 Western Blot法测定Rho/ROCK信号通路关键蛋白表达的变化

抗体：稀释比例均为1∶500的Rho A、ROCK1和ROCK2的一抗稀释液，其他步骤同1.2.1。

1.2.3 Western Blot法比较氧化克班宁与GSK429286A对Rho/ROCK信号通路下游蛋白的影响

给药组分别为氧化克班宁16.66 μmol/L、GSK429286A40 μmol/L以及二者联合组（氧化克班宁+ GSK429286A，Oxo+GSK），空白对照组每孔加同体积RPMI 1640培养基，培养48 h。抗体：稀释比例均为1∶500的p‑MYPT1及p‑LIMK1一抗稀释液，其他步骤同1.2.1。

1.2.4 统计学处理

采用SPSS for Windows 21.0软件对数据进行分析处理。多样本组间均数比较采用单因素方差分析（One‑Way ANOVA）和LSD多重比较分析法进行。P<0.01 具有显著性差异。

2 结果

2.1 氧化克班宁对乳腺癌MCF‑7细胞F‑actin的影响

免疫荧光法分析氧化克班宁作用于MCF‑7细胞48 h后F‑actin蛋白的变化，如图1所示，对照组MCF‑7细胞整体清晰明亮，轮廓清晰，结构完整，F‑actin规律分布在细胞中，阳性药组MCF‑7细胞的荧光强度较弱，氧化克班宁组MCF‑7细胞的荧光逐渐降低。Western Blot结果显示，氧化克班宁作用MCF‑7细胞48 h后，与空白对照组相比，F‑actin蛋白表达水平呈浓度依赖性下降趋势（图2A，P<0.01）。

2.2 Western Blot法测定Rho/ROCK信号通路关键蛋白表达的变化

2.2.1 氧化克班宁对乳腺癌MCF‑7细胞Rho A的影响

如图2B所示，氧化克班宁作用MCF‑7细胞48 h后，与空白对照组相比，Rho A蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。而6.80 μmol/L的Taxol作用后，MCF‑7细胞内的Rho A表达量同样显著减少（P<0.01）。

2.2.2 氧化克班宁对乳腺癌MCF‑7细胞ROCK1和ROCK2的影响

如图2C、D所示，氧化克班宁各浓度作用MCF‑7细胞48 h，与空白对照组相比，ROCK1和ROCK2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；6.80 μmol/L的Taxol作用后，MCF‑7细胞内的ROCK1和ROCK2蛋白表达量同样显著减少（P<0.01）。

2.3 氧化克班宁对Rho/ROCK信号通路下游蛋白MYPT和LIMK的影响

如图2E、F所示，与空白对照组相比，GSK组和Oxo组MCF‑7细胞内pMYPT1及pLIMK1蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），当二者联合作用时（GSK+Oxo组），蛋白灰度值降低最明显（P<0.01）；与GSK组比较，氧化克班宁单独使用或与GSK联合使用均可显著降低pMYPT1及pLIMK1蛋白表达水平（P<0.01）。

3 讨论

氧化克班宁为黎药海南地不容抗乳腺癌活性成分，经课题组前期研究发现，氧化克班宁能够作用于微管蛋白的秋水仙碱位点，抑制微管调控蛋白STAT3、PAK1、CAMK4和PKA的表达。同时，氧化克班宁还可以破坏微管蛋白平衡，进而引发乳腺癌MCF‑7细胞有丝分裂灾难。本研究进一步探究氧化克班宁通过Rho/ROCK信号通路，促进微管解聚，抑制人乳腺癌MCF‑7细胞生长的作用机制。

F‑actin是具有活性的微丝蛋白多聚体，在不同时间和空间其组装形态和功能不同，这取决于细胞外环境的变化^［14］。实验结果发现，氧化克班宁可改变乳腺癌MCF‑7细胞微丝骨架F‑actin的分布，随着给药剂量增加，荧光强度逐渐减弱，同时氧化克班宁以浓度依赖性的方式降低F‑actin蛋白表达。细胞骨架蛋白F‑actin和其他肌动蛋白结合蛋白之间的相互作用，进而产生机械力，微管结构也受控于肌动蛋白^{［15，16］}。实验结果提示，氧化克班宁可以破坏细胞骨架，而作为细胞骨架的另一重要成分微管也会受到影响。因此，氧化克班宁破坏微管动态平衡，可能是其促进MCF‑7细胞微管解聚的机制之一。

RhoA蛋白在乳腺癌细胞中的表达量明显高于正常乳腺细胞，因此RhoA蛋白表达增加与细胞异常生长有密切关系。Rho A可在GTP结合态和GDP结合态之间的相互交换，并从活性态变为非活性态。Rho A及其下游效应物，如Rho A相关蛋白激酶（ROCK）和肌球蛋白轻链（MLC），与细胞骨架重组、平滑肌收缩、细胞运动、细胞增殖和蛋白表达等多种细胞生物学功能密切相关。RhoA、ROCK蛋白在乳腺癌细胞间形成连接，影响乳腺癌细胞的转移、增殖^{［17，18］}。实验结果提示，氧化克班宁可显著降低Rho/ROCK信号通路RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白表达量，表明氧化克班宁可抑制Rho/ROCK信号通路，这也可能是氧化克班宁促进MCF‑7细胞微管解聚的机制之一。

MYPT及LIMK均是ROCK的已知基质，为Rho/ROCK信号通路下游效应蛋白，ROCK的活化水平也正相关影响MYPT及LIMK的磷酸化水平^{［19，20］}。本实验结果发现，氧化克班宁抑制MCF‑7细胞pMYPT1和pLIMK1蛋白表达，抑制剂GSK429286A和氧化克班宁两者联合作用时，对MYPT1及LIMK1蛋白磷酸化水平的抑制作用更强，再次验证氧化克班宁对Rho/ROCK信号通路的抑制作用。LIMK1主要参与肿瘤细胞的侵袭迁移过程，其磷酸化作用可引起细胞骨架肌动蛋白动力学变化及微管解聚^［21］。实验结果提示，氧化克班宁干预RhoA/ROCK信号通路，通过抑制MYPT1和LIMK1蛋白的磷酸化水平，进一步与F‑actin产生交联，加剧促进微管解聚。

综上所述，黎药海南地不容抗乳腺癌活性成分氧化克班宁下调骨架蛋白F‑actin的表达，抑制Rho/ROCK信号通路，降低MYPT1及LIMK1蛋白磷酸化水平，破坏微管动态平衡，促进微管解聚，最终抑制人乳腺癌MCF‑7细胞的生长。氧化克班宁作为微管抑制剂，是一种很有前途的新型抗乳腺癌先导化合物。

作者贡献度说明：

闫彩凤：完成实验，于蕾、闫彩凤：文章撰写，于晶涵、马瑗晗：数据统计分析。宋辉、郎朗、王正文：手稿修改、润色、最终审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金项目(820RC776)

海南省卫生健康科技创新联合项目(WSJK2024MS162)

2021年哈尔滨商业大学教师“创新”项目支持计划项目(LH2020H070)

黑龙江省中医药科研课题项目(ZHY2024‑098)