基于16S rDNA高通量测序研究电针对控制性超排卵小鼠肠道菌群的调节作用

Modulation of intestinal microbiota in mice with controlled ovarian hyperstimulation by electroacupuncture: A study based on 16S rDNA high‑throughput sequencing

摘要

目的 采用16S rDNA高通量测序技术分析电针对控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）小鼠肠道菌群物种相对丰度和多样性的影响，探讨电针提高体外受精‑胚胎移植临床妊娠率的潜在机制。 方法 选取27只周期规律的雌鼠按随机数字表分为自然周期组、COH组和电针组，每组9只，采用控制性促排卵方案制备动物模型，电针组于绒促性素注射日行电针治疗，选取关元、中极、三阴交（双侧）穴进行干预，连续波，频率2 Hz，每天1次，每次15 min，自然周期组和COH组不予干预；收取妊娠天数第4天（即种植窗期）各组小鼠粪便进行16S rDNA高通量测序并对其进行物种相对丰度、alpha多样性、beta多样性和基因功能代谢预测分析检测。 结果 自然周期组、COH组和电针组Operational taxonomic units数量分别为1 083、1 135和1 125个；与自然周期组比较，COH组拟杆菌门、疣微菌门、副拟杆菌属、拟杆菌属、拟普雷沃菌属等相对丰度升高，厚壁菌门、乳酸杆菌属、另枝菌属等相对丰度降低；经电针干预后，上述大多数微生物相对丰度均有不同程度改善。与自然周期组比较，COH组的Shannon、Simpson、Chao1指数有所增加；与COH组比较，电针组的Shannon、Chao1指数有所降低，差异无统计学意义（P>0.05）；功能预测分析发现电针能调节参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢等的功能基因。 结论 外源性激素的使用会改变小鼠肠道菌群的结构平衡状态，电针能够调节控制性超排卵小鼠肠道菌群物种相对丰度和菌群多样性。

Abstract

Objective To analyze the effects of electroacupuncture on the relative abundance and diversity of intestinal microbiota species in controlled ovarian hyperstimulation （COH） mice through 16S rDNA high‑throughput sequencing， as well as to investigate its potential mechanism in enhancing the clinical pregnancy rate of in vitro fertilization‑embryo transplantation. Methods A total of 27 cyclic regular female mice were randomly divided into the natural cycle group， the COH group， and the electroacupuncture group， with 9 mice in each group. The animal model was prepared using a controlled ovarian hyperstimulation protocol. In the electroacupuncture group， electroacupuncture treatment was performed on the day of human chorionic gonadotropin injection， targeting the Guanyuan， Zhongji， and Sanyinjiao acupoints with continuous waves at a frequency of 2 Hz， once a day for 15 min each time. The natural cycle group and COH group received no intervention. On the 4th day of pregnancy （the implantation window）， fecal samples from each group of mice were collected for 16S rDNA high‑throughput sequencing， followed by analysis of species relative abundance， alpha diversity， beta diversity， and predicted functional metabolism. Results The numbers of operational taxonomic units in the natural cycle group， COH group， and electroacupuncture group were 1 083， 1 135， and 1 125， respectively. Compared to the natural cycle group， the relative abundance of Bacteroidota， Verrucomicrobiota， Parabacteroides， Bacteroides， and Alloprevotellain the COH group were increased， and the relative abundance of Firmicutes， Lactobacillus， and Alistipes were decreased. After the treatment of electroacupuncture， the above‑mentioned microorganisms showed different degrees of improvement in relative abundance. Compared to the natural cycle group， the Shannon， Simpson， and Chao1 indices of the COH group increased； compared to the COH group， the Shannon and Chao1 indices of the electroacupuncture group decreased， the difference were not statistically significant （P>0.05）. The functional prediction analysis found that electroacupuncture could regulate the functional genes involved in carbohydrate metabolism and amino acid metabolism. Conclusion The administration of exogenous hormones alters the structural equilibrium of intestinal microbiota in mice， while electroacupuncture demonstrates the capability to regulate both the relative abundance of intestinal microbiota species and the overall diversity of microbiota in mice undergoing controlled ovarian hyperstimulation.

Graphical abstract

关键词

控制性超排卵 / 电针 / 肠道菌群 / 高通量测序 / 功能预测

Key words

Controlled ovarian hyperstimulation / Electroacupuncture / Intestinal microbiota / High‑throughput sequencing / Functional prediction

体外受精‑胚胎移植（in vitro fertilization‑embryo transplantation，IVF‑ET）是目前治疗不孕症的主要方案之一，但临床妊娠率不高，电针治疗可提高临床妊娠率。胚泡植入失败是IVF‑ET的最大障碍，期间需要胎母间进行有效对话，人体内肠道菌群主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成，肠道菌群与宿主相伴终生，两者是互利共生的关系^［1］，妊娠后，母体微生态维持在“动态平衡”状态，妊娠期间的一些不良因素可直接影响到母体的肠道菌群，导致胎盘微生态发生改变，进而影响胎儿发育^［2］。研究发现肠道菌群紊乱后，孕鼠的性激素水平和卵巢形态等受到影响，使得死产率增加，造成临床妊娠率低下^［3］。本团队前期研究发现电针可以调控控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）小鼠子宫内膜HOXA10的表达时相，促使其恢复到正常的种植窗期，从而提高临床妊娠率^［4］。故本研究基于前期研究基础，建立COH小鼠模型，观察电针对COH小鼠肠道菌群的影响，为电针在IVF‑ET 中更广泛的应用提供参考借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用周龄为7~8周、体质量30~35 g SPF级昆明纯种性成熟小鼠，购自武汉市春玉红实验动物饲料有限公司［生产许可证号：SCXK（鄂）2020‑0018］，其中雌鼠60只，雄鼠30只（交配用）。放置于江汉大学SPF级动物实验室［实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2021‑0042］进行饲养，设置环境保持每日光照12 h，自由摄食、饮水，室温维持在18~22 ℃，相对湿度60%~80%的环境中。选取27只周期规律的雌鼠按随机数字表分为自然周期组、COH组和电针组，每组9只。本动物实验通过江汉大学学术伦理审查委员会批准（JHDXLL2022‑040）。实验过程中遵循2020年发布的《湖北省实验动物管理条例》。

1.2 主要试剂

绒促性素（HCG，丽珠集团丽珠制药厂，批号：210707）；尿促性素（HMG，丽珠集团丽珠制药厂，批号：211007）；醋酸曲普瑞林注射液［辉凌国际制药（瑞士）有限公司，批号：S14114A］；Universal DNA纯化回收试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP214］；Phusion^® High‑Fidelity PCR Master Mix（美国New England Biolabs公司，货号：M0531S）；NEB Next^® Ultra DNA Library Prep Kit试剂盒（美国Illumina公司，货号：E7370L）。

1.3 主要仪器

韩氏电针仪（HANS‑100A，南京济生医疗科技有限公司）；NovaSeq6000测序仪（美国Illumina公司）；Bio‑rad T100梯度PCR仪（美国Bio‑rad公司）。

1.4 模型制备

参考文献［5］，制备COH小鼠模型。每天9∶00腹腔内注射醋酸曲普瑞林注射液（每100 g体质量注射0.4 μg），连续9 d；用药5 d后显微镜下观察阴道脱落细胞涂片，小鼠动情周期出现紊乱，提示垂体抑制，第9天同时注射尿促性素（HMG，每100 g 体质量注射10 U）1次，进行Gn启动；48 h后注射绒促性素（HCG，每100 g体质量注射100 U），随后按照雌雄1∶1比例于当日16∶00进行合笼，次日8∶00观察雌鼠阴栓情况，见阴栓为孕第1天。

1.5 干预方法

采取仰卧位胶带固定，选择华佗牌0.16 mm×7 mm美容针灸针，选穴标准参考《实验针灸学》^［6］，取关元（脐后方1 cm处）、中极（约脐后方1.3 cm处）、双侧三阴交（后肢内踝尖上0.5 cm处）施以针刺，进针深度2 mm，HANS‑100A韩氏电针仪正负电极分别连接关元、中极穴处针柄，选择连续波，频率2 Hz，电流强度1 mA，电针刺激15 min；三阴交常规针刺。于HCG注射日开始行电针治疗，每天1次（时间选择为9∶00），至种植窗期（孕第4天）施术后停止治疗。自然周期组和COH组小鼠不行电针治疗。

1.6 16S rRNA基因测序检测各组小鼠肠道菌群

电针治疗结束后当天，收集各组小鼠新鲜粪便3粒，放入提前标记好的无菌冻存管中，经液氮速冻后放置于-80 ℃冰箱中备测^［7］。采用CTAB法提取小鼠粪便的基因组DNA，检测DNA的纯度和浓度；运用Phusion^® High‑Fidelity PCR Master Mix和EX Taq高保真酶进行PCR实验，采用16S rDNA对V3‑V4区域进行测序，其反应程序为98 ℃×1 min，98 ℃×10 s，50 ℃×30 s，72 ℃×30 s，30个循环，72 ℃×5 min。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板进行扩增，再次检测PCR产物，使用Universal DNA纯化回收试剂盒回收目的条带的产物。使用NEB Next^® Ultra DNA Library Prep Kit试剂盒构建文库，运用Q‑PCR定量和安捷伦生物分析仪5400进行检测；待文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。

1.7 生物信息分析

测序完成后，对每个样本的reads进行拼接得到原始Tags数据，并对其进行严格的过滤处理，得到高质量的Tags数据，参照Qiime软件的Tags质量控制流程获得最终的有效数据。使用Uparse软件，根据97%序列相似性原则，对所有样本的有效数据进行Operational taxonomic units（OTUs）聚类，并对其进行物种注释，研究不同样本中优势种属的差异和群落构成；使用Qiime软件分析各样本的复杂度，计算各组之间的Shannon、Simpson和Chao1等指数；使用R软件绘制群落结构图、稀释曲线、物种累积曲线等；选用主坐标分析（PCoA）比较各种样本间肠道菌群的组成差异；使用LEfSe软件对数据进行LEfSe分析；使用Tax4Fun软件进行功能基因预测。

1.8 统计学处理

使用SPSS 26.0软件进行统计学分析；多组间比较时采用单因素方差分析，运用Tukey和SNK法进一步作两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肠道微生物OTUs Venn图分析

本试验共得到1 335个OTUs，自然周期组、COH组、电针组所共有的OTUs为878个，自然周期组独有59个OTUs，COH组独有76个OTUs，电针组独有70个OTUs。COH组与自然周期组相比有182个不同的OTUs；而电针组与COH组相比，则具有141个不同的OTUs。这表明，COH模型小鼠肠道菌群组成出现明显变化，而经电针治疗后，这个变化得到了改善，见图1。

2.2 电针对COH小鼠肠道微生物多样性的影响

2.2.1 Alpha多样性指数分析

2.2.1.1 Specaccum物种累积曲线

3组小鼠共采集了27个样本，随着样本量的增加Specaccum物种累积曲线趋向平缓，表明此环境中的物种随着样本量的增加并不会明显增多，提示本次实验抽样充分，符合数据分析要求，见图2。

2.2.1.2 Alpha多样性指数

Shannon指数反映肠道菌群多样性，其指数越大说明物种群落多样性越高、物种分布越均匀；Simpson指数表征群落内物种分布的多样性和均匀度；Chao1指数估计群落样品物种总数即反映群落丰富度。自然周期组的Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数低于COH组（P>0.05）和电针组（P>0.05）；与COH组相比，电针组的Shannon指数和Chao1指数有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2.2 Beta多样性分析

使用Weighted UniFrac距离进行PCoA分析。主坐标（PC1）解释了数据方差的36.23%，主坐标2（PC2）解释了26.59%，各组之间呈现一定程度的分离，提示各组小鼠肠道菌群结构上存在差异，见图3。

2.3 菌群结构差异分析

2.3.1 门水平差异分析

3组小鼠主要鉴定出10个门的微生物，均以拟杆菌门、厚壁菌门为主，其丰度占据了92.66%以上，其它菌门占比较小，见图4。与自然周期组比较，COH组拟杆菌门（Bacteroidota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、梭杆菌门（Fusobacteriota）等相对丰度增高，但差异无统计学意义（P>0.05），厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）等相对丰度降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；与COH组比较，电针干预后厚壁菌门（Firmicutes）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）等相对丰度增高，但差异无统计学意义（P>0.05），拟杆菌门（Bacteroidota）、蓝菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）等相对丰度有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3.2 属水平差异分析

属水平上，与自然周期组比较，COH组副拟杆菌属（Parabacteroides）、拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度增加（P<0.05），矛杆菌属（Muribaculum）、幽门螺旋菌属（Helicobacter）拟普雷沃菌属（Alloprevotella）等相对丰度有所增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度降低（P<0.05），另枝菌属（Alistipes）、臭杆菌属（Odoribacter）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）等相对丰度有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；经电针干预后，与COH组比较，电针组臭杆菌属（Odoribacter）相对丰度增加（P<0.05），乳酸杆菌属（Lactobacillus）等有所增加，但差异无统计学意义（P>0.05）；副拟杆菌属（Parabacteroides）、幽门螺旋菌属（Helicobacter）、拟杆菌属（Bacteroides）等相对丰度有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05），见表3、图5。

2.4 LEfSe差异分析

运用LEfSe法对3组小鼠的肠道菌群进行比较，挖掘各组间显著性差异影响的菌群。3组小鼠一共筛选出17个从门到属的差异物种，其中自然周期组优势菌种有肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、肠球菌科（Enterococcaceae）、肠球菌属（Enterococcus）等；COH组优势菌种有拟杆菌属（Bacteroides）；电针组优势菌种有非固醇菌原体目（Acholeplasmatales）、拟杆菌属肠杆菌（Bacteroides caecimuris）、厌氧支原体属（Anaeroplasma）等，见图6、7。

2.5 电针对COH小鼠肠道菌群功能预测分析

进一步分析肠道菌群可能引起的功能变化，采用Tax4Fun软件对3组小鼠的肠道菌群进行KEGG功能预测。结果注释到前10条的功能富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、细胞成长与死亡、细胞活性、癌症：概述、老化、心血管疾病、癌症：特定类型和其他，见图8。

3 讨论

针灸防治疾病的起效机制是多层次、多靶点的复杂网络关系^［8］。中医认为，在IVF‑ET中，超促排卵诱发多个卵细胞发育成熟，使得肾精耗损，封藏失司，导致精血不足，冲任失调，胞脉失养，致使难以摄精成孕^［4］。针灸辅助IVF‑ET是在“肾气‑天癸‑冲任‑胞宫”生殖轴的理论指导下，多选择关元、中极和三阴交等穴为临床治疗的常用穴位^［9］，三穴均为肾、肝、脾经的交会之穴，其中关元属任脉，有调理冲任、健脾补肾益精等作用，中极属任脉，有调理冲任、益肾兴阳等作用，三阴交属足太阴脾经，有健脾补肝肾、调理冲任气血等作用。一项临床实验研究发现经皮穴位电刺激关元、中极和三阴交等穴，可上调IVF‑ET患者血清及卵泡液中脑源性神经营养因子的表达，提高优胚率和临床妊娠率^［10］；本课题组前期研究也发现选取此穴位组合可促进COH小鼠的子宫内膜分泌IGF‑1^［11］、调控子宫内膜HOXA10的表达时相^［4］等来提高临床妊娠率；因此，本实验选用关元、中极和三阴交为针刺施治的穴位。近年来热点研究发现不孕症的发生发展伴随着肠道菌群微生态紊乱^［12］，一些研究认为肠道微生物是一种内分泌器官，可以影响远处器官和相关的生物学途径^［13］，其中代谢因素最常与不孕症相关^［14］。基于此，本研究以“肠道‑胞宫”生殖轴为切入点，探讨电针提高临床妊娠率与肠道菌群之间的关系。

Alpha多样性指数可以反映样本内肠道菌群的多样性和丰富度。本研究显示外源性激素的使用能使肠道菌群多样性增多，COH组和电针组的Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数都高于自然周期组，说明外源性激素的使用可以使自然周期小鼠的肠道菌群发生明显变化。研究发现，3组小鼠肠道中优势菌群的种类虽未见明显改变，均以拟杆菌门和厚壁菌门为主，但各菌群间的比例均发生了一定改变；这一结果与莫毅等^［15］的研究结果相似。本研究中自然周期组独特的OTUs低于COH组和电针组的数目，可以预测外源性激素的使用增加了小鼠肠道菌群中独特的OTUs；进一步对3组OTUs作Weighted UniFrac的PCoA分析，仅考虑有进化的物种序列，3组小鼠的肠道菌群在结构上存在差异。

高水平的雌激素水平与更多的拟杆菌门和较少的厚壁菌门相关^［16］，外源性激素的使用对小鼠肠道的优势菌属会产生一定的影响，COH小鼠体内拟杆菌属和拟普雷沃菌属呈现增多趋势，乳酸杆菌属呈现明显降低趋势，与拟杆菌属和拟普雷沃菌属状态相反；经电针干预后COH小鼠肠道菌群中臭杆菌属呈现上升趋势；研究发现臭杆菌属的缺失会导致母体内短链脂肪酸可用性降低，致使宿主出现炎症^［17］，GnRH拮抗剂方案患者子宫内膜容受性降低与炎症异常有关^［18］，而子宫内膜容受性降低是导致临床妊娠率低下的主要因素^［19］。3组小鼠的优势菌属如另枝菌属、拟杆菌属等菌属中部分为条件致病菌及代谢相关细菌，这可能与胚胎着床后出现的炎性微环境及代谢状态的变化有关。

进一步作LEfSe分析，结果显示3组小鼠肠道菌群从门到属的差异物种共有17个；随后对各组相同菌门的细菌进行合并，自然周期组具有4个明显差异的特征性肠道菌群，COH组有1个，电针组有5个；其中，与代谢相关的细菌共有11种，包括大肠埃希氏菌、粪肠球菌、塔姆兹菌、单球菌、瘤胃球菌科细菌和黄色发酵芽孢杆菌等。3组中具有差异的特征性菌群均与炎症和代谢状态有关，胚胎着床的成功需要免疫炎性反应和以糖酵解为主导的代谢重编程适时、适度的启动和结束^［20］，因此，电针干预提高IVF‑ET的临床妊娠率可能与针刺后富集抗炎症环境下的某些菌群及自身的益生菌有关，从而改善了COH小鼠异常的代谢状态。

本研究中，COH组和电针组小鼠中肠道菌群的主要功能为碳水化合物代谢、氨基酸代谢等新陈代谢，这表明了肠道菌群积极参与到小鼠的日常代谢活动。与COH组相比，电针组小鼠肠道菌群内碳水化合物代谢、氨基酸代谢通路中功能基因的相对丰度增加，提示外源性激素的使用导致小鼠肠道菌群出现紊乱，从而影响到机体内的碳水化合物代谢和氨基酸代谢，而电针干预后能调节COH小鼠体内与碳水化合物代谢、氨基酸代谢的功能基因的丰度，从而对COH小鼠的胚胎着床产生影响。研究发现肠道菌群及其代谢产物可能会在胚胎着床过程中影响子宫内膜^［21］；碳水化合物代谢对卵母细胞的生长、成熟和发育能力是至关重要的^［22］；氨基酸是给身体提供能量的必需物质之一，具有维持人体正常免疫能力等作用；机体内肠道菌群的改变可影响相关氨基酸的代谢，而氨基酸代谢的改变亦可导致肠道菌群组成等发生相应的改变^［23］；在生殖领域，不同的氨基酸水平变化与胚胎发育及妊娠结局存在关联^［24］，这与本研究结果类似。

综上所述，本研究分析了外源性激素的使用导致小鼠肠道菌群组成和相对丰度的变化，经电针干预后，上述大多数肠道菌群的相对丰度均出现不同程度的改善。由此可推测，电针改善COH小鼠临床妊娠率与肠道菌群有关，但电针是如何改善肠道菌群的表达，还需进一步深入研究。

作者贡献度说明：

张磊：实验设计，数据收集，执笔撰写；刘锐：实验设计，数据分析；刘小亚、明浩、王东：动物实验，数据收集；朱书秀：审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(81674060)

江汉大学校级科研项目资助计划(2021yb142)