白杨素通过抑制铁死亡减轻脑出血后神经损伤

Chrysin attenuates nerve damage after intracerebral hemorrhage by inhibiting ferroptosis

摘要

目的 探讨白杨素在大鼠脑出血模型中以铁死亡作为药物靶点对脑出血后神经损伤的影响。 方法 采用随机数字表法，将66只健康雄性SD大鼠分为Sham组（假手术组）、ICH组（脑出血模型组）和ICH+Chrysin组（脑出血模型+白杨素组），每组22只。将大鼠自体尾静脉血注入尾状核建立脑出血模型，Sham组以等量生理盐水代替自体尾静脉血。模型建立后6 h进行Z‑longa评分，ICH+Chrysin组连续灌胃给药3 d，Sham组与ICH组给予等量生理盐水。采用HE、Nissl染色以及透射电镜观察脑组织和海马神经元形态学变化； 试剂盒检测Fe²⁺、GSH、MDA、SOD含量；蛋白质印迹法检测海马组织ACSL4、GPX4、FTL、IL‑1β和TNF‑α的表达。 结果 （1）与Sham组比较，ICH组Z‑longa评分明显升高，脑组织和海马神经元明显损伤，海马CA1和CA3区神经元活细胞比率降低，组间差异均有统计学意义（P<0.01）；而ICH+Chrysin组较ICH组脑组织和海马神经元损伤减轻，海马CA1和CA3区神经元活细胞比率增加，组间差异均有统计学意义（P<0.01）。（2）与Sham组比较，ICH组Fe²⁺、MDA、ACSL4、IL‑1β和TNF‑α表达明显增高，GSH、SOD、GPX4和FTL表达明显下降，组间差异均有统计学意义（P<0.01）；而ICH+Chrysin组较ICH组Fe²⁺、MDA、ACSL4、IL‑1β、TNF‑α、GSH、SOD、GPX4和FTL表达逆转，组间差异均有统计学意义（P<0.01）。 结论 白杨素通过抑制铁死亡减轻大鼠脑出血后神经损伤。

Abstract

Objective To investigate the effect of chrysin on nerve injury after intracerebral hemorrhage in rats with ferroptosis as the drug target. Methods A total of 66 healthy male SD rats were divided into the Sham group （sham operation group），the ICH group （intracerebral hemorrhage model group） and the ICH+Chrysin group （intracerebral hemorrhage model + Chrysin group）， with 22 rats in each group. The autologous tail vein blood was injected into the caudate nucleus to establish a model of intracerebral hemorrhage， and the same amount of isotonic saline was used to replace the autologous tail vein blood in the Sham group. Z‑longa score was performed 6 h after the model was established， and the ICH+Chrysin group was administered by continuous gavage for 3 days， and the same amount of normal saline was given to the Sham group and the ICH group. H＆E and Nissl staining and transmission electron microscopy were used to observe the morphological changes of brain tissue and hippocampal neurons. The contents of Fe²⁺， GSH， MDA and SOD were detected by the kits， and the expressions of ACSL4， GPX4， FTL， IL‑1β and TNF‑α in the hippocampus were detected by Western blotting. Results （1） Compared with the Sham group， the Z‑longa score in the ICH group was significantly increased， the brain tissue and hippocampal neurons were significantly damaged， and the ratio of live cells of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions was decreased， and the differences between the groups were statistically significant （all P<0.01）. Compared with the ICH group， the damage of brain tissue and hippocampal neurons in the ICH+Chrysin group was reduced， and the proportion of live neurons in the hippocampus CA1 and CA3 regions was increased， and the differences between the groups were statistically significant （all P<0.01）. （2） Compared with the Sham group， the expressions of Fe²⁺， MDA， ACSL4， IL‑1β and TNF‑α in the ICH group were significantly increased， and the expressions of GSH， SOD， GPX4 and FTL were significantly decreased in the ICH group， and the differences between the groups were statistically significant （all P<0.01）.Compared with the ICH group，the levels Fe²⁺， MDA， ACSL4， IL‑1β， TNF‑α， GSH， SOD， GPX4 and FTL was reversed， and the differences between groups were statistically significant （all P<0.01）. Conclusion Chrysin attenuates nerve injury after intracerebral hemorrhage in rats by inhibiting ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

脑出血 / 铁死亡 / 白杨素 / 氧化应激 / 炎症

Key words

Intracerebral hemorrhage / Ferroptosis / Chrysin / Oxidative stress / Inflammation

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指非外伤性的、自发的脑实质内血管脆性增加并破裂而引起的出血。ICH约占脑卒中的15%，死亡率近乎50%^［1‑3］。随着历年来ICH发病率的增加，超高的死亡率、严重的并发症、高昂的手术费用以及诸多预后不良表现，造成了严重的社会和家庭负担^［2，4］。而目前ICH患者除了对症治疗以外，仍然没有其他有效的治疗方法，大多数患者仅行血肿清除术，但往往不能得到充分的干预，尽管微创术式清除血肿的方法在临床上取得了一定的进展，但由于合并原发性和继发性损伤，ICH患者的预后仍旧较差^［3，5］。而继发性脑损伤与预后不良密切相关，因此被认为是ICH治疗的潜在靶点，许多研究者将重点放到继发性脑损伤的机制研究上^［6］。

研究发现，ICH发生时，血肿中的红细胞发生裂解，血红蛋白被小胶质细胞和附近浸润的巨噬细胞吞噬并代谢为铁，从而增加铁离子水平，出现铁超载现象。而铁的聚集促进氧化应激、炎症的发生，并且铁可以形成剧毒的羟基自由基来攻击脂质膜、蛋白质和DNA，从而破坏细胞功能并导致神经元死亡^［6，7］。这种铁超载的细胞死亡形式被称为铁死亡，且近年来已有诸多研究证实了铁死亡在神经系统疾病中起至关重要的作用^［8］。因此，作为一个新的治疗靶点，抑制铁死亡对于治疗ICH，减轻ICH后神经损伤、炎症反应十分关键。

白杨素又称5，7‑二羟基黄酮，是一种植物特异性代谢物，也是天然的黄酮类化合物，存在于蜂蜜、蜂胶以及多种植物中^［9，10］。药理学研究发现，白杨素在各种神经系统疾病中表现出神经保护作用，包括癫痫、焦虑、抑郁、帕金森病、阿尔茨海默病、衰老、认知缺陷、神经元细胞凋亡、神经炎症、记忆和海马神经发生耗竭以及脑缺血再灌注损伤等^［9‑17］。因此，本研究通过运用自体血注射法建立大鼠脑出血模型，以铁死亡作为治疗靶点，探讨白杨素是否能够通过抑制铁死亡减轻ICH后神经损伤，从而起到对ICH大鼠的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级Sprague‑Dawley（SD）成年雄性大鼠66只，体质量 220~250 g，购自湖南斯莱克景达科技有限公司。大鼠恒温饲养7 d，以适应环境（12 h 昼夜交替），饲养期间自由进食及饮水，许可证号：SYXK（琼），2022‑0013。动物实验根据国际医学科学组织理事会概述的国际动物研究指导原则进行，实验方案由海南医科大学动物伦理和福利委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

白杨素（上海源叶生物科技有限公司，中国），二甲基亚砜DMSO（YEASEN公司，中国），Fe²⁺、GSH、MDA、SOD试剂盒（Servicebio公司，中国），4%多聚甲醛（Biosharp公司，中国），RIPA高效裂解液（Servicebio公司，中国），BCA定量试剂盒（Servicebio公司，中国），蛋白酶抑制剂（Servicebio公司，中国），ECL超灵敏化学发光检测试剂盒（Biosharp公司，中国），兔抗大鼠GPX4抗体（Abcam，美国），兔抗大鼠IL‑1β抗体（Abcam，美国），兔抗大鼠FTL抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，中国），兔抗大鼠ACSL4抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，中国），兔抗大鼠TNF‑α抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，中国），小鼠抗大鼠GAPDH抗体（Affinity，美国），HRP‑山羊抗小鼠抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，中国），HRP‑山羊抗兔（武汉爱博泰克生物科技有限公司，中国）；石蜡切片机（Leica公司，德国），生物组织烤片机（金华益迪医疗设备有限公司，中国），PowerPac‑Basic 电泳仪（Servicebio公司，中国），PowerPac‑Basic 转印仪（Servicebio公司，中国），酶标仪（Thermo Fisher 公司，美国），全自动化学发光图像分析仪（上海天能科技公司，中国）。

1.3 研究方法

1.3.1 分组与ICH模型建立

SD大鼠共66只，采用随机数字表法将大鼠随机分组。具体分组：（1）Sham组；（2）ICH组；（3）ICH+Chrysin（灌胃给药，50 mg/kg）组^{［18‑21］}；。除Sham组外，其余组通过自体血注射法进行ICH模型建立：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）进行麻醉后俯卧位固定，头部消毒后于头皮正中行纵向切口，钝性分离骨膜，暴露前后囟门及冠状缝，于前囟后方0.2 mm、中线旁开3 mm处用牙科钻钻开一个约1 mm小孔，不伤及硬脑膜及脑组织。于右侧基底节尾状核处两次注入50 μL自体尾静脉血 （间隔2 min）后留针5 min，退针、缝合切口，Sham组于相同位置进针注射等量等渗生理盐水，待大鼠清醒后行Z‑longa 评分法评价，若评分为1~3分则造模成功^{［22‑26］}。

1.3.2 脑组织切片

建模后24 h的SD大鼠，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后依次剪开上腹部皮肤、肋骨，头皮针插入左心室，剪开右心耳，PBS灌注至右心耳流出清亮液体，随后断头，迅速取出完整脑组织，于大鼠脑切片模具上并放入-20 ℃冰箱20 min，按2 mm每层依次切片，并进行拍照。

1.3.3 大鼠神经功能评分

建模后6 h，采用Z‑longa评分，Z‑longa评分制：0分，无神经功能缺陷；1分，患侧前爪不能完全伸展；2分，行走时向患侧转圈；3分，行走时向患侧倾倒；4分，无法行走，存在意识丧失。大鼠评分低于1分或高于3分不进行后续实验。

1.3.4 HE和Nissl染色

各组大鼠麻醉后顺序经心脏灌注生理盐水和4%多聚甲醛，将脑组织于4%多聚甲醛中固定48 h，然后脱水，浸蜡，包埋，切片并进行染色，最后封片保存。将HE、Nissl切片置于光学显微镜下观察以评估形态学变化并采集图像及分析。

1.3.5 透射电镜观察线粒体超微结构变化

麻醉大鼠后，取大鼠海马组织1 mm³，4 ℃置于固定液中过夜，后将组织浸泡在1% 0.1 mol/L磷酸盐缓冲盐水中。将组织脱水，用环氧树脂粘合剂包埋，并使用超微切片机切片成超薄切片。最后将切片染色，并使用电子显微镜成像，采集结果并分析。

1.3.6 Fe²⁺、GSH、MDA、SOD含量检测

建模后24 h，各组大鼠进行麻醉取脑，分离出血侧海马组织，并进行匀浆、离心。取上清液进行Fe²⁺、GSH、MDA、SOD含量的测定，保存结果并进行分析。

1.3.7 蛋白免疫印迹实验（Western Blot）

麻醉各组大鼠，生理盐水灌注后快速取脑，取海马组织匀浆、裂解，高速离心机离心后提取组织上清液。将蛋白质样品（40 μg/泳道）加样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后电转至PVDF膜，5%的脱脂牛奶室温封闭2 h。将PVDF膜转入一抗稀释液中，4 ℃孵育过夜，然后使用相应的二抗稀释液室温孵育2 h，随后用ECL超灵敏化学发光检测试剂盒在全自动化学发光图像分析仪上进行显影并保存结果，使用Image J分析蛋白条带。

1.3.8 统计学方法

使用Graph Pad Prism 8.0（San Diego， CA， USA）对实验数据进行统计学分析，所有数据都进行了Shapiro‑Wilk正态性检验。如果数据呈正态分布，则使用Student’s t检验分析两组之间的差异，而多组之间的差异则使用单因素方差分析（One‑way ANOVA）。若实验数据不符合正态性检验时使用非参数检验，两组之间的差异采用Mann‑Whitney秩和检验，多组之间差异采用Kruskal‑Wallis检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠ICH建模及神经功能缺损评分

用自体血注射法建立大鼠ICH模型，如图1A为建模后脑组织切片显示血肿位于右侧基底节尾状核处，血肿表现明显；与Sham组比较，ICH组大鼠神经功能缺损评分明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），见图1B，表明ICH模型构建成功。

2.2 白杨素改善ICH大鼠的脑组织及海马神经损伤

采用HE和Nissl染色，观察白杨素对ICH大鼠脑组织和海马神经元形态学变化的影响。在Sham组中，大鼠脑组织结构完整，存在大量尼氏体，无炎性细胞浸润，海马CA1和CA3区的神经细胞形态体积正常、细胞质完整。然而，在ICH组中出血部位周围脑组织结构不完整、坏死严重，尼氏体明显减少，可见大量红细胞，炎症细胞浸润，水肿明显，海马CA1和CA3区的神经细胞表现出不规则的形态，细胞质收缩、核固缩和细胞计数显著减少（P<0.01）。相反，ICH+Chrysin组较ICH组表现为红细胞、炎症细胞出现不同程度减少，水肿减轻，尼氏体增多，海马CA1和CA3区的神经细胞具有典型形态，圆形或椭圆形细胞质和细胞计数轻微减少的均匀染色神经元（P<0.01），见图2A~F，表1。

2.3 白杨素减轻ICH大鼠海马线粒体超微结构损伤

使用透射电镜进一步观察了大鼠海马的超微结构变化。Sham组的神经细胞结构完整，表现出典型的形态以及正常的线粒体和内质网。然而，ICH组的神经细胞表现出不规则形态，破碎的核膜，分散的染色质，退化和肿胀的线粒体，外膜边缘粗糙，嵴边界模糊甚至消失，并存在大量空泡。相反，在ICH+Chrysin组中，神经元结构是完整的，核膜基本完全存在，偶尔有少量染色质浓缩，线粒体轻微肿胀，外膜边缘光滑，嵴可见，见图3。

2.4 白杨素抑制ICH大鼠海马组织铁死亡

为了验证白杨素对铁死亡的抑制作用，采用试剂盒检测了大鼠海马组织的Fe²⁺含量，Western blot检测了大鼠海马组织铁死亡指标蛋白GPX4、FTL、ACSL4的表达情况。与Sham组相比，ICH组大鼠Fe²⁺含量增加，铁死亡指标蛋白GPX4、FTL表达水平下降，ACSL4表达水平升高（P<0.01）；相较于ICH组，ICH+白杨素组Fe²⁺含量下降，铁死亡指标蛋白GPX4、FTL表达水平升高，ACSL4表达水平下降（P<0.01），见图4。

2.5 白杨素减轻ICH大鼠氧化应激损伤和炎症反应

为了明确白杨素的抗氧化及抗炎作用，采用试剂盒检测大鼠海马组织的GSH、MDA含量及SOD活性，Western blot检测了大鼠海马组织炎症指标蛋白TNF‑α、IL‑1β的表达情况。与Sham组相比，ICH组大鼠MDA含量增加，GSH含量、SOD活性下降，炎症指标蛋白TNF‑α、IL‑1β表达水平升高（P<0.01）；相较于ICH组，ICH+白杨素组MDA含量下降，GSH含量、SOD活性增加，炎症指标蛋白TNF‑α、IL‑1β表达水平下降（P<0.01），见图5。

3 讨论

ICH是常见的脑血管疾病之一，具有较高的发病率和致死致残率^［1］。ICH发生后血红蛋白分解产物聚集在血肿周围脑组织中，导致神经系统发生多种病理损伤，包括炎症反应、氧化应激损伤和铁超载等，最终导致神经损伤严重^{［27‑29］}。不仅如此，ICH还能够影响海马神经发生和神经功能恢复^［30］，且导致双侧海马炎症损伤及神经元细胞死亡进一步损伤认知功能^{［31，32］}，这些均与患者神经功能预后不良相关，其中铁死亡起关键作用。铁死亡作为一种铁依赖的程序性的细胞死亡 ^［33］，其主要特征还包括线粒体膜密度和体积明显变小，以及线粒体嵴减少或消失且外膜破裂^{［34，35］}。有研究者利用胶原酶诱导的小鼠ICH模型，发现血肿周围神经元胞质和轴突中皱缩的线粒体比例增加，有力地证实了铁死亡的发生^［36］。研究还发现血红蛋白预处理的ICH模型中磷酸化细胞外调节蛋白激酶水平升高，而已有研究证实了ERK是铁死亡过程中RAF‑MEK‑ERK通路中的重要信号分子^{［37，38］}，因此该发现从分子角度进一步证明了ICH后神经元发生铁死亡，这些研究均证实了ICH后神经元发生铁死亡。这也提示，抑制铁死亡对减轻ICH患者神经损伤，以及改善其远期预后起到关键性作用。这些证据也为研究如何通过抑制ICH后铁死亡，减轻神经损伤改善ICH患者预后提供了充分的理论依据。

白杨素作为一种草药活性分子，近年来已有较多研究证明其具有多种药理作用，其中包括抗氧化、抗炎、神经保护、抗癌、抗凋亡等^［39］。据报道，白杨素对双氯芬酸诱导SH‑SY5Y细胞凋亡具有神经保护作用^［40］；白杨素可以上调核因子E2相关因子2/血红素氧合酶1通路抑制氧化应激改善心功能不全^［41］；白杨素还通过抗炎活性作用改善小鼠炎症性肠病^［42］；且白杨素可以抑制铁死亡、氧化应激减轻脑缺血后再灌注损伤^{［19，43，44］}。这些结果均表明白杨素具有抗氧化应激、抗神经炎症及抑制细胞铁死亡的功能，这些功能在减轻神经损伤中起到十分重要的作用。那么白杨素能否通过抑制神经细胞铁死亡，对ICH后的神经损伤起到保护作用呢？目前相关研究较少，因此，本研究对白杨素与ICH间的作用机制进一步探究，有望为ICH治疗提供新策略新方向。

首先在本研究中通过自体血注射法构建大鼠ICH模型，对大鼠脑组织及海马组织进行形态学观察，明确白杨素减轻ICH模型大鼠血肿周围脑组织损伤及海马神经元损伤。那么如何进一步探究白杨素改善ICH损伤的机制？有研究发现，ICH后血脑屏障渗透性的增加导致血液中包含Fe³⁺的多种成分渗入脑实质，Fe³⁺与转铁蛋白结合，通过内吞作用进入细胞，Fe³⁺被还原成Fe²⁺，并通过二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）转运到细胞质中。Fe²⁺随后发生芬顿反应形成活性氧并影响脂氧合酶的催化活性^{［8，27，28，45］}。而细胞外谷氨酸盐升高导致胱氨酸/谷氨酸反向转运体（XC^—系统）抑制、谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）活性降低^［46］。同时，谷氨酸结合并激活谷氨酸受体，进一步加剧铁的摄取^［8］。此外，ICH后，在脂质代谢过程中，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（long chain fatty acid CoA ligase 4，ACSL4）被上调并促进多不饱和脂肪酸‑辅酶A和多不饱和脂肪酸‑磷脂的产生，然后被LOX催化成过氧化脂质，这些成分共同导致铁死亡，是ICH后继发性脑损伤的原因^{［8，27，45，47］}。因此，本研究后续证实了大鼠ICH后Fe²⁺含量明显增高，铁死亡标志蛋白ACSL4表达上调，GPX4、FTL 表达下调，而白杨素能逆转这种变化。这部分研究结果证实了大鼠ICH后明确发生铁死亡，且白杨素能通过抑制ICH后铁死亡减轻神经损伤。另外，研究已经明确细胞铁死亡发生时同样会加重组织氧化应激^{［48，49］}及炎症损伤^{［29，50］}，与此一致，本研究结果显示大鼠ICH后GSH、SOD含量降低，MDA含量升高，IL‑1β、TNF‑α表达上调，而白杨素逆转这一现象，证实了白杨素在大鼠ICH后发生铁死亡时具有抗氧化、抗炎作用。

综上所述，本研究以大鼠ICH模型为基础，通过多种实验方法检测铁死亡相关指标，验证白杨素通过抑制铁死亡减轻ICH后神经损伤。此外白杨素还能够减轻铁死亡引起的氧化应激及炎症损伤，可能成为改善ICH预后的一个重要的新药物治疗策略，对ICH治疗药物的研发具有重要意义。当然，本研究中尚存在一些局限性，如本研究仅根据既往研究选用单一的50 mg/kg白杨素给药剂量^{［18‑21］}，而药物浓度梯度筛选可以更好的得出最佳给药剂量；白杨素水溶性差、生物利用度较低，本研究通过灌胃的方式进行给药，导致药物无法更好的吸收，而合成制剂、纳米制剂等略过血脑屏障的给药方式可能是更有前景的给药方式^{［39，51］}。另外，本课题仅从体内实验进行探究，未涉及体外实验并且没有探究铁死亡的具体作用机制，未来将从体外体内实验以及ICH后铁死亡相关通路，对白杨素进行更加深入的研究，为开发与ICH后神经损伤的创新治疗策略开辟新的途径。

作者贡献度说明：

郭大闯：论文选题、实验操作、论文撰写与修改；邵哲：论文审阅与修改；彭浩、冯基高：指导老师。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省重点研发项目(ZDYF2021SHFZ111)

海南省级研究生创新科研课题项目(Qhys2023‑476)