结核分枝杆菌Rv2005的原核表达以及免疫原性评估

夏露; 王晓春; 漆志扬; 张延鹏

doi:10.13210/j.cnki.jhmu.20240806.001

海南医学院学报 ›› 2024, Vol. 30 ›› Issue (23) : 1784 -1791. DOI: 10.13210/j.cnki.jhmu.20240806.001

结核分枝杆菌Rv2005的原核表达以及免疫原性评估

夏露, 王晓春, 漆志扬, 张延鹏

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摘要

目的：构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M. tuberculosis）Rv2005载体，进行原核表达以及免疫原性评估研究，为研究新型结核病疫苗筛选优势的靶抗原。方法：设计目的基因Rv2005的特异性引物并进行PCR扩增，依据分子克隆技术构建重组质粒pET28a-Rv2005，对其进行原核表达，并以镍柱亲和层析法对其进行蛋白纯化。用纯化后rRv2005对中国M. tuberculosis感染者和健康对照者（healthy controls, HCs）外周血进行刺激，以多重微球流式免疫荧光发光法检测其外周血T淋巴细胞产生的相应特异性IFN-γ抗体水平。构建基于TLR4/9激动剂单磷酰脂质A/含非甲基化鸟嘌呤和胞嘧啶二核酸的寡聚脱氧核苷酸序列（CPG ODN）的复合型脂质体佐剂MC，与rRv2005联合免疫C57BL/6小鼠，9周后处死，以酶联免疫吸附实验检测免疫后小鼠血清中的特异性抗原IgG,IgG1,IgG2a的滴度以及免疫后小鼠脾细胞上清液中特异性抗原Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌水平。结果：成功构建了重组质粒pET28aRv2005，以SDS-PAGE和Western blot鉴定其表达结果相符合。经rRv2005刺激后，HCs相比于活动性结核病（ATB）与潜伏性结核病（LTBI）受试者，其外周血T淋巴细胞释放的相应细胞因子水平显著升高，且ATB受试者分泌细胞因子水平最高（P<0.01）。卡介苗（BCG）初免、rRv2005联合佐剂MC免疫的小鼠诱导产生较高的IgG及其亚类水平，IgG2a/IgG1比值>1，趋向于Th1型细胞免疫；BCG初免增强组小鼠脾细胞经PPD和rRv2005刺激后，可诱导释放高水平的抗原特异性IFN-γ、TNF-α及IL-2。结论：rRv2005可以诱导中国结核病感染者外周血T淋巴细胞释放高水平的IFN-γ;rRv2005联合佐剂MC免疫小鼠可以刺激机体产生Th1型细胞免疫；BCG初免、rRv2005/MC增强的免疫方式可能有效弥补BCG保护力下降的缺陷；基于TLR激动剂的复合型佐剂MC具有良好的应用前景。