海南砂仁化学成分及其胃黏膜保护活性研究

Study on the chemical composition of Amomum longiligulare T.L.Wu and its protective activity of gastric mucosa in vitro

摘要

目的 本文对海南砂仁二氯甲烷部位进行化学成分分离并探究其胃黏膜保护活性。 方法 海南砂仁经70 %乙醇提取，系统溶剂萃取，得到二氯甲烷部位；采用多种色谱技术对二氯甲烷部位进行分离纯化，利用现代波谱技术对所获得的化合物进行结构鉴定；采用CCK‑8法和ELISA试剂盒对分离所获得化合物进行胃黏膜保护活性评价及检测IL‑1β、IL‑6、PEG₂因子的表达水平。 结果 对海南砂仁二氯甲烷部位进行分离获得16个单体化合物，其中包括11个二芳基庚烷类、3个黄酮类、2个其他类，分别鉴定为5‑羟基‑3，7，4'‑三甲氧基黄酮（1）、对苯二酚（2）、1，7‑双（4‑羟基苯基）‑3‑庚酮（3）、5，4′‑二羟基‑7‑甲氧基黄酮（4）、5，4'‑二羟基‑3，7‑二甲氧基黄酮（5）、（2S，4S）‑橙酰胺乙酸酯（6）、（‑）rhododendrol（7）、1，7‑双（4‑羟基苯基）‑4‑庚烯‑3‑酮（8）、（5S）‑5‑羟基‑1，7‑双（4‑羟基苯基）‑3‑庚酮（9）、1‑（3，4‑二羟基苯基）‑7‑（4‑羟基苯基）‑4‑庚烯‑3‑酮（10）、（3R，5R）‑3，5‑二乙酰氧基‑1，7‑双（3，4‑二羟基苯基）庚烷（11）、（3S）‑3‑羟基‑1，7‑双（4‑羟基苯基）庚烷（12）、（3R，5R）‑3，5‑二乙酰氧基‑1‑（3，4‑二羟基苯基）‑7‑（4‑羟基苯基）庚烷（13）、（3R）‑3‑乙酰氧基‑1，7‑双（3，4‑二羟基苯基）庚烷（14）、（3R，5R）‑3，5‑二羟基‑1，7‑双（4‑羟基苯基）‑庚烷（15）、（3R，5R）‑3‑乙酰氧基‑5‑羟基‑1，7‑双（3，4‑二羟基苯基）庚烷（16）。体外活性结果表明，化合物1~6、10~14、16对乙醇诱导的GES‑1细胞损伤具有一定的保护作用。化合物11、13、14能降低GES‑1细胞中促炎因子IL‑1β、IL‑6的表达，升高胃黏膜保护因子PEG₂的表达。 结论 化合物1~2、4~9、13~16为首次从海南砂仁中分离得到，化合物1~6、10~14、16具有一定的胃黏膜保护活性，其中化合物11、13、14均能降低IL‑1β、IL‑6的表达及促进PEG₂的表达。

Abstract

Objective In this paper， the chemical constituents of Amomum longiligulare T.L.Wu were isolated and the in vitro gastric mucoprotective activity of its monomers was investigated. Methods Amomum longiligulare T.L.Wu 70 % alcoholic extract was extracted by systematic solvent extraction to obtain the dichloromethane part， which was isolated and purified by silica gel column chromatography， Sephadex LH‑20 gel column chromatography， ODS column chromatography， semi‑preparative high performance liquid chromatography， etc.， and the structures of the compounds were identified by modern wave spectrometry； the compounds obtained from the isolation were evaluated and detected by IL‑1β， IL‑6， and PEG₂ factor expression by using the CCK‑8 method and ELISA kits in vitro. The isolated compounds were evaluated by CCK‑8 method and ELISA kit， and the expressions of IL‑1β， IL‑6 and PEG₂ factors were detected. Results Sixteen compounds were isolated from the dichloromethane site of Amomum longiligulare T.L.Wu， including 11 linear diarylheptanes， three flavonoids， and two other classes， which were identified as 5‑hydroxy‑3，7，4'‑trimethoxyflavone （1）， hydroquinone （2）， 1，7‑bis（4‑hydroxyphenyl）‑3‑heptanone （3）， 5，4′‑dihydroxy‑7‑methoxyflavone （4），（3R，5R）‑3‑acetoxy‑5‑hydroxy‑1，7‑bis（3，4‑dihydroxyphenyl）heptane （16）， where compounds 1‑6， 10‑14， and 16 turned out to be protective against ethanol‑induced GES‑1 cell damage. Compounds 11， 13， and 14 decreased the expression of pro‑inflammatory factors IL‑1β and IL‑6 and elevated the expression of gastric mucosal protective factor PEG2 in cell supernatants. Conclusion Compounds 1‑2， 4‑6， 9， 13‑16 were isolated from Amomum longiligulare T.L.Wu for the first time， and compounds 1‑6， 10‑14， 16 have certain in vitro gastric mucoprotective activities， of which compounds 11， 13， 14 can reduce the expression of pro‑inflammatory factors IL‑1β， IL‑6 and elevate the expression of gastric mucoprotective factor PEG₂ in the supernatant of cells.

Graphical abstract

关键词

海南砂仁 / 化学成分 / 二芳基庚烷类 / 胃黏膜保护活性

Key words

Amomum longiligulare T.L.Wu / Chemical composition / Diarylheptanoids / Gastric mucosal protective activity

砂仁为姜科植物阳春砂仁Amomum villosum Lour.、绿壳砂仁Amomum villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen或海南砂仁Amomum longiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实^［1］。砂仁始载于甄权的《药性论》：“砂仁，味苦辛，能主冷气腹痛，止休息气痢劳损，消化水谷，温暖脾胃”^［2］。2020版《中国药典》收录其具有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎，用于湿浊中阻，脱痞不饥，脾胃虚寒，呕吐泄泻，妊娠恶阻，胎动不安^［1］。砂仁收录于药食同源目录，具有1 300多年的药用历史，在传统中医理论中，用作治疗胃脘疾病的常用要药。砂仁具有潜在的开发前景，以砂仁为关键词在2020版《中国药典》、国家药品监督管理局数据查询平台（http：//www.nmpa.gov.cn/datasearch/）和中医药百科全书数据库（http：//www.tcmip.cn/etcm/）进行检索，共检索出由砂仁组成的中成药品种363种，2020版《中国药典》已收录67种，如香砂六君丸、香砂养胃丸等^［3］。

海南砂仁是海南省的特有品种，属于地理标志产品。近年来，人们对海南砂仁化学成分研究大多集中于挥发性成分分析，对海南砂仁非挥发性成分及药效研究较少，缺乏深入系统的研究。因此，本文利用多种色谱手段，对海南砂仁二氯甲烷部位进行成分的分离，以乙醇诱导的GES‑1细胞损伤为模型，评价海南砂仁分离所得到单体化合物的胃黏膜保护活性，以期为海南砂仁的进一步开发、利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

主要材料、试剂、仪器，见表1。

1.2 方法

1.2.1 提取与分离

海南砂仁购于海南省白沙自治区七坊镇，经海南医科大学药学院田建平教授鉴定为海南砂仁（Amomum longiligulare T.L.Wu），标本存放于海南医科大学实验楼B713。称取6 kg海南砂仁干燥果实，粉碎，加入70 %乙醇回流提取3次，料液比1∶5，1 h/次，合并提取液，旋干得（1 461.25 g浸膏），留样后，用蒸馏水超声分散70 %醇提物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶液萃取，得到石油醚部位（301.45 g）、二氯甲烷部位（233.23 g）、乙酸乙酯部位（107.43 g）、正丁醇部位（321.36 g）、余水部位（461.52 g）。

将海南砂仁二氯甲烷部位（200.00 g）进行硅胶柱色谱分离，湿法装柱，用二氯甲烷：甲醇（100∶0、50∶1、20∶1、10∶1）进行洗脱，得到Fr A、Fr B、Fr C、Fr D 4个梯度馏分。所有馏分利用硅胶薄层板（TCL）检测，主斑点相同后合并，Fr A得到9个馏分（Fr A1~9），Fr B得到18个馏分（FrB1~18），Fr C得到10个馏分（Fr C1~10），Fr D得到8个馏分（Fr D1~8）。得到Fr A5（45.2 g）、Fr B2（1.52 g）、Fr B3（10.23 g）、Fr B4（10.23 g）、Fr B12（11.59 g）、Fr C8（2.21 g）、Fr D6（1.52 g），对该7个组分再进一步分离。Fr A5常温重结晶得到化合物1。Fr B2经半制备型高效液相色谱仪（HPLC）纯化，流动相为75 %甲醇水，体积流量2 mL/min，检测波长210 nm（流速、波长同下），得到化合物2。Fr B3经HPLC纯化，以75 %甲醇水洗脱，得到化合物3、化合物4、化合物5、化合物6。Fr B4经HPLC纯化，以60 %甲醇水洗脱，得到化合物7、化合物8。Fr B12经HPLC纯化，以55 %甲醇水洗脱，得到化合物9、化合物10、化合物11、化合物12，化合物13、化合物14。Fr C8经HPLC纯化，以60 %甲醇水洗脱，得到化合物15。Fr D6经HPLC纯化，以60 %甲醇水洗脱，得到化合物16，见图1。

1.2.2 单体化合物对乙醇诱导GES‑1细胞损伤的保护活性研究

1.2.2.1 细胞培养与传代

将复苏的GES‑1细胞培养于完全培养基（含10 % FBS+1 % P/S双抗+89 % RPMI‑1640培养基）中，24 h后更换新培养液，使细胞贴壁生长。待细胞长满至合适密度（80 %左右）进行传代。去旧培养基，使用无菌PBS缓冲液缓慢冲洗细胞，将细胞表面残留血清冲洗干净。每个培养瓶中加入约1 mL 0.25 %胰酶消化细胞，2 min后加入3 mL细胞培养液终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃其上清液，加入1 mL完全培养基重悬浮细胞，以适宜细胞浓度进行传代培养。

1.2.2.2 细胞损伤模型的建立

分别以0、6%、7%、8%、9%、10%乙醇浓度的培养液作用于GES‑1细胞，作用时间分别是3 h，显微观察细胞的萎缩情况初步判断细胞损伤程度，进一步用CCK‑8法，检测细胞抑制率^［4］。

1.2.2.3 单体化合物对GES‑1细胞损伤的毒性结果

将GES‑1细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24 h后，弃旧培养基，对照组（NC）加入100 μL完全培养基，各单体化合物给药浓度如表2所示，每孔100 μL，设4个复孔，37 ℃培养箱中培养24 h后，吸弃上清液，加入10 % CCK‑8溶液100 μL，孵育1 h后在酶标仪（450 nm）上检测每孔的OD值，并计算细胞TC₅₀。

1.2.2.4 单体化合物对乙醇诱导GES‑1细胞损伤的保护作用研究

将GES‑1细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，贴壁生长24 h后，弃旧培养基，空白对照组（NC）及乙醇模型组（EC）加100 μL完全培养基，因单体化合物之间对GES‑1细胞的毒性具有差异，故进行细胞活性实验时，所选用的给药浓度也不同，根据每个单体化合物的细胞毒性结果，给予合适的药液。各药物处理组干预24 h后，弃旧培养基，除NC外，其余组各加入9 %的乙醇造模液100 μL，培养3 h，利用CCK‑8法，以细胞存活率为指标，对各药物处理组进行胃黏膜保护活性评价。

1.2.3 细胞上清液中IL‑1β、IL‑6、PGE₂水平的检测

将GES‑1细胞以1×10⁵个/孔接种于6孔板中，贴壁生长24 h后，弃旧培养基，NC及EC加2 mL完全培养基，每个药物处理组设立高、中、低组，每孔2 mL，药物干预24 h后，弃旧培养基，除NC外，其余组各加入9 %的乙醇造模液500 μL，培养3 h后，收集上清液，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，取上清液，用ELISA试剂盒检测IL‑1β、IL‑6、PGE₂的表达水平。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.5.1软件对实验数据进行组间与组内的差异比较，所有定量数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 单体化合物的结构鉴定

通过多种柱色谱手段对海南砂仁二氯甲烷部位进行分离，共分离16个单体化合物，其中包含11个二芳基庚烷类，3个黄酮，2个其他类，其中化合物2在海南砂仁挥发油GC‑MS分析中有见报道，但从未在该药材中分离，化合物1、2、4~9、13~16，共12个单体化合物为首次从该药材中分离。此外，海南砂仁二芳基庚烷类化学结构以线性二芳基庚烷为主，庚烷母链多为饱和烷烃，母链上多具有不饱和取代键，如母链上多具乙酰氧基取代，多具酚羟基，结构多具对称性等特点。

化合物1（201.20 mg）：黄色晶体，¹H‑NMR（CDCl₃，400 MHz）δ： 3.87（3H，s，3‑OCH₃），6.32（1H，d，J=2.2 Hz，H‑6），3.84（3H，s，7‑OCH₃），6.41（1H，d，J=2.2 Hz，H‑8），8.06（2H，d，J=9.0 Hz，H‑2'，6'），7.00（2H，d，J=9.0 Hz，H‑3'，5'），3.83（3H，s，4'‑OCH₃）；¹³C‑NMR（CDCl₃，100 MHz）δ： 156.07（C‑2），138.92（C‑3），178.87（C‑4），162.05（C‑5），97.91（C‑6），165.48（C‑7），55.88（7‑OCH₃），92.23（C‑8），156.82（C‑9），106.11（C‑10），122.85（C‑1'），130.25（C‑2'），114.13（C‑3'），161.76（C‑4'），55.52（4'‑OCH₃），114.13（C‑5'），130.25（C‑6'），60.23（3‑OCH₃）。以上数据与文献［5］报道对照基本一致，故鉴定化合物1为5‑羟基‑3，7，4'‑三甲氧基黄酮。

化合物2（50.32 mg）：白色结晶，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.58（4H，s，H‑2，3，5，6）；¹³C‑NMR（100 MHz，CD₃OD）δ： 115.49（C‑2，3，5，6），149.88（C‑1，4）。以上数据与文献报道基本一致^［6］，故鉴定化合物2为对苯二酚。

化合物3（15.22 mg）：棕色油状物，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.89（4H，dd，J=11.3 Hz、8.5 Hz，H‑2'，6'，2''，6''），6.60（4H，dd，J=7.93 Hz、3.44 Hz，H‑3'，5'，3''，5''），2.58（4H，m，H‑1，2），2.45（4H，m，H‑4，7），1.37（4H，m，H‑5，6）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 28.71（C‑1），44.10（C‑2），210.38（C‑3），43.28（C‑4），23.09（C‑5），31.09（C‑6），34.43（C‑7），132.37（C‑1'），129.40（C‑2'），115.40（C‑3'），155.64（C‑4'），115.40（C‑5'），129.40（C‑6'），131.48（C‑1''），129.40（C‑2''），115.35（C‑3''），155.80（C‑4''），115.35（C‑5''），129.40（C‑6''），以上数据与文献报道基本一致^［7］，故鉴定化合物3为1，7‑双（4‑羟基苯基）‑3‑庚酮。

化合物4（13.25 mg）：黄色粉末，¹H‑NMR（DMSO，400 MHz）δ： 7.88（2H，d，J=8.5 Hz，H‑2'，6'），6.88（2H，d，J=8.5 Hz，H‑3'，5'），6.70（1H，brs，H‑8），6.30（1H，brs，H‑8），3.81（3H，s，7‑OCH₃），6.77（1H，brs，H‑3）；¹³C‑NMR （DMSO，100 MHz）δ： 164.68（C‑2），103.84（C‑3），182.42（C‑4），157.75（C‑5），98.94（C‑6），165.61（C‑7），94.04（C‑8），161.74（C‑9），105.59（C‑10），121.12（C‑1'），129.06（C‑2'），116.62（C‑3'），162.42（C‑4'），116.62（C‑5'），129.06（C‑6'），56.54（7‑OCH₃），以上数据与文献报道对照基本一致^［8］，故鉴定化合物4为5，4′‑二羟基‑7‑甲氧基黄酮。

化合物5（18.55 mg）：黄色粉末，¹H‑NMR（DMSO，600 MHz）δ： 7.98（2H，d，J=8.5 Hz，H‑2'，6'），6.96（2H，d，J=8.5 Hz，H‑3'，5'），6.76（1H，brs，H‑8），6.38（1H，brs，H‑6），3.87（3H，s，7‑OCH₃），3.80（3H，s，3‑OCH₃）；¹³C‑NMR （DMSO，150MHz）δ： 156.50（C‑2），138.20（C‑3），178.49（C‑4），161.42（C‑5），98.80（C‑6），165.57（C‑7），92.80（C‑8），156.79（C‑9），105.67（C‑10），120.48（C‑1'），130.65（C‑2'），116.29（C‑3'），160.14（C‑4'），116.29（C‑5'），130.65（C‑6'），60.13（3‑OCH₃），56.55（7‑OCH₃），以上数据与文献报道对照基本一致^［9］，故鉴定化合物5为5，4'‑二羟基‑3，7‑二甲氧基黄酮。

化合物6（2.02 mg）：白色针晶，¹H‑NMR（CDCl₃，400 MHz）δ： 7.48‑7.75（5H，m，H‑A），7.29（5H，m，H‑b），7.12（5H，m，H‑C），6.83（1H，d，J=7.8 Hz，H‑c），6.04（1H，d，J=8.5 Hz，H‑d），4.79（1H，m，H‑4），4.38（1H，m，H‑2），3.97（1H，dd，J=11 Hz、4.5 Hz，H‑1a），3.87（1H，dd，J=11 Hz、4.5 Hz，H‑1b），3.25（1H，dd，J=13.5 Hz、5.9 Hz，H‑6a），3.10（1H，dd，J=13.5 Hz、8.4 Hz，H‑6b），2.79（2H，dd，J=6.9 Hz、2.5 Hz，H‑7），2.07（3H，s，H‑9）；¹³C‑NMR（CDCl₃，100 MHz）δ： 170.83（C‑8），170.32（C‑3），167.18（C‑5），136.70（C‑1''），136.61（C‑1'''），133.63（C‑1'），131.97（C‑4'），129.31（C‑2''，6''），129.15（C‑2'''，6'''），128.78（C‑2'，6'），128.67（C‑3''，5''），128.61（C‑3'''，5'''），127.17（C‑3'，5'），127.09（C‑4''），126.77（C‑4'''），64.60（C‑1），55.04（C‑4），49.48（C‑2），38.43（C‑6），37.44（C‑7），20.81（C‑9），以上数据与文献报道对照基本一致^［10］，故鉴定化合物6为（2S，4S）‑橙酰胺乙酸酯。

化合物7（3.81 mg）：白色粉末，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.98（2H，d，J=8.5 Hz，H‑2'，6'），6.68（2H，d，J=8.5 Hz，H‑3'，5'），3.71（1H，m，H‑2），2.54（2H，m，H‑4），1.67（2H，m，H‑3），1.17（3H，d，J=6.3 Hz，H‑1）；¹³C‑NMR （CD₃OD，100 MHz）δ： 23.52（C‑1），67.90（C‑2），42.42（C‑3），32.24（C‑4），134.44（C‑1'），130.24（C‑2'），116.07（C‑3'），156.33（C‑4'），116.07（C‑5'），130.24（C‑6'），以上数据与文献报道对照基本一致^［11］，故鉴定化合物7为（‑）‑rhododendrol。

化合物8（30.52 mg）：油状物，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 9.15（2H，s，4'‑OH、4''‑OH），6.95（4H，dd，J=8.5 Hz、5.6 Hz，H‑2'，6'，2''，6''），6.80（1H，t，J=15.9 Hz、6.9 Hz，H‑5）6.62（4H，dd，J=8.5 Hz、5.6 Hz，H‑3'，5'，3''，5''），6.04（1H，t，J=15.9 Hz、1.4 Hz，H‑4），2.73（2H，m，H‑6），2.63（2H，m，H‑7），2.56（2H，m，H‑1），2.45（2H，m，H‑2）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 29.27（C‑1），41.69（C‑2），199.75（C‑3），130.82（C‑4），147.38（C‑5），34.42（C‑6），33.31（C‑7），131.72（C‑1'），129.66（C‑2'），115.55（C‑3'），156.00（C‑4'），115.55（C‑5'），129.66（C‑6'），131.49（C‑1''），129.70（C‑2''），115.60（C‑3''），155.94（C‑4''），115.60（C‑5''），129.70（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［11］，故鉴定化合物8为1，7‑双（4‑羟基苯基）‑4‑庚烯‑3‑酮。

化合物9（10.35 mg）：黄色油脂状，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 2.73（4H，m，H‑1，2），2.50（4H，m，H‑4，7），3.97（1H，m，H‑5），1.63（2H，m，H‑6），6.97（4H，d，J=8.5 Hz，H‑2'，6'，2''，6''），6.65（2H，d，J=8.5 Hz，H‑3'，5'），6.66（2H，d，J=8.5 Hz，H‑3''，5''）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 29.77（C‑1），46.39（C‑2），211.94（C‑3），51.24（C‑4），68.24（C‑5），40.51（C‑6），31.92（C‑7），133.25（C‑1'），130.27（C‑2'），116.11（C‑3'），156.39（C‑4'），116.11（C‑5'），130.27（C‑6'），134.09（C‑1''），130.31（C‑2''），116.16（C‑3''），156.60（C‑4''），116.16（C‑5''），130.31（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［12］，故鉴定化合物9为（5S）‑5‑羟基‑1，7‑双（4‑羟基苯基）‑3‑庚酮。

化合物10（30.81 mg）：黄色油脂状，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.96（2H，d，J=8.5 Hz，H‑2''，H‑6''），6.85（1H，m，H‑5），6.66（2H，m，H‑3''，5''），6.60（1H，d，J=2.1 Hz，H‑2'），6.64（1H，d，J=3.7 Hz，H‑5'），6.47（1H，d，J=8.0 Hz、2.1 Hz，H‑6'），6.04（1H，d，J=15.8 Hz，H‑4），2.72（1H，m，H‑1），2.79（2H，m，H‑2），2.43（2H，m，H‑6），2.57（2H，m，H‑7）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 29.34（C‑1），41.41（C‑2），201.57（C‑3），129.01（C‑4），148.04（C‑5），33.45（C‑6），34.31（C‑7），132.50（C‑1'），115.20（C‑2'），144.88（C‑3'），143.19（C‑4'），115.01（C‑5'），119.39（C‑6'），130.23（C‑1''），131.88（C‑2''），114.85（C‑3''），155.28（C‑4''），114.85（C‑5''），131.88（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［7］，故鉴定化合物10为1‑（3'，4'‑二羟基苯基）‑7‑（4‑羟基苯基）‑4‑庚烯‑3‑酮。

化合物11（815.25 mg）：棕色油状物，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.57（2H，d，J=2.1 Hz，H‑2'，2''），6.64（2H，d，J=8.0 Hz，H‑5'，5''），6.46（2H，dd，J=8.0 Hz、2.1 Hz，H‑6'，6''），2.42（4H，t，J=7.9 Hz，H‑1，7），1.75（4H，m，H‑2，6），4.89（2H，m，H‑3，5），1.81（2H，m，H‑4），1.94（6H，m，CH₃）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 30.52（C‑1），36.24（C‑2），70.09（C‑3），38.06（C‑4），70.09（C‑5），36.24（C‑6），30.52（C‑7），132.89（C‑1'），114.90（C‑2'），144.65（C‑3'），142.86（C‑4'），115.06（C‑5'），119.20（C‑6'），132.89（C‑1''），114.90（C‑2''），144.65（C‑3''），142.86（C‑4''），119.20（C‑5''），119.20（C‑6''），20.16（‑CH₃），171.47（C=O），以上数据与文献报道对照基本一致^［7］，故鉴定化合物11为（3R，5R）3，5‑二乙酰氧基‑1，7‑双（3，4‑二羟基苯基）庚烷。

化合物12（6.80 mg）：棕色油脂状，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 2.63（2H，m，H‑1），1.67（2H，m，H‑2），3.49（1H，m，H‑3），1.46（2H，m，H‑4），1.32（2H，m，H‑5），1.56（2H，m，H‑6），2.54（2H，m，H‑7），6.97（4H，dd，J=8.5 Hz、5.6 Hz，H‑2'，6'，2''，6''），6.67（4H，dd，J=8.5 Hz、5.6 Hz，H‑3'，5'，3''，5''）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 30.69（C‑1），39.19（C‑2），70.22（C‑3），36.77（C‑4），24.84（C‑5），31.59（C‑6），34.56（C‑7），133.10（C‑1'），128.83（C‑2'），114.62（C‑3'），154.80（C‑4'），114.62（C‑5'），128.83（C‑6'），133.32（C‑1''），128.81（C‑2''），114.54（C‑3''），154.85（C‑4''），115.54（C‑5''），128.81（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［7］，故鉴定化合物12为（3S）‑3‑羟基‑1，7‑双（4‑羟基苯基）庚烷。

化合物13（20.75 mg）：黄色油状物，油状物，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 2.48（4H，m，H‑1，7），1.77（2H，m，H‑2，6）4.89（2H，m，H‑3，5），1.81（2H，m，H‑4），6.57（1H，d，J=2.1 Hz，H‑2'），1.94（6H，m，‑CH₃），6.46（1H，dd，J=8.0、2.1 Hz，H‑6'），6.96（1H，d，J=8.5 Hz，H‑2''），6.67（1H，d，J=8.5 Hz，H‑3''），6.65（1H，d，J=8.0 Hz，H‑5''），6.94（1H，d，J=8.5 Hz，H‑6''）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 19.76（‑CH₃），30.64（C‑1），36.48（C‑2），70.15（C‑3），38.20（C‑4），70.09（C‑5），36.48（C‑6），30.40（C‑7），132.97（C‑1'），115.14（C‑2'），144.84（C‑3'），143.05（C‑4'），114.96（C‑5'），119.25（C‑6'），132.16（C‑1''），128.96（C‑2''），114.81（C‑3''），155.20（C‑4''），114.81（C‑5''），128.96（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［13］，故鉴定化合物13为（3R，5R）‑3，5‑二乙酰氧基‑1‑（3，4‑二羟基苯基）‑7‑（4‑羟基苯基）庚烷。

化合物14（40.62 mg）：黄色油状物，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.65（1H，H‑5'），6.62（1H，H‑5''），6.57（2H，H‑2'，2''），6.44（2H，H‑6'，6''），4.66（1H，H‑3），2.39（1H，H‑1），2.36（1H，H‑7），1.94（3H，‑CH₃），1.72（2H，H‑2），1.48（2H，H‑4），1.45（2H，H‑6），1.22（2H，H‑5）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 19.82（‑CH₃），30.72（C‑1），35.72（C‑2），73.98（C‑3），33.53（C‑4），24.28（C‑5），31.07（C‑6），34.59（C‑7），134.05（C‑1'），115.20（C‑2'），144.68（C‑3'），142.86（C‑4'），115.00（C‑5'），119.37（C‑6'），133.21（C‑1''），115.13（C‑2''），144.56（C‑3''），142.65（C‑4''），114.88（C‑5''），119.29（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［14］，故鉴定化合物14为（3R）‑3‑乙酰氧基‑1，7‑双（3，4‑二羟基苯基）庚烷。

化合物15（12.22 mg）：白沙粉末，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 7.01（4H，d，J=8.5 Hz，H‑2'，6'，2''，6''），6.69（4H，d，J=8.5 Hz，H‑3'，5'，3''，5''），3.80（2H，m，H‑3，5），2.69‑2.50（4H，m，H‑1，7），1.69‑1.64（4H，m，H‑2，6），1.53（2H，dd，H‑4）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ： 32.12（C‑1），41.40（C‑2），68.66（C‑3），45.65（C‑4），68.66（C‑5），41.40（C‑6），32.12（C‑7），134.47（C‑1'），130.32（C‑2'），116.07（C‑3'），156.29（C‑4'），116.07（C‑5'），130.32（C‑6'），134.4（C‑1''），130.32（C‑2''），116.07（C‑3''），156.29（C‑4''），116.07（C‑5''），130.32（C‑6''），以上数据与文献报道对照基本一致^［15］，故鉴定化合物15为（3R，5R）‑3，5‑二羟基‑1，7‑双（4‑羟基苯基）‑庚烷。

化合物16（13.54 mg）：棕色油状物，¹H‑NMR（CD₃OD，400 MHz）δ： 6.64（1H，d，J=8.0 Hz，H‑5'），6.62（1H，d，J=8.0 Hz，5''），6.59（1H，d，J=3.1 Hz，H‑2''），6.57（1H，d，J=3.1 Hz，H‑2'），6.48（1H，dd，J=8.0 Hz、3.1 Hz，H‑6'），6.46（1H，dd，J=8.0 Hz、3.1 Hz，H‑6''），5.05（1H，m，H‑3），3.28（1H，m，H‑5），2.57（1H，ddd，J=14.1、8.8、5.8 Hz，H‑7a），2.45（1H，m，H‑7b），2.45（2H，m，H‑1），1.80（2H，m，H‑2），1.71（1H，m，H‑4a），1.59（1H，m，H‑4b），1.64（2H，m，H‑6），1.96（3H，m，‑CH₃）；¹³C‑NMR（CD₃OD，100 MHz）δ：32.25（C‑1），37.01（C‑2），72.90（C‑3），42.96（C‑4），68.07（C‑5），40.40（C‑6），31.98（C‑7），134.55（C‑1'），116.47（C‑2'），146.07（C‑3'），144.17（C‑4'），116.27（C‑5'），120.58（C‑6'），135.07（C‑1''），116.58（C‑2''），146.07（C‑3''），144.29（C‑4''），116.32（C‑5''），120.67（C‑6''），21.10（‑CH₃），173.18（C=O），以上数据与文献报道对照基本一致^［13］，故鉴定化合物16为（3R，5R）‑3‑乙酰氧基‑5‑羟基‑1，7‑双（3，4‑二羟基苯基）庚烷。

2.2 单体化合物对GES‑1细胞损伤的毒性研究结果

对海南砂仁二氯甲烷部位分离，对所获得的16个化合物进行GES‑1细胞毒性的检测，结果见表3、图3。16个单体化合物对GES‑1细胞的细胞毒性结果表明，各单体化合物TC₅₀较大，细胞毒性较小，充分肯定了海南砂仁作为药食同源类药材的安全可靠性。化合物3、8、11、12、13、14、16毒性稍大。

2.3 单体化合物对乙醇诱导GES‑1细胞损伤的保护作用研究结果

对16个化合物进行乙醇诱导GES‑1细胞损伤的保护活性研究中，结果如图4。化合物1~6、10~14、16均表现出显著地胃黏膜保护活性。其中化合物10、11、12、13、14、16活性较强。与EC相比，化合物10在18.750~4.688 µmol/L时，表现出较好的胃黏膜保护活性（P<0.05）；化合物11在50.000 ~12.500 µmol/L时，表现出较好的胃黏膜保护活性（P<0.05）；化合物13在25 µmol/L时，表现出较好的胃黏膜保护活性（P<0.01）；化合物14在18.750 ~9.375 µmol/L时，表现出较好的胃黏膜保护活性（P<0.05）；化合物16在30.000~7.500 µmol/L时，表现出较好的胃黏膜保护活性（P<0.01）。

2.4 化合物11、13、14细胞上清液中IL‑1β、IL‑6、PGE₂水平的检测

因化合物11、13、14在上述细胞活性检测中，活性最好，故对此进行ELISA试剂盒检测，分别设立高、中、低剂量组。检测细胞上清液，如表4~6所示，与EC相比，化合物11、13、14均呈浓度依赖性极显著性抑制GES‑1细胞中IL‑1β、IL‑6的分泌（P<0.01），极显著性增加PEG₂的表达水平（P<0.01）。

3 讨论

本研究采用多种柱色谱对海南砂仁二氯甲烷部位进行分离，共分离出16个化合物，其中包括11个二芳基庚烷类，3个黄酮类，2个其他类，化合物1、2、4~9、13~16为首次从该药材中分离，其中化合物11、13、14、16具有特殊结构，庚烷母链上具乙酰氧基取代。初步推测海南砂仁二芳基庚烷类以线性二芳基庚烷为主，庚烷母链上多具有不饱和取代键，如母链上多具乙酰氧基取代，苯环上多具酚羟基，结构多具对称性等特点。初步推测二芳基庚烷类化合物苯环上酚羟基及母链上有乙酰氧基为胃黏膜保护活性的活性基团。

在单体化合物的体外活性研究中，发现二芳基庚烷类活性强于黄酮类化合物，推测海南砂仁二芳基庚烷类为主要活性成分之一。其中化合物11、13、14、16活性较强，结合其特殊结构，庚烷母链上具乙酰氧基取代，苯环上具多羟基取代。目前尚无学者阐明二芳基庚烷类化合物与胃黏膜保护活性的构效关系研究。已有文献对抗氧化作用进行构效关系的研究，2024年，Ma等^［16］对天然来源的的二芳基庚烷类进行了抗氧化活性的构效关系综述，表明羟基的数量越高，抗氧化活性就越高；线性二芳庚烷的抗氧化活性受取代基位点抗性和庚烷链的不饱和键影响；供电子基团的取代增强了抗氧化活性；本研究初步推测二芳基庚烷类化合物在胃黏膜保护活性的构效关系中，苯环上酚羟基数目越多活性越强，庚烷母链上有乙酰氧基取代则活性增强。由于本研究中分离得到的二芳基庚烷类化合物数量较少，故不能明确阐明其构效关系，期待后续挖掘更多天然来源的二芳基庚烷类化合物，明确阐明其化学结构与胃黏膜保护作用的构效关系。本研究在一定程度上为二芳基庚烷类化合物的结构修饰和胃黏膜保护活性药物的研究提供参考，也为海南砂仁的进一步开发利用提供科学依据。

作者贡献度说明：

周小妹，练勇：设计实验方案、进行实验并撰写论文；罗明权，张迎，程倩颖：分析数据；靳德军：论文格式进行修改；孔奕丹和魏娜：提供研究思路、负责指导论文撰写并对论文进行修改指正。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金(822RC705)

海南省自然科学基金(821RC576)

海南省重点研发项目(ZDYF2022SHFZ127)

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