抗生素饲喂小鼠对发热伴血小板减少综合征病毒在蜱虫共吸血传播中的影响

Effect of antibiotic feeding in mice on the co‑feeding transmission of fever with thrombocytopenia syndrome virus in ticks

摘要

目的 发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）是一种新发的蜱传病原体。探讨小鼠肠道菌群在SFTSV传播中的作用。 方法 通过抗生素治疗和微生物再定殖对昆明小鼠肠道菌群进行调控。然后将感染SFTSV的长角血蜱成蜱和未感染的若蜱共同吸血小鼠。采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测饱血若蜱体内SFTSV水平。 结果 将粪便均匀涂抹在LB琼脂平板上，证实肠道细菌的改变。与对照组和再定殖组相比，抗生素治疗组的微生物群落多样性较单一。在共吸血传播模型中，qPCR分析显示抗生素治疗组的病毒载量较对照组和再定殖组有所增加。 结论 小鼠肠道菌群可抑制SFTSV的传播。研究结果为进一步探索SFTSV传播中宿主肠道功能菌提供了基础。

Abstract

Objective To investigate the role of mouse gut microbiota in the transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome virus （SFTSV）， a newly emerging tick-borne pathogen. Methods The gut microbiota of Kunming mice was manipulated by antibiotics treatment and microbial recolonization. Then， infected adults and uninfected nymphs were co-fed on the mice. The SFTSV levels were determined in the engorged nymphs using quantitative real-time PCR （qPCR） analysis. Results The alteration of gut bacteria was confirmed by plating the homogenate of faeces onto Luria-Bcrtani （LB） agar plates. Microbial community displayed limited variety in the antibiotic treatment group compared to the control group and the recolonization group. In the model of co-feeding transmission， qPCR analysis revealed that the viral load increased in the antibiotic treatment group compared to the control group and the recolonization group. Conclusion Mouse gut microbiota can inhibit the transmission of SFTSV. The results provide a basis for further exploration of functional bacteria of host gut in SFTSV transmission.

Graphical abstract

关键词

严重发热伴血小板减少综合征病毒 / 长角血蜱 / 肠道 / 微生物

Key words

Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus / Haemaphysalis longicornis / Gut / Microbiota

严重发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是一种由SFTS病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）引起的新发传染病。自2009年在中国发现SFTS以来^［1］，韩国、日本和越南^［2-4］等东亚国家均有SFTS病例报告和流行病学研究。SFTS的主要症状是发热、血小板减少、白细胞和胃肠道异常^［5］。人类的病死率为10%~30%^［6］。该病毒对公众健康构成的威胁日益加剧，人类SFTSV的发病机制尚不完全清楚，目前尚无针对该病毒的治疗方法^［5］。因此，这种疾病已经发展成为包括中国在内的世界各国人民严重的健康问题。

长角血蜱被认为是SFTSV的主要传播媒介^［7］。蜱是专性吸血体外寄生虫，被认为是仅次于蚊子的全球人类传染病的传播媒介^［8］。除了在吸血过程中造成直接伤害外，蜱虫还可以传播细菌、病毒、原生动物和蠕虫，给人类带来巨大痛苦和潜在的致命疾病^［9，10］。总体而言，由于蜱的地理传播、全球社会经济和气候条件变化以及缺乏有效的控制措施，全球范围内蜱传疾病的发病率正在增加^{［11，12］}，蜱传疾病正在对人类和动物健康构成越来越大的威胁。除了病原体，蜱虫还携带着许多的共生微生物。蜱虫的共生微生物在营养适应、发育和繁殖等方面发挥着多种作用^{［13，14］}。本实验室先前研究发现感染SFTSV半饱血长角血蜱中肠微生物物种多样性丰富，这为本研究探讨小鼠肠道菌群在SFTSV传播中的作用提供了一定的研究基础^［15］。

对于哺乳动物等宿主而言，微生物群落主要生活在宿主动物体内和体表，对宿主免疫系统的发育和相关免疫的功能具有重要影响。微生物群落及其代谢产物不仅能够影响机体的免疫稳态，还会影响宿主对多种免疫系统介导的病症的易感性^［16］。宿主与其微生物群之间的动态联系不仅对维持体内平衡至关重要，而且对于在病原体感染的情况下调节免疫反应也很重要^{［17，18］}。例如，微生物群落会影响淋巴结构发育、免疫细胞稳态和成熟、上皮功能、T细胞发育、多种免疫级联反应的诱导、抗菌肽的产生、炎症和自身免疫性疾病等。此外，微生物群还会影响宿主维生素、激素和神经递质的生物合成，以及短链脂肪酸等细菌副产物的产生^［19］。因此，微生物的存在可能对传染病的易感性和愈后恢复发挥重要作用。宿主肠道微生物组可以通过微生物代谢物抑制局部和全身的病原体感染^{［20，21］}。微生物群还会受宿主环境、饮食和抗生素的使用影响。微生物群失调与多种疾病有关，包括代谢疾病、胃肠道疾病、心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤疾病等。宿主和其微生物群落之间数百万年的共同进化形成了一种共生关系，微生物对于适当的宿主免疫至关重要^［22］。可见，哺乳动物宿主的体内共生微生物对于虫媒病原体的传播有着重要影响。然而，宿主肠道微生物对SFTSV传播的影响还有待进一步研究。本研究通过饲喂抗生素和肠道微生物再定殖的方式，影响小鼠肠道微生物。通过构建蜱虫共吸血传播模型，检测若虫的SFTSV载量，从而初步探索宿主肠道微生物对长角血蜱吸血传播SFTSV的影响，探讨研究蜱虫与宿主体内共生微生物与SFTSV传播之间的关系，旨在为蜱虫和蜱传疾病的防控提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

8周龄昆明雄鼠；纳升微量进样器（World Precision Instruments公司）；高通量组织研磨器（Scientz-48，宁波新芝生物科技股份有限公司）；低温离心机（贝克曼库尔特股份有限公司）；Trizol Reagent（赛默飞世耳科技有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、琼脂粉（西陇科学有限公司）；盐酸万古霉素、硫酸新霉素，甲硝唑，氨苄青霉素（上海生工科学有限公司）。

1.2 昆明小鼠饲喂广谱抗生素混合液

按工作液浓度配制抗生素混合液（万古霉素0.5 g/L、新霉素1 g/L、甲硝唑1 g/L、氨苄青霉素1 g/L），每只小鼠20 mL。抗生素液配制后，用0.22 μm滤膜过滤待用。如图1所示，准备鼠龄8周龄的雄鼠9只，分为3组分别命名为对照组、抗生素治疗组、再定殖组，对照组小鼠饲喂无菌水20 mL，每两天更换1次无菌水，抗生素治疗组、再定殖组小鼠饲喂抗生素混合液20 mL，每两天更换1次。同时对照组小鼠每天灌胃400 μL生理盐水，抗生素治疗组、再定殖组小鼠每天分别灌胃400 μL广谱抗生素混合液。小鼠饲喂第五天时，采集粪便1粒，溶解于1 mL生理盐水中，分别用粪便原液及稀释100倍粪便溶液涂布LB平板，放置37 ℃培养箱，培养过夜观察小鼠肠道微生物变化情况。第六天取对照组小鼠新鲜粪便2粒，溶解于2 mL生理盐水后，用于对再定殖组小鼠进行肠道微生物灌胃移植，组内每只小鼠分别灌胃400 μL。抗生素治疗组小鼠灌胃400 μL无菌水。连续灌胃3 d。同时将抗生素治疗组、再定殖组小鼠全部换为无菌水进行饲喂。第十二天分别采集各组小鼠粪便1粒，溶解于1 mL生理盐水中，分别用粪便原液及稀释100倍粪便溶液涂布LB平板，放置37 ℃培养箱，培养过夜观察小鼠肠道微生物变化情况。动物试验由海南医科大学伦理委员会审批批准，编号：HYLL-2021-393，实验过程和动物处死的方法符合动物伦理和动物福利要求。

1.3 长角血蜱注射感染SFTSV并接种至处理后的昆明小鼠

如图2所示，分别各取30头本实验室培养的同批次长角血蜱雌虫、雄虫，使用纳升微量进样器在显微镜下注射SFTSV病毒7.25×10³ FFU。注射后，放置培养箱25 ℃ 85%湿度培养12 d。取15 mL离心管，在距离管口2 cm处切开，沿切口边缘粘贴一圈医用胶带，将中间开孔的棉布料用对小鼠皮肤低刺激性的非凡力布料胶水780与离心管粘合在一起。昆明小鼠腹腔注射180 μL（0.05 g/mL）巴比妥钠进行麻醉。小鼠麻醉后，用电动理发器，在小鼠背部剃除与布料面积相当的鼠毛，均匀涂抹非凡力布料胶水780，同时，布料上也均匀涂抹胶水，静置等待布面和昆明小鼠背部胶水干燥后，用力压合2个表面，将布袋粘合至小鼠背部皮肤。布袋粘合后，观察1 d，确定小鼠适应状态以及布袋粘合牢固情况。每只小鼠分别接种注射感染SFTSV 12 d的长角血蜱雌虫3头、雄虫3头。接种第3天，打开粘合小室，观察长角血蜱吸血情况，当蜱虫吸血至半饱血时，每只小鼠接种未感染SFTSV的长角血蜱若虫20头，与感染病毒的长角血蜱成虫进行共吸血。待长角血蜱若虫饱血后，收集起来，随机取7~15头分别放入含Trizol的RNase-free离心管中冻存至-80 ℃冰箱，用于检测若虫的SFTSV感染率。

1.4 饱血若蜱RNA提取

将冷冻后的长角血蜱饱血若虫，用高通量组织研磨仪70 Hz 10 s研磨3次，室温孵育5 min后，加入80 μL三氯甲烷溶液，充分震荡混匀15 s后，室温静置3 min，12 000×g 4 ℃离心10 min。将上清液部分吸出，转移至新的1.5 mL RNase-free离心管中，加入200 μL异丙醇溶液，加入1.5 μL糖原帮助RNA沉淀，放入4 ℃冰箱静置10 min。12 000×g 4 ℃离心10 min。将上清液弃掉，加入400 μL 75% 乙醇溶液，轻轻颠倒清洗RNA沉淀。7 500×g 4 ℃离心5 min，弃掉上清液。重复洗涤1次。放至室温干燥5 min，加入20 μL RNase-free ddH₂O溶解RNA。在RNase-free离心管中配制反应体系，反应体系如下：提取的长角血蜱饱血若蜱RNA 8 μL、4×gDNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH₂O 4 μL，吹打混匀后，在42 ℃ 孵育2 min。在上述反应管中直接加入4 μL 5×Hi Script Ⅲ qRT Super Mix，吹打混匀后，按37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s反应条件进行逆转录反应。

1.5 饱血若蜱SFTSV载量定量检测

将逆转录得到的cDNA样品进行实时荧光定量PCR，定量检测确定柯氏体和其他微生物的丰度变化，并定量检测SFTSV的病毒载量变化。长角血蜱内参引物ELFA序列引物：上游引物：5'-CGTCTACAAGATTGGTGGCATT-3'，下游引物：5'-CTCAGTGGTCAGGTTGGCAG-3'。SFTSVM保守序列引物：上游引物：5'-GATGAGATGGTCCATGCTGATTCT-3'，下游引物：5'-CTCATGGGGTGGAATGTCCTCAC-3'。实时荧光定量PCR反应体系：2×ChamQ Universal SYBR QPCR Master Mix 10 μL、Primer F 0.4 μL、Primer R 0.4 μL、Template cDNA 1 μL、ddH₂O 8.2 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，60 ℃~95 ℃，△T 1 ℃ 15 s。数据结果导出Excel并按2^-△△CT法进行分析，基因表达水平相对内参引物进行归一化。

1.6 统计学处理

运用2^-△△CT法计算SFTSV载量。实验数据使用GraphPad prism 9.5 进行分析及作图，采用t检验与方差分析进行样本间差异比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 昆明小鼠饲喂抗生素后肠道微生物情况

昆明小鼠饲喂广谱抗生素后，取新鲜粪便涂布LB平板结果如图3，抗生素治疗组、再定殖组小鼠粪便中肠道微生物菌群相较于对照组小鼠菌落情况明显发生改变（图3A~3C），对照组小鼠粪便稀释100倍（图3D）在LB平板生长出透明湿润、针尖大小的菌落还有白色湿润、表面光滑、大小不一的菌落形态。而抗生素治疗组、再定殖组小鼠粪便稀释100倍（图3E、F）在LB平板生长出白色湿润、表面光滑、大小不一的菌落形态。抗生素治疗组、再定殖组小鼠粪便微生物群落较对照组单一。目前，本实验主要根据粪便涂布LB平板的结果判断粪便微生物菌群的组成，后续会对菌群的组成进一步定量分析，确定菌群的组成。

2.2 昆明小鼠肠道微生物再定殖

再定殖组小鼠再定殖正常昆明小鼠肠道微生物后，取新鲜粪便涂布LB平板结果如图4，对照组和再定殖组小鼠相较于抗生素治疗组小鼠，其粪便涂布LB平板菌落情况明显变复杂（图4A~4C），对照组和再定殖组小鼠粪便稀释100倍（图4D、F）在LB平板生长出透明湿润、表面光滑、针尖大小的菌落，还有黄色湿润、表面光滑、大小不一的菌落形态。而抗生素治疗组小鼠粪便稀释100倍（图4E）在LB平板生长出大量白色湿润、表面光滑、大小不一的菌落形态，还有少量黄色湿润、表面光滑、大小不一的菌落形态。抗生素治疗组小鼠粪便微生物群落与再定殖组小鼠再定殖前涂板比较无明显差别。

2.3 抗生素饲喂小鼠对SFTSV在长角血蜱共吸血传播中的影响

感染SFTSV的长角血蜱成虫与健康的长角血蜱若虫共同吸血小鼠，通过实时荧光定量PCR检测饱血若虫SFTSV的感染情况，结果发现（图5），共同吸血正常饲喂的对照组小鼠和再定殖组小鼠的饱血若虫之间病毒载量无明显差别；共同吸血经广谱抗生素处理抗生素治疗组小鼠的饱血若虫病毒载量高于吸血正常饲喂的对照组小鼠以及再定殖组小鼠的若虫。

3 讨论

SFTSV在我国分布广泛，在家畜、野生动物中均有发现^［23］。在山东青岛的一项研究发现，野生啮齿动物SFTSV的阳性率为32.3%^［24］。还有研究显示，泰国的狗SFTSV的阳性率为16.6%^［25］。可见在一定区域内SFTSV在哺乳动物中分布广泛。长角血蜱被认为是SFTSV的载体，家畜、宠物和野生动物可能在病毒通过蜱虫吸血传播过程中起到病毒放大作用。此外，也有研究发现通过接触受感染宠物、被受感染动物咬伤，使病毒在动物与人之间传播，以及接触感染者的血液或粘液使病毒在人与人之间传播^［26-29］。

哺乳动物胃肠道中含有多种微生物，包括真菌、细菌、病毒以及寄生在其肠道中的蠕虫和原生动物等，这些微生物被称为共生微生物群^［30］。宿主微生物区系相互作用，与宿主之间产生互利共赢的关系。宿主在营养丰富的环境中为微生物群提供了一个生理生态位，而微生物群对宿主发挥着各种有益的功能，如生成维生素、消化食物和保护宿主免受病原体的侵袭等^［31］。宿主和微生物群之间数百万年的共同进化形成了一种共生关系。研究发现通过制备无菌小鼠或用抗生素处理小鼠，小鼠的免疫反应出现了改变。完全缺乏微生物的无菌小鼠，会导致小肠、结肠、肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes，MLN）和脾中记忆/效应器T细胞、调节性T细胞和激活的树突状细胞的百分比下降。同时使用抗生素治疗导致CD4⁺细胞产生的细胞因子如干扰素、白介素等减少，进而影响宿主局部（即小肠和大肠）、外周（主要为MLN）和全身性（主要为脾）免疫系统的改变，严重影响免疫细胞的稳态，损害了淋巴组织的发育，改变了对病原体的敏感性，因此微生物对适当的宿主免疫至关重要^{［18，31，32］}。

近年来相关研究证实哺乳动物肠道微生物区系能够影响肠道病毒感染^［33］。一般是通过直接促进病毒对细胞的感染，稳定病毒粒子，以及以促进病毒感染的方式间接调节粘膜免疫反应^［34］。与针对肠道病毒不同的是，哺乳动物肠道内共生微生物可以通过介导干扰素途径的启动限制肠道外哺乳动物病毒的感染，例如，对于呼吸道流感病毒感染，有研究发现细菌代谢物脱氨基酪氨酸参与了Ⅰ型干扰素反应的启动，揭示了肠道微生物可以通过微生物代谢产物局部或系统的调节宿主对病原体的免疫反应^［20］。Stefan等^［35］对哺乳动物共生微生物对其宿主免疫系统调节机制的研究发现，拟杆菌门肠道共生微生物的外膜多糖能够诱导干扰素的表达，通过使用已被证实具有免疫调节作用的脆弱芽孢杆菌被膜多糖-多糖A处理小鼠，结果发现小鼠体内干扰素表达被激活，显著增加了小鼠对水痘病毒和甲型流感病毒的抵抗力。在对抗干扰素α受体1（IFNAR1）阻断抗体处理的小鼠进行注射感染SFTSV的实验中发现，抗生素处理的小鼠死亡率较高，对肺、肝、脾病理检查发现损伤较重^［36］。而抗生素处理的小鼠移植SFTSV感染存活患者的肠道微生物后，显著降低感染SFTSV的抗生素处理小鼠的死亡率，进一步研究发现肠道微生物中存在的嗜黏蛋白阿克曼菌及其代谢产物骆驼蓬碱可抑制因SFTSV感染导致全身性的炎性反应，能有效改善肺、肝、脾的病理损伤，最终降低了小鼠的死亡率^［36］。可见小鼠肠道微生物对小鼠感染SFTSV起到保护作用，人体内的肠道微生物能够影响人体在感染SFTSV后的免疫反应。但嗜黏蛋白阿克曼菌的代谢产物骆驼蓬碱存在局限性，高剂量使用可引发躁动、细胞毒性、谵妄、麻痹或视觉问题等副作用^［37］。因此，需要进一步探索宿主肠道微生物对蜱虫吸血传播SFTSV是否存在影响，也需要进一步研究来确认宿主肠道微生物及其代谢产物对治疗某些人类疾病的潜在应用价值，为后续开发利用肠道微生物制成相关制剂、疫苗，用于阻断蜱虫通过吸血传播SFTSV提供新的研究思路，也为SFTSV感染的临床救治提供新策略。

本研究以健康的昆明小鼠为研究对象，通过饲喂抗生素和肠道微生物再定殖的方式，初步探索宿主肠道微生物对长角血蜱吸血传播SFTSV的影响。研究结果发现，饲喂抗生素后，昆明小鼠粪便中肠道微生物菌落情况明显发生改变，微生物群落种类变得较为单一，进行肠道微生物再定殖后，微生物群落种类恢复，可见通过饲喂广谱抗生素破坏了小鼠原有的肠道微生物菌群结构。检测共同吸血的长角血蜱饱血若虫结果发现相较于无菌水喂养的对照组和再定殖组小鼠的若虫，抗生素处理组的小鼠的饱血若虫病毒感染载量升高。初步认为昆明小鼠肠道微生物能够抑制蜱虫通过吸血传播SFTSV，初步建立了通过蜱虫吸血小鼠评价宿主肠道微生物对SFTSV传播影响的实验模型，后续将进一步完善该实验模型，为深入研究宿主肠道微生物在蜱虫吸血传播SFTSV过程中的功能及作用机制提供研究基础。

作者贡献度说明：

陈京晶、陈晨贡献一致：查找整理文献，设计实验方案及论文框架，撰写论文；周祥参与研究，实施研究过程；袁传飞：提出研究选题，获取技术或材料支持及论文审查；夏乾峰：提出研究选题及指导性支持。

所有作者声明文章内容不存在利益冲突。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82102433)