石斛碱通过作用于SRC调控氧化应激干预糖尿病肾病的机制研究

The mechanism of dendrobine intervenes in diabetic kidney disease by acting on SRC to regulate oxidative stress

摘要

目的 探讨石斛碱通过调控氧化应激干预糖尿病肾病（DKD）的作用机制。 方法 利用OMIM等数据库检索DKD靶点，使用PharmMapper、SuperPred、ChemMapper和ChEMBL数据库获得石斛碱靶点，通过GeneCards、OMIM数据库检筛选氧化应激相关靶点，并取交集靶点。交集靶点导入STRING数据库获取靶标相互联系以构建PPI，利用MCC拓扑算法分析获取关键靶点。关键作用靶点通过DAVID平台进行基因本体论（GO）分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。通过SangerBox平台进行糖尿病肾病临床相关性分析、基因差异表达分析以及ROC分析。将筛选得到的关键靶点通过分子对接和分子动力学模拟进行验证。采用Western Blot实验进行实验验证。 结果 获得DKD-石斛碱-氧化应激交集靶点102个，并筛选出15个关键基因；通过临床相关性分析筛选出11个有临床意义的关键基因；通过差异表达和ROC分析发现CASP3、CXCR4、ESR1、KDR、SRC差异表达明显，且SRC最具有诊断价值（AUC=0.86，P<0.05）；分子对接及分子动力学模拟分析结果发现SRC与石斛碱结合能力最强，且配合物较稳定。Western Blot实验结果表明，与对照组相比SRC和P-SRC在DKD中表达上调（P<0.05），石斛碱可降低其的表达。 结论 石斛碱可以通过作用于SRC调控氧化应激干预糖尿病肾病。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of dendrobine in diabetic kidney disease （DKD） by regulating oxidative stress. Methods DMIM and other databases were used to retrieve DKD targets， PharmMapper， SuperPred， ChemMapper and ChEMBL databases were used to obtain Dendrobine base targets， and oxidative stress-related targets were screened by GeneCards and OMIM databases， and intersecting targets were obtained. The intersection targets were imported into the STRING database to obtain the interconnection of the targets to construct PPI， and the key targets were analyzed by MCC topology algorithm. Gene ontology （GO） analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis were performed on key targets through the DAVID platform. The SangerBox platform was used to analyze the clinical correlation of diabetic nephropathy， gene differential expression analysis and ROC analysis. The key targets obtained from the screening were verified by molecular docking and molecular dynamics simulations. Western blot experiments were used for verification. Results A total of 102 DKD-dendrobine-oxidative stress intersection targets were obtained， and 15 key genes were screened. 11 clinically significant key genes were screened through clinical correlation analysis. The differential expression and ROC analysis showed that CASP3， CXCR4， ESR1， KDR and SRC were differentially expressed， and SRC had the most diagnostic value （AUC=0.86， P<0.05）. The results of Western blot experiments showed that the expression of SRC and P-SRC was up-regulated in DKD （P<0.05） compared with the control group， and the expression of dendrobine was reduced. Conclusion Dendrobine can intervene in diabetic kidney disease by acting on SRC to regulate oxidative stress.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 石斛碱 / 氧化应激 / 网络药理学 / 分子对接

Key words

Diabetic kidney disease / Dendrobine / Oxidative stress / Network pharmacology / Molecular docking

糖尿病肾病（Diabetic kidney disease，DKD）由高血糖引起代谢异常而发生发展的慢性肾脏疾病，最终会发展为终末期肾病^［1］。DKD患病率较高且早期无明显症状特点，虽然早期发展缓慢，并且具有可逆性，但是后期病情发展迅速、预后较差^［2，3］。DKD的发病机制尚未明确且与多种影响因素有关^［4］。因此，持续探索DKD的发病机制寻找潜在靶点具有深远的意义。

研究表明，当活性氧产生过多或内源性抗氧化系统的活性受到抑制时会发生氧化应激（Oxidative Stress，OS）^［5］。文献表明，氧化应激对DKD的发生发展具有显著影响，促氧化剂酶诱导产生过量活性氧，氧化应激增强，引发肾纤维化和内皮功能障碍^［6］。

石斛碱是金钗石斛的茎中提取出的半萜类生物碱。文献表明，药用石斛中的生物碱具有降低血糖和抗氧化的作用^［7］。石斛碱作为石斛中最主要的有效成分，具有恢复糖脂代谢水平，减轻肾脏损伤和抑制肾内炎症发展等作用^［8-10］。石斛碱具有改善DKD的功效，且具有抗炎和抗氧化应激的作用^［11］，但具体机制不明确，因此仍需要进一步的深入研究。

综上，本研究运用网络药理学、生物信息学和分子对接技术，系统地探索石斛碱通过调控氧化应激基因表达干预DKD的作用机制，并进行体外实验验证，为后续研究石斛碱治疗DKD的作用机制提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验细胞、试剂与器材

人肾小管上皮细胞HK-2细胞株（KCB200815YJ），来源中国科学院昆明细胞库；SDS-PAGE凝胶试剂盒（P1200-2），Solarbio；β-actin（PTM-5436），景杰生物；二抗（SAB48168），Bioworld；荧光倒置显微镜（Olympus IX71），Olympus公司；显影液（WBKLS0100），Millipore；免疫蛋白印迹检测分析系统（BIO-RAD Chemidoc Touch），美国Bio-Rad公司。

1.2 疾病靶点的获取与筛选

检索OMIM（https：//www.omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库获取DKD疾病靶点，合并去重。其中GeneCards中Relevance score>30。

1.3 石斛碱的靶点获取

通过PharmMapper（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）、SuperPred（https：//prediction.charite.de/）、SwissTargetPrediction（http：//swisstargetprediction.ch/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）、ChemMapper（http：//lilab-ecust.cn/chemmapper/help.html）和ChEMBL（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/）以“Dendrobine”作为关键词进行检索，通过UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库将所得靶点名称进行转换，最后合并去重。

1.4 氧化应激相关基因靶点的获取

通过GeneCards和OMIM检索“Oxidative Stress”获得相关靶点，合并去重。

1.5 蛋白质相互作用（Protein‑Protein Interaction Networks，PPI）网络的构建及关键核心靶点的筛选

将获取的石斛碱、DKD和氧化应激的相关靶标借助Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线作图工具取三者交集。利用STRING数据库（https：//string-db.org/）构建PPI，选择物种为“Home sapiens”，隐藏网络中断开连接的节点，构建PPI网络图。下载对应的tsv文件，并导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化处理，并采用MCC算法筛选出核心靶点（Hub genes）。

1.6 基因本体论（Gene Ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

利用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库对关键靶点进行GO和KEGG分析，对导出的结果进行列表整理，并筛选出P<0.05的生物过程和通路，选取前20的结果导入微生信工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行处理与后续的分析及讨论。

1.7 临床相关性分析

采用在线Nephroseq v5（http：//v5.nephroseq.org/）平台确定具有临床意义的关键靶点，将MCC算法选择的15个关键基因进行DKD相关分析（使用肾小球滤过率，血清肌酐水平作为指标）。

1.8 基因的表达差异分析及接受者操作特性曲线（Receiver operating characteristic curve，ROC）分析

在GEO数据库检索GSE30528并下载相关文件，使用SangerBox（http：//sangerbox.com/）生物医学数据盒子分析关键靶点在测试集样本中的差异表达并进行ROC分析。

1.9 分子对接

将Hub genes对应的蛋白以及化合物导入DS BIOVIA Discovery Studio软件进行高精度对接模拟评估蛋白-配体的亲和力，PubChem数据库检索有效成分的分子式，PDB数据库中获取目的蛋白的结构文件。

1.10 分子动力学模拟

使用Schordinger 2019软件“Desmond”模块进行操作。采用预定义的SPC水模型，利用OPLS2005力场模拟水分子。为了中和系统电荷，加入适量的氯离子/钠离子来平衡系统电荷，并随机放置在溶剂化系统中。在构建溶剂化系统后，使用与Desmond模块集成的默认协议对系统进行能量最小化。采用Nose-Hoover温度耦合和各向同性标度，将温度和压力保持在300 K和1个大气压；操作之后，运行100 ns的NPT模拟，并以100 ps的间隔保存进行轨迹保存。

1.11 Western Blot实验验证

以Conrtol组、高糖组（HG组，40 mmol/L）、石斛碱组（0.1、1、10 μmol/L）为实验分组，Control组用低糖DMED培养基培养，其余组用高糖DMEM培养基培养。细胞融合度达到50%时，加入D-葡萄糖使最终浓度为40 mmol/L，1 h后石斛碱组加入不同剂量的石斛碱进行干预。将处于对数生长期的HK-2细胞制成单细胞悬液，计数，种于10 cm培养皿，等到细胞贴壁过后，将石斛碱含药血清加入到培养皿中，放入培养箱中24 h；培养基丢弃后用提前冷却的PBS洗涤，加入150 μL含PMSF的细胞裂解液并反复吹打，在冰上裂解30 min后离心15 min（4 ℃，12 000 r/min），吸取上清得到细胞总蛋白，用BCA定量试剂盒定量后电泳，转膜，孵育一抗（SRC和P-SRC体积比：1∶500，β-catin体积比：1∶1 000），洗涤膜后孵育二抗（体积比：1∶8 000），洗涤膜后使用ECL试剂盒，最后在发光成像分析仪中曝光，其发光强度通过Image Lab 5.2.1软件测量。

1.12 统计学分析

实验所得数据采用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析。两组之间的比较采用独立样本t检验方法进行，多组之间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DKD、石斛碱和氧化应激相关交集靶点的获取及Hub genes筛选

通过检索Genecards、DrugBank、TTD和OMIM数据库合并去重，共得到DKD靶点1 209个。检索ChEMBL、SuperPred、BATMAN-TCM、PharmMapper、SwissTargetPrediction和ChemMappe合并去重，共获得石斛碱靶点504个。通过检索OMIM和GeneCards数据库得到氧化应激相关基因靶点，合并去重后得到10181个靶点。取DKD-石斛碱-氧化应激交集靶点，共获得102个（图1a）。

将从STRING中获取的数据导入Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络（图1b）。利用MCC算法筛选出了15个核心靶点（图1c）。PPI网络图中共包含102个节点，代表了所有的预测靶点；1 079条边线，代表相互作用关系。

2.2 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID平台对关键基因进行GO和KEGG分析。其中，GO分析获得生物学过程（Biological Pathways，BP）156个，细胞组件（Cellular component，CC）58个，分子功能（Molecular Function，MF）108个，根据P值的大小分别列举前20的条目（图2）分析，主要涉及信号转导、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调节、细胞迁移的正调节等（图2a）；细胞组件主要涉及受体复合体、质膜、细胞外区域等（图2b）生物学过程；分子功能主要涉及蛋白质的结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶的活性、蛋白酪氨酸激酶的活性等（图2c）。

KEGG分析涉及通路150条，对前20条KEGG信号通路进行可视化处理（图2d），主要涉及HIF-Ⅰ、PI3K-Akt和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）等信号通路。

2.3 临床相关性分析

将筛选的15个Hub genes进行临床相关性分析，分析发现11个Hub genes具有临床意义，DKD患者的缺氧诱导因子1A（HIF1A）、趋化因子基质细胞衍生因子-4（CXCR4）、胱天蛋白酶3（CASP3）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）和Janus激酶2（JAK2）的表达与肾小球滤过率（Glomerular filtration rate，GFR）呈负相关（图3a~g）。同时，在DKD患者中，表皮生长因子受体（EGFR）、激酶插入域蛋白受体（KDR）、人雌激素受体（ESR1）和雷帕霉素靶蛋白（MTOR）的表达与GFR呈正相关（图3h、i）。DKD患者中原癌基因（SRC）和胱天蛋白酶3（CASP3）的表达与血清肌酐（SCR）呈正相关（图3j~k）。

2.4 基因的差异表达分析及ROC分析

根据基因的差异表达分析结果显示，与正常的组织相比，患者ESR1和KDR的mRNA表达显著下调，而CASP3、CXCR4和SRC基因的mRNA表达显著上调（图4）。利用GSE30528数据集（n=22，DKD=9，Control=13）作为测试集验证分析对5个核心靶点进行验证分析。结果如图4所示，与对照组相比，SRC在数据集GSE30528中DKD组中表达显著增加，而STAT3在该数据集中DKD组显著降低。SRC在DKD中有显著诊断价值（SRC：AUC=0.86，P<0.05）。

2.5 分子对接结果分析

将5个关键基因编码的蛋白及化合物的三维结构导入DS BIOVIA Discovery Studio 2016 v16.1软件与石斛碱进行分子对接，记录相应对接分数，化合物与治疗靶点的亲和力越好对接分数就越高（表1）。

结果显示，石斛碱能与2个基因（SRC、ESR1）编码的蛋白活性口袋中多个氨基酸残基结合通过形成范德华力、氢键或π-π键等，而形成稳定的对接模式（图5）。其中SRC与石斛碱的对接分数最高，达到了75.370 9分。

2.6 分子动力学模拟

均方根偏差（Root Mean Square Deviation，RMSD）是用于测量特定坐标系中的一组原子位移的平均变化（图6a），可以根据蛋白质RMSD分析模拟是否已达到平衡。结果显示蛋白质在模拟的过程中构象的变化较大，但其RMSD值稳定在固定的值附近。配体RMSD可以稳定在一个固定值附近，说明配体可以稳定结合于该蛋白。均方根波动值（Root Mean Square Fluctuation，RMSF）评价了沿蛋白质链的局部变化和配体原子位置的变化。蛋白RMSF峰值表示在模拟过程中波动最大的蛋白质区域（图6b），蛋白的RMSF波动较小，因此在模拟过程中是稳定的。配体RMSF显示了按原子分解的配体波动（图6c），结果表示在模拟过程中波动较小，说明模拟过程是稳定的。蛋白分子作用图（图6d）石斛碱配体与SRC-石斛碱复合物的ASP348位残基表现出15%的氢键作用，与ASP258位残基表现出13%的氢键作用。在整个模拟过程中监测蛋白与配体的相互作用，图6e和f表示在模拟过程中表现出更多水桥和氢键的作用。一些残基与配体有不止一次的特定接触，根据图右侧的刻度，配体用更深的橘色表示。

2.7 Western Bolt实验结果

Western Blot实验表明，与Control组相较，HG组中SRC和P-SRC的表达水平明显升高（SRC：tCON：HG=0.002，P-SRC：tCON：HG=0.001，均P<0.001），且差异具有统计学意义；与HG组相比，给药组中SRC和P-SRC表达水平明显降低（SRC：tHE：0.1 μmol/L=0.000 6，tHE：1 μmol/L=0.003 7；P-SRC：tHG：0.1 μmol/L=0.001，tHG：1 μmol/L=0.0233，均P<0.05），且差异具有统计学意义。

3 讨论

DKD是终末期肾病的主要原因，目前对DKD的病理生理学机制有着广泛的研究^［12］。根据前期文献研究调查，石斛碱并无明显毒性^［13］，因此笔者将通过网络药理学等分析方法研究石斛碱通过调控氧化应激干预DKD的作用机制。

本研究基于文章通过网络药理学方法筛选得到了15个Hub genes（STAT3、SRC、IGF1、EGFR、ALB、HIF1A、MMP9、CXCR4、CASP3、KDR、MMP2、ESR1、MTOR、JAK2、NOS3）。GO功能分析显示，石斛碱通过质膜、细胞质、细胞外区域等分子组件参与细胞迁移的积极调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控等生物学过程发挥蛋白结合、酶结合等分子功能。KEGG分析显示，靶点蛋白主要涉及HIF-Ⅰ、PI3K-Akt和MAPK等信号通路。

氧化应激是指氧化还原失衡引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度积累，对身体造成氧化损伤。高糖可诱导ROS过量产生，线粒体结构被破坏，导致线粒体呼吸功能和ATP生成下降，导致能量代谢紊乱，肾小管细胞凋亡^［14］。研究表明，石斛碱可改善线粒体功能并减少ROS产生，改善氧化应激反应^［15］。HIF是一种高糖诱导因子，是参与葡萄糖利用、氧化应激和纤维化发生的主要转录调节因子，在高血糖条件下可以增加HIF诱导基因的表达^［16］。高血糖可以通过线粒体ROS、促炎细胞因子激活HIF^［17］。HIF-1在DKD患者的肾脏中异常表达，通常在肾小管间质损伤前被激活，而HIF-1α在糖尿病小鼠的肾脏中高表达^{［18，19］}。PI3K-Akt是一种多种功能的信号通路，参与细胞增殖、分化、运动性和脂质代谢^{［20，21］}，PI3K-Akt通路已被证实在糖尿病患者的肾小管细胞中被激活^［22］。PI3K是激活该信号通路的关键物质，可激活Akt，会将该信号通路激，足细胞会分泌大量的Ⅳ型胶原，使细胞外基质增多，导致肾小球硬化^［23］。ROS可诱导肾小管上皮细胞间充质转分化，通过PI3K-Akt通路促进肾纤维化^［24］。据报道，OS可激活MAPK信号通路，从而加重DKD过程^［25］。DKD中导致蛋白尿的关键事件与足细胞损伤有关^［26］，在引发足细胞凋亡的机制中ROS起着主要作用^［27］。当MAPK被激活时，ROS中的一种促凋亡信号因子就会导致细胞凋亡^［28］。此外，MAPK可被慢性高血糖激活，进而导致局部炎症反应发生，而在糖尿病及其并发症中，氧化应激和炎症是两个互相调节的过程，进一步推动了DKD的发展^［29］。石斛碱已被证明具有恢复糖脂代谢作用，同时还具有抗炎、抗氧化作用^［11］。结合GO和KEGG结果推测石斛碱可能通过调控HIF-Ⅰ、PI3K-Akt和MAPK等信号通路，影响氧化应激最终干预DKD的进程。

基因的差异表达分析结果表示，CASP3、CXCR4和SRC在DKD中的表达高于正常组，ALB、MTOR、STAT3表达虽高于正常组，但是不具有统计学意义（P>0.05）。在ROC诊断分析中发现ESR1、KDR、CASP3、CXCR4和SRC五个基因具有统计学意义，且发现SRC是最具有诊断价值的诊断标志物（AUC=0.86，P<0.05）。分子对接结果表明，SRC与石斛碱对接成功，且有较好的亲和力，对接分数为75.3709分。分子动力学模拟结果表明，SRC和石斛碱具有良好的结合能力。Western Blot实验结果表明，石斛碱干预后，细胞中SRC蛋白的表达上调（P<0.05）。

SRC也称c-Src，Src家族激酶（SFKs）成员之一，越来越多的证据表明，SFKs在DKD的发展中起着重要作用 ^［30］。Src家族激酶是具有非受体酪氨酸激酶活性的蛋白质，其可促进肾纤维化的发展；抑制Src可以改善糖尿病肾纤维化^［31］。氧化应激产生的大量ROS会引发一系列反应，最终导致Src蛋白的激活^［32］。DKD背后的主要机制是氧化应激（OS），通过生成促炎因子和不同途径的激活，他们促进促氧化状态的抗氧化系统，最后，改变肾脏过滤单位^［33］。研究发现，随着年龄的增长，ROS积累增强Src激酶家族的活性，诱导脂质过氧化、DNA链断裂和氧化损伤，导致细胞功能进行性丧失^［34］。

网络药理学、生物信息学和分子对接技术角度初步探究了石斛碱可能靶向SRC调控氧化应激干预糖尿病肾病的作用机制，为石斛碱治疗DKD的研究提供新思路。

作者贡献度说明：

李军：撰写论文并修改；薛铃芝、马群负责网络药理学、分子对接等数据分析与整理；张楠楠对文章提出修改意见及最终审核。

所有作者声明本研究不存在利益冲突。

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