基于miR‑26a/TRPC6轴探究六味地黄汤对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用机制

Renoprotective effect and mechanism of Liuwei Dihuang Decoction on diabetic nephropathy in a rat model based on miR‑26a/TRPC6 axis

摘要

目的 探讨六味地黄汤改善糖尿病肾病大鼠的作用机制。 方法 八周龄雄性SD大鼠60只，体质量180~220 g，随机分为6组（n=10），即正常组、模型组、六味地黄汤低剂量组，六味地黄汤中剂量组，六味地黄汤高剂量组以及厄贝沙坦处理组。正常组常规饲料喂养，联合一次性等剂量枸橼酸缓冲液腹腔注射。其余50只采用高脂饲养加一次性注射链脲佐菌素造模。造模成功后，给予六味地黄汤灌胃治疗，阳性对照使用厄贝沙坦处理。给药结束后先收集24 h尿液，生化法检测尿蛋白含量；ELISA检测空腹血糖、肌酐含量，检测大鼠血清中炎性因子白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素1β（IL-1β）水平。大鼠称重，处死，分离双肾组织，苏木素-伊红（H&E）染色观察各组大鼠肾脏组织变化；qPCR检测miR-26a表达水平；Western blot和免疫组化检测肾脏组织中TRPC6表达。 结果 与正常组比较，模型组中空腹血糖、24 h尿蛋白、肌酐水平明显升高，体重降低，肾指数升高，炎性因子IL-6和IL-1β表达显著升高，miR-26a表达降低，TRPC6表达水平升高（P<0.05），模型组大鼠中肾组织损伤严重；与模型组比较，六味地黄汤灌胃处理后，空腹血糖、24 h尿蛋白、肌酐水平降低，体重升高，肾指数降低，炎性因子IL-6和IL-1β表达降低，miR-26a表达增强，TRPC6表达受到抑制（P<0.05），大鼠肾组织损伤得到改善，且高剂量组改善效果优于低剂量组。 结论 六味地黄汤可能通过miR-26a/TRPC6分子轴改善大鼠糖尿病肾病。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction in improving diabetic nephropathy rats. Methods A total of 60 eight-week-old male SD rats， weighing 180~220 g， were randomly divided into 6 groups （n=10）， including the normal group， the model group， the Liuwei Dihuang Decoction low-dose group， the Liuwei Dihuang Decoction medium-dose group， the Liuwei Dihuang Decoction high-dose group， and the irbesartan treatment group. The normal group was fed with routine feed and intraperitoneal injection of an one-time citric acid buffer. The other 50 animals were fed with high-fat feed and molded with streptozotocin injection. After the successful modeling， Liuwei Dihuang Decoction was given as intragastric treatment， positive control was treated with irbesartan. After the administration， the urine was collected for 24 h and the protein content was detected by biochemical methods. The serum levels of inflammatory factors interleukin-6 （IL-6） and interleukin-1β （IL-1β） were measured by ELISA. The rats were weighed， killed， and the renal tissues were separated. Hematoxylin-eosin staining （H&E） was used to observe the changes of renal tissues in each group. The expression level of miR‑26a was detected by qPCR. Western blot and immunohistochemistry were used to detect TRPC6 expression in renal tissues. Results Compared to the normal group， fasting blood glucose， 24 h urinary protein， and creatinine levels in the model group were significantly increased， body weight was decreased， renal index was increased， IL-6 and IL-1β expressions were significantly increased， miR‑26a expression was decreased， TRPC6 expression level was increased （P<0.05）， and mesonephric tissue damage was severe in the model group. Compared to the model group， after the intragastric administration of Liuwei Dihuang Decoction， fasting blood glucose， 24 h urinary protein， and creatinine levels were decreased， body weight was increased， renal index was decreased， IL-6 and IL-1β expressions were decreased， miR‑26a expression was enhanced， TRPC6 expression was inhibited （P<0.05）， and renal tissue injury was improved. The improvement effect of the high-dose group was better than that of the low-dose group. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction may improve diabetic nephropathy in rats through the molecular axis of miR-26a-TRPC6.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 六味地黄汤 / miR-26a / TRPC6

Key words

Diabetic nephropathy / Liuwei Dihuang Decoction / miR-26a / TRPC6

糖尿病的患病率已达到流行病的程度，并在全球范围内持续迅速增加。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种已知的糖尿病患者微血管并发症，是一种慢性代谢紊乱高血糖引起肾脏各种细胞类型的功能障碍，最终导致进行性肾功能衰竭^［1，2］。对DN的治疗，西医尚无特效药物。中药六味地黄汤（Liuwei Dihuang Decoction，LW）已经被证实能够改善DN^［3，4］。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一种功能性非编码RNA，其异常表达与DN进展有关，并且能够作为DN诊断和预后的生物标志物^［5］。研究表明，miR-26a在DN患者中异常表达，并且通过多种途径调控DN进展^［6］。瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（transient receptor potential cation channel 6，TRPC6）广泛表达于肾组织。研究发现，TRPC6参与DN进展的调控^［7］，并且与DN的治疗有关^［8］。相关文献显示TRPC6是miR-26a的潜在靶基因，miR-26a/TRPC6分子轴在DN中的作用已经被报道^［9］。然而，六味地黄汤是否能够通过miR-26a-TRPC6分子轴发挥抑制DN进展的作用有待进一步探索。本研究通过动物模型探讨六味地黄汤对DN大鼠的肾保护作用及其miRNA的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

八周龄雄性SD大鼠，体质量180~220 g，每组10只，共60只。大鼠购自购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2022-0052。大鼠为SPF级饲养环境，环境温度设置在（22±2） ℃，相对湿度维持在45%~65%，每日光照时间规定12 h，保证大鼠有充足的水源及其饲料。本研究通过云南中医药大学实验动物伦理委员会审批（伦理审批号：DW2023-017）。

1.2 主要试剂与仪器

主要试剂：链脲佐菌素（STZ，S0130，sigma公司）；高脂高糖饲料（D12492，RD公司）；厄贝沙坦（138402-11-6，瑞威尔生物科技）；苏木素-伊红染色试剂盒（C0105S，碧云天公司）；TRPC6抗体（ab228771，Abcam公司）；RNA提取试剂盒（DP419，天根生化科技公司）；逆转录试剂盒（RR037A，Takara公司）；qPCR试剂盒（1725121，伯乐）；尿蛋白检测试剂盒（C035-2-1，南京建成）；肌酐检测试剂盒（BES20377BO，上海博尔森）；大鼠白细胞介素6，IL-6试剂盒（ml102828，上海酶联）；大鼠白细胞介素1β，IL-1β试剂盒（ml037361，上海酶联）。

主要仪器：光学显微镜（DM125，日本奥林巴斯公司）；超薄切片机（CM1860，德国莱卡）；血糖仪（Performa Connect，罗氏）；多功能酶标仪（A51119700DP，赛默飞）；蛋白电泳仪、转膜仪（Mini-PROTEAN^® Tetra，Trans-Blot Turbo，伯乐）；荧光定量PCR仪（CFX96 Touch，伯乐）；蛋白成像系统（Amersham Imager 600，GE）。

1.3 六味地黄汤的制备

六味地黄汤按熟地黄、茯苓、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻6∶6∶3∶3∶2∶2配伍组成，先用药材总质量5倍量的蒸馏水将药材浸泡2 h，大火煮沸后文火煎煮30 min，收集药液；再向药渣中加入适量蒸馏水煎煮第2次，收集药液，将2次药液混匀后通过物理浓缩至生药含量为1 g/mL，根据每次灌胃量分装，4 ℃保存。

组方为熟地黄30 g、茯苓30 g、山茱萸15 g、山药15 g、牡丹皮10 g和泽泻10 g，该院临床推荐用量为110 g/d，则根据体表面积折算公式计算六味地黄汤中剂量=110×0.018×5=9.9 g/kg，低剂量则为4.95 g/kg，高剂量为19.8 g/kg。

1.4 模型构建及动物分组

根据已有文献对大鼠进行造模^［10］。60只大鼠分为正常组、模型组、六味地黄汤低剂量处理组（低剂量组）、六味地黄汤低剂量处理组（中剂量组）、六味地黄汤低剂量处理组（高剂量组）、以及厄贝沙坦组，每组10只。模型组组大鼠给予高脂高糖饲料喂养，6周后联合空腹注射一次性链脲佐菌素（STZ，35 mg/kg）；正常组常规饲料喂养，联合一次性等剂量枸橼酸缓冲液腹腔注射，每2周测量大鼠体重记录。72 h后以随机血糖≥16.7 mol/L，即为糖尿病模型建立成功。继续高脂高糖饲料喂养，代谢笼收集糖尿病大鼠STZ处理后4~6周的尿液，测定其体积和蛋白浓度，验证蛋白尿≥30 mg/24 h为DN。模型建立成功后，灌胃六味地黄汤或厄贝沙坦连续6周，每日一次，正常组和模型组给予等量蒸馏水。

1.5 样本收集

不同分组处理后，收集代谢笼中24 h尿液，用于检测尿蛋白含量；麻醉大鼠，尾静脉采血，检测大鼠空腹血糖含量；腹部主动脉采血，用于炎症因子以及血肌酐的检测。处死，取肾脏（双肾）分别称重记录，将右肾用PBS洗净吸干放4%多聚甲醛中固定，进行后续病理学检测；另一半用锡纸包裹放-20 ℃保存用于后续实验。

1.6 生化指标检测

大鼠尾静脉取血，罗氏血糖仪检测各组大鼠尾静脉空腹血糖浓度；收集大鼠24 h尿液，于4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，取上清液。按照制造商的说明，分别用尿蛋白试剂盒、肌酐试剂盒检测大鼠尿蛋白；腹主动脉采血，3 000 r/min，离心15 min，分离血清，肌酐试剂盒检测大鼠肌酐水平。

1.7 大鼠血清炎性因子检测

抽取大鼠空腹尾静脉血，于2 000 r/min，离心15 min后取上清液，使用IL-6试剂盒和IL-1β试剂盒检测大鼠血清中炎性因子的水平。

1.8 苏木素‑伊红（H&E）染色

肾组织用4%多聚甲醛固定72 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明。石蜡包埋、切片。石蜡切片常规二甲苯、乙醇脱蜡至水化，苏木素染色10 min，0.7% 盐酸乙醇分化，流水洗涤后，伊红液浸染3 min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。切片于光学显微镜下观察分析。

肾脏病理评分：0分为无肾小管损伤；1分为轻微损伤（受损肾小管占总肾小管<5%）；2分为轻度损伤（受损肾小管占总肾小管的5%~25%）；3分为中度损伤（受损肾小管占总肾小管的25%~75%）；4分为重度损伤（受损肾小管占总肾小管>5%），评分越高受损程度越严重。

1.9 实时荧光定量PCR（Quantitative real‑time PCR，qPCR）

使用RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA。测定RNA浓度，一步法逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。然后进行定量PCR反应，反应体系为：H₂O 7 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，总体系共20 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min，然后3步反应，95 ℃变性15 s，60 ℃ 退火30 s，70 ℃延伸10 s，共45个循环。

引物：miR-26a（F：5′-CCGGGACCCAGTT CAAGTAA-3′，R：5′-CCCCGAGCCAAGTAATGGAG-3′）；U6 （F：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC A-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）；TRPC6（F：5′-TCTGTGCCACAGATGTGAAG-3′，R：5′-AGCGTGTGAGGCGGTAGTAG-3′）；GAPDH（F：5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，R：5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′）。

1.10 蛋白免疫印迹（Western blot，WB）

实验结束后取肾组织检测TRPC6蛋白表达。提取大鼠肾皮质蛋白，BCA试剂盒测细胞总蛋白浓度，根据配方配制10%的分离胶20 mL，浓缩胶入电泳槽中，加入电泳液，上样30 μg蛋白，加入marker后开始电泳；转膜：用甲醇溶液激发待用PVDF膜15 s后和滤纸均放入transfer中浸泡备用，按顺序铺放海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫，放置转膜槽内，倒入预冷的转膜缓冲液，放入冰袋，电流300 mA，4 ℃，1.5 h；封闭：用镊子夹取PVDF膜于TBST洗5 min，倒掉TBST，加入5%的脱脂奶粉充分覆盖条带，室温慢速下摇床封闭2 h；一抗孵育；弃掉封闭液，加入抗体稀释液配制的一抗TRPC6（稀释比例1∶1 000），置于4 ℃恒温摇床孵育过夜；二抗孵育：加入适量TBST清洗PVDF膜，每次20 min，一共3次，加入抗体稀释液配制的二抗（稀释比例1∶10 000），室温摇床孵育1.5 h；曝光：加入适量TBST清洗PVDF，15 min×4次后，按照1∶1比例配制发光液，PVDF膜放置玻璃板上，加200 μL发光液，自动曝光，保存条带图片。

1.11 免疫组化

取石蜡切片，常规脱蜡至水。3%H₂O₂于室温下孵育10 min，清除内源性过氧化酶；PBS冲洗3次，山羊血清封闭；滴加一抗TRPC6（1∶100），37 ℃孵育1 h；PBS洗3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗3次，加SABC，37 ℃孵育30 min；PBS洗3次，DAB对切片室温显色；苏木素复染；乙醇梯度脱水，二甲苯透明；中性树脂封片，镜下观察，拍照。

免疫组化半定量评分标准：<10%染色的细胞为阴性染色，1分；10%~49%染色的细胞评分为2；50%~74%染色的细胞评分为3；75%~100%染色的细胞评分为4。染色颜色评分为浅黄色颗粒（1）、棕黄色颗粒（2）、棕色颗粒（3）。最终评分为染色数评分乘以染色颜色评分^［11］。

1.12 统计学分析

实验所得结果用SPSS 20.0进行分析，多组比较和两组间比较分别采用单因素方差分析和t检验，GraphPad Prism 7对实验数据进行绘制。P<0.05表示差异具有统计学意义，所有实验至少重复3次。

2 结果

2.1 六味地黄汤对大鼠血糖、尿蛋白和肌酐的影响

与正常组相比，模型组的空腹血糖、尿蛋白以及肌酐水平较高，具有统计学差异（P<0.05）；DN大鼠经过六味地黄汤干预后，空腹血糖、尿蛋白以及肌酐水平降低，且随着六味地黄汤剂量的增加，空腹血糖、尿蛋白以及肌酐水平降低越多（P<0.05），高剂量六味地黄汤干预效果接近厄贝沙坦干预效果，见表1。这些结果表明了六味地黄汤对于DN大鼠的保护作用。

2.2 六味地黄汤对大鼠肾重及肾指数的影响

相比于正常组，模型组大鼠体重显著降低（P<0.05），六味地黄汤治疗后，大鼠体重得到了恢复。此外，与正常组相比，模型组大鼠肾重和肾指数（肾重/体重，mg/g）显著增加（P<0.05）；与模型组相比，六味地黄汤治疗后大鼠肾重和肾指数降低，且高剂量能显著降低肾重和肾指数（P<0.05）。这些研究表明，六味地黄汤能在一定程度上抑制DN大鼠肾脏肥大，见表2。

2.3 六味地黄汤对大鼠血清炎性因子的影响

与正常组相比，模型组大鼠血清中IL-6和IL-1β水平显著增加（P<0.05）；与模型组比较，六味地黄汤低、中、高剂量组大鼠IL-6和IL-1β水平显著降低（P<0.05）；且六味地黄汤高剂量组对大鼠血清IL-6和IL-1β的抑制作用更接近厄贝沙坦，见表3。

2.4 六味地黄汤对大鼠肾脏病理的影响

由图1可以看出，正常组大鼠肾脏组织形态结构完整清晰，肾小管无萎缩，未发生明显病理变化；模型组肾小球形状不规则，出现粘连，部分肾小管扩张，肾血管瘀血；与模型组相比，六味地黄汤处理后肾脏组织的病变程度较模型组有所好转，肾小球，肾血管异常变化明显改善。此外，肾小管损伤评分显示，六味地黄汤的干预显著抑制大鼠肾小管损伤，且随着剂量升高，抑制效果增强（图2）。

2.5 六味地黄汤对于大鼠miR‑26a表达水平的调控

研究表明，miR-26a在DN患者中异常低表达，能够作为DN的一个诊断标志物，并且影响DN的发生发展和治疗。为了探究六味地黄汤是否通过miR-26a影响DN进展，使用qPCR检测各组大鼠肾脏组织中miR-26a表达水平。如图3所示，相比于正常对照大鼠（1.00±0.00），模型大鼠肾脏组织中miR-26a表达显著降低（0.22±0.17）（P<0.05）；经过六味地黄汤干预后，miR-26a表达恢复。低剂量六味地黄汤中miR-26a表达水平为（0.34±0.04），中剂量六味地黄汤中miR-26a表达水平为（0.44±0.06），相比于模型组表达显著上调（P<0.05）。高剂量六味地黄汤对miR-26a的上调作用较明显（0.76±0.04，P<0.05），其干预效果接近厄贝沙坦组（0.84±0.06）。这些数据表明六味地黄汤对miR-26a的调控作用。

2.6 六味地黄汤对大鼠TRPC6蛋白表达水平的调控

研究表明，miR-26a-TRPC6轴与DN进展和治疗相关。据此，本研究探究TRPC6在六味地黄汤-miR-26a介导的DN调控中是否发挥作用。Western blot结果（图4）显示，相比于正常对照大鼠（0.39±0.04），TRPC6在模型大鼠肾脏中表达上调（1.31±0.04）（P<0.05）；六味地黄汤干预后，大鼠肾脏中TRPC6表达被抑制。低剂量六味地黄汤中TRPC6表达水平为（1.11±0.04），中剂量六味地黄汤中TRPC6表达水平为（0.94±0.03），相比于模型组表达显著下调（P<0.05）。在六味地黄汤高剂量组TRPC6抑制较明显（0.58±0.05）（P<0.05），其干预效果较厄贝沙坦组好（0.64±0.03）。

进一步使用qPCR检测TRPC6表达（图5），相比于正常对照大鼠（1.01±0.05），TRPC6的mRNA水平在模型大鼠肾脏中表达上调（3.29±0.07）（P<0.05）；六味地黄汤干预后，大鼠肾脏中TRPC6表达被抑制。低剂量六味地黄汤中TRPC6表达水平为（2.76±0.09），中剂量六味地黄汤中TRPC6表达水平为（2.30±0.05），相比于模型组表达显著下调（P<0.05）。在六味地黄汤高剂量组TRPC6抑制较明显（1.49±0.03）（P<0.05），其干预效果较厄贝沙坦组好（1.90±0.03）。

此外，免疫组化实验结果与Western blot和qPCR结果一致，见图6、7。这些数据表明六味地黄汤对TRPC6的调控作用。

3 讨论

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，以高血糖为特征，伴碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱^［12］。糖尿病肾病（DN）是糖尿病最重要的微血管并发症之一，约30%~40%的糖尿病患者发展为DN^［13］。近二十年来，全球人口中DN的发病率和死亡率迅速上升^［14］。DN的特征是细胞外基质过度沉积，导致基底膜增厚、肾小球系膜扩张和小管间质纤维化^［15］。DN的发病机制非常复杂，目前尚不完全清楚，导致治疗效果不佳。

中药因其疗效好、无毒副作用而被开发利用，在治疗糖尿病及并发症方面历史悠久。六味地黄汤在中医中已有900多年的历史，用于预防和治疗各种以肾阴虚为特征的疾病。六味地黄汤由地黄（蜀地黄）、山药（山药）、山茱萸（山茱萸）、牡丹皮（木旦皮）、泽泻（泽泻）和茯苓（茯苓）组成。尽管一些现代药理学实验已经证明六味地黄汤具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗衰老的作用^{［16，17］}，并且已经证明六味地黄汤在DN中的作用，但六味地黄汤对调控DN的机制尚不清楚。本研究通过使用STZ腹腔注射的方式构建DN大鼠模型，造模成功后，通过对比分析发现，模型组大鼠空腹血糖、尿蛋白、肌酐和肾指数明显高于正常组，体重有所减轻；六味地黄汤治疗后，空腹血糖、尿蛋白、肌酐和肾指数下降，大鼠体重升高；此外，六味地黄汤处理后大鼠肾脏病理程度也减轻，并且随着六味地黄汤剂量的升高，抑制DN的效果越明显。

MicroRNAs（miRNAs）是一类短的内源性非编码RNA分子，包括19~24个核苷酸。miRNAs结合靶基因mRNA的3' untranslated region （UTR），引发其生物学功能，从而促进mRNA的降解或引起翻译抑制，最终实现基因表达调控^［18］。miRNA的表达失调导致包括DN在内的多种疾病发展^{［19，20］}。作为一个重要的miRNA，miR-26a在抗炎^［21］，抗氧化^［22］以及抗纤维化^［23］等过程中发挥作用。这些生物过程被认为是DN发展的重要机制^［24］。研究发现，在DN患者中，miR-26a表达下调，且miR-26a参与DN进展和治疗的调控。这些研究表明，miR-26a能够作为DN诊断和预后的生物标志物。基于六味地黄汤能够通过影响相关分子表达水平进而影响糖尿病等疾病发生的研究^［25］，本研究推测六味地黄汤可以通过调控miR-26a表达影响DN进展。结果显示，相比于正常对照大鼠，miR-26a在模型大鼠肾脏中表达下调；而六味地黄汤的处理能够上调miR-26a表达，且呈现一定的剂量依赖性升高。证明六味地黄汤可能通过miR-26a发挥作用。

TRPC6是一种Ca²⁺可渗透的非选择性阳离子通道，在脑、含平滑肌组织和肾脏以及免疫细胞和血细胞中表达。在TRPC6敲除的大鼠和小鼠中，肾病综合征、DN、自身免疫性肾小球肾炎和肾缺血和尿路梗阻引起的急性肾损伤得到了一定程度的改善^［26］。TRPC6的表达与DN进展呈正相关，并且能够作为预防DN的靶点^［27］。通过文献检索，发现TRPC6是miR-26a的下游靶蛋白，受到miR-26a的调控，且miR-26a/TRPC6轴已被报道参与DN的进展^［9］。本研究结果显示，DN大鼠中TRPC6高表达；六味地黄汤干预抑制TRPC6表达水平，高剂量的六味地黄汤处理后TRPC6表达下调对比低剂量和中剂量更明显。证明六味地黄汤可能通过TRPC6发挥调控作用。

综上所述，六味地黄汤对DN大鼠的肾脏具有保护作用，可能通过上调miR-26a，抑制TRPC6表达实现。本研究可为DN的临床预防提供新的思路，也可为六味地黄汤的肾脏保护机制研究提供参考。

作者贡献度说明：

李杨：设计文章研究思路、实验进行和数据分析、论文的起草；温伟波：提供研究思路、论文最终版本的修订。

本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

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