φ26，一株诱导自海南MRSA临床株的溶原性噬菌体

φ26, a lysogenic phage induced from the methicillin‑resistant Staphylococcus aureus in Hainan

摘要

目的 分离鉴定海南岛耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床株所携带的溶原性噬菌体，确认此类噬菌体的裂解能力，探究其在毒性/抗性基因传播上的能力。 方法 收集MRSA临床株，以丝裂霉素C诱导产生噬菌体，经裂解能力比较，筛选得到一株噬菌体φ26，并对其环境稳定性和基因组构成情况进行分析研究。 结果 53%的MRSA临床菌株（n=19）可诱导产生噬菌体。其中噬菌体φ26的裂解率最高为95.7%，可在pH=3~11或<60 ℃的条件下稳定存在。测序确认其基因组为42 061 bp线性双链DNA，GC含量34.71%，未检出tRNA，由66个开放阅读框构成，可编码杀白细胞素相关蛋白。 结论 本研究获得了一株新型的溶原性MRSA噬菌体，可能介导了临床毒力基因的水平转移，但较高的裂解特性和较好的稳定性提示其与菌体裂解的有关元件存在进一步开发为抗菌试剂的潜力。

Abstract

Objective To isolate and identify lysogenic phages in clinical isolates of methicillin‑resistant Staphylococcus aureus （MRSA） from Hainan Island， determine the lytic ability of these phages， and explore their capacity for spreading virulence/resistance genes. Methods Lysogenic phages were induced from MRSA clinical isolates using mitomycin C. By assessing their lytic capabilities， a phage， designed as φ26， was subjected to the stability evaluation and the whole genome sequencing. Results Isolation of lysogenic phages was evidenced in 53% of collected isolates （n=19）. Among them， phage φ26 was featured as the highest lytic rate of 95.7%， which was demonstrated to be stable under conditions of pH 3‑11 or temperatures below 60 ℃. Sequencing confirmed that its genome is a 42 061 bp linear double-stranded DNA （GC%=34.71%） no tRNA was detected， Including genes encoding leucocidin， a total of 66 open reading frames were identified. Conclusion A novel lysogenic MRSA phage that may mediate the horizontal transfer of clinical virulence genes was identified in this study， Whilst， its high lytic properties as well as promise stabilities suggested the potential of its lysis associated elements for developing antibacterial agent development in future.

Graphical abstract

关键词

溶原性噬菌体 / 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 / 杀白细胞素

Key words

Lysogenic phage / Methicillin‑resistant Staphylococcus aureus / Leucocidin

金黄色葡萄球菌在环境中普遍存在，其对生存环境要求较低，无芽孢，无鞭毛，拥有较强的耐高温特性^［1，2］。该菌是一种人兽共患病原菌，可导致皮肤感染、肺炎、心内膜炎、骨髓炎、菌血症等一系列感染性疾病^［3］，在健康人群中的携带率为20%~30%^［4］。金黄色葡萄球菌能够产生大量的酶和毒素，增强其致病性并在宿主内传播，如溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、肠毒素、耐热DNA酶、葡激酶等^［5］。早期抗生素滥用导致此类菌株的耐药性日益复杂，目前临床上以耐药甲氧西林的金黄色葡萄球菌［methicillin‑resistant Staphylococcus aureus （MRSA）］为代表，严重威胁了公共健康。

针对这一问题，科学界公认噬菌体疗法是一个较为可靠的解决办法。作为一种对细菌进行特异性感染的病毒，按生命周期可分为裂解性噬菌体和溶原性（温和）噬菌体^［6］。其中裂解性噬菌体可导致宿主细胞结构的崩解，溶原性噬菌体则无法杀死宿主，而是整合到宿主基因组中，或作为质粒存在于宿主细胞内^［7］。这种情况可以稳定数千代，噬菌体主要通过特殊的功能元件（通常不会在感染过程中表达）来调整宿主的胞内生理、生化行为，使温和噬菌体和细菌互利共存。直至遇到物理刺激（紫外线照射）或化学刺激（丝裂霉素C处理），导致噬菌体进入到裂解阶段，并在这一过程中获得了宿主的部分/完整基因片段。当再次感染相近的宿主时，能完成基因的水平转移，导致毒性/抗性基因的扩散；或感染临近的宿主，通过其独特的裂解元件，始终保持裂解周期。

有关MRSA的溶原性噬菌体，国内外研究也取得了一定的成果。例如分离来自中国开封的新型噬菌体Henu2，发现与一些抗生素或氧化物的组合可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长^［8］。从中国上海一所医院污水中分离的噬菌体VB_SauS_SH‑St 15644能够在体外和小鼠皮肤感染模型中抑制MRSA分离株^［9］。研究者将来自青岛动物园的噬菌体（vB_Saus_PHB21）基因组整合到宿主MRSA（菌株SA14）中，研究显示增强细菌的细胞黏附、抗吞噬作用和生物膜形成的能力^［10］。一项研究报告了一种名为JD419的溶原噬菌体，该噬菌体不含任何毒力因子和抗生素耐药基因，是基因工程的理想靶标^［11］。噬菌体φ11自发现以来，经常作为通过转导转移基因的实验室工具^［12］。已有实验研究将温和噬菌体突变为裂解噬菌体，并评估了其生物防治的潜力^{［13，14］}。温和噬菌体分布广泛并且功能多样，越来越受到研究人员的青睐。

2017~2021年海南热带地区医院MRSA的平均检出率较高为34.13%^［15］。但在MRSA菌株中所携带溶原性噬菌体尚未被系统性研究过。本文通过丝裂霉素C的使用，对所收集的MRSA临床菌株进行了溶原噬菌体诱导，并从临床应用潜力和毒性/抗性基因扩散的角度对其进行了分析。新噬菌体的发现为海南防控MRSA感染提供新的视角，填补海南该领域研究的空白，为后续该噬菌体基因工程应用提供材料和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株和培养条件

本实验所用到的MRSA菌株均来自海南医学院第二附属医院临床患者标本，见表1。金黄色葡萄球菌ATCC25923是海南医学院第二附属医院检验科赠送。所有菌株用50%甘油保存在-80 ℃冰箱。细菌培养：挑取细菌单克隆至5 mL无菌LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min恒温振荡培养过夜，次日按照1%传代培养至对数期。

1.2 主要试剂和仪器

丝裂霉素C，Acmec；Tris‑HCl（pH 7.6），Biosharp；磷钨酸，麦克林；噬菌体基因组提取试剂盒，庄盟生物。SM缓冲液：量取1 L纯净水加入0.1 g明胶、5.8 g NaCl、50 mL pH 7.6 Tris‑HCl、2 g MgSO₄•7H₂O，待其溶解后，121 ℃灭菌20 min，常温保存。全自动酶标仪，Biotek；A2生物安全柜，海尔；透射电子显微镜H‑9500，Hitachi；水浴锅，博迅。

1.3 丝裂霉素C诱导分离噬菌体

挑取19株MRSA单克隆分别接种于LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min恒温振荡培养箱中振荡过夜。次日各取50 μL菌液到5 mL新鲜LB中，将菌液培养到OD₆₀₀大概0.2左右。分别每瓶加入0.5 μg/mL丝裂霉素C，继续培养6 h。观察培养瓶的浊度，挑取菌液浊度下降或完全澄清的样本，并使用0.22 μm滤器除菌过滤，滤液4 ℃保存备用。

复苏10株MRSA培养对数期，取100 μL菌液加入5 mL半固体LB培养基中，混匀后倾倒在固体培养基上层。用透亮的过滤液，取10 μL滴在含MRSA菌的双层板上层，晾干后放置培养箱37 ℃倒置培养12 h次日观察平板的情况。

1.4 诱导分离液裂解能力的测定

复苏金黄色葡萄球菌ATCC25923和临床46株MRSA，摇菌到对数期。分别取100 μL菌液到5 mL半固体LB培养基中，混匀后倾倒在固体培养基上层。为了探索裂解能力最强的噬菌体，挑取6株裂解效果较好的噬菌体原液，取10 μL滴在含MRSA菌的双层板上层，待晾干后37 ℃培养箱倒置培养12 h次日观察平板的情况。如果有噬菌斑出现，则说明该噬菌体可以裂解该菌，做好记录。

1.5 单个噬菌体的分离纯化

挑选裂解谱范围广泛的过滤液和对应裂解效果透亮的菌作为宿主菌。将过滤液梯度稀释，取100 μL已经过滤后的噬菌体液体与100 μL菌液混合静置10 min，然后一起加入约 5 mL半固体LB培养基中，颠倒混匀3次倒入普通固体培养基平板上层，静置10 min待琼脂凝固，倒置于37 ℃培养箱过夜培养^［16］。次日观察结果，如出现透明斑，则成功分离到噬菌体。通过5次以上单斑分离，获得纯化后大小均一的噬菌体。挑选滴度较高并且裂解范围较广的其中一株噬菌体进行后续实验。

1.6 噬菌体的透射电镜观察

取10 μL噬菌体液体加样于铜网上，静置沉淀5 min，把铜网周围较多的液体用滤纸从侧边吸走，使用2%磷钨酸，进行染色5 min。等待铜网彻底干燥，用透射电子显微镜观察噬菌体形态。

1.7 测定pH值对噬菌体滴度的影响

利用HCl和NaOH溶液配制SM缓冲液为11种不同pH值。取1 mL噬菌体（效价约10⁵ PFU/mL）分别加入11种pH值为2~12的SM缓冲溶液中，在37 ℃水浴锅中孵育1 h。通过实验双层平板法测定相应的噬菌体滴度，次日记录结果。

1.8 测定温度对噬菌体滴度的影响

设置不同的水浴锅温度分别为4、20、30、40、50、60、70 ℃。在1.5 mL EP管中加入1 mL噬菌体液，噬菌体分别放置7种温度水浴处理1 h，取出静置一段时间冷却后，用无菌SM缓冲液作10倍比稀释后，通过双层平板法测定噬菌体滴度，次日记录结果。

1.9 噬菌体全基因组测序及生物信息学分析

按照试剂盒（ZP317，庄盟）步骤对其基因组进行提取。由中国广东惠通科技生物有限公司进行噬菌体基因组测序。采用 Illumina 测序平台，通过GeneMarks预测基因组上存在的开放阅读框（ORF）。利用NCBI在线工具BLASTp（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）对预测的开放阅读框进行人工校准给出最后的功能注释；利用tRNAscan‑SE预测噬菌体全基因组 tRNA^［17］；利用VIPTree进行病毒全基因组分析进化地位^［18］；利用CGViewServe （http：//cgview.ca）对噬菌体全基因组作基因图谱^［19］。应用在线工具ResFinder 和 VirulenceFinder预测抗生素耐药基因和毒力因子^［20］。利用在线工具DiGAlign进行相近噬菌体的同源性分析。

1.10 实验数据处理

每个实验进行3次，数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）所示。统计学分析采用GraphPad Prism 9.0.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 丝裂霉素C诱导分离噬菌体结果

19株临床MRSA（3、8、10、12、15、16、17、21、26、28、29、33、36、37、39、40、A、C、F）中的10株MRSA（10、12、16、17、21、26、29、40、A、F）出现了澄清。离心过滤该10管的液体，滴加在含有不同MRSA菌的10个板上如图1所示。液体10裂解率为30%，液体12裂解率为30%，液体16裂解率为20%，液体17裂解率为10%，液体21裂解率为10%，液体26裂解率为80%，液体29裂解率为20%，液体40裂解率为20%，液体F裂解率为70%，液体A裂解率为20%。因此，实验结果显示液体26和液体F拥有较高的裂解率。

2.2 诱导分离液裂解能力测定结果

对46株MRSA和金黄色葡萄球菌ATCC25923菌液倒双层板，采用点滴法加6种噬菌体液体的裂解情况见表2。结果显示φ10的裂解率为36.1%，φ12的裂解率为34.0%，φ26的裂解率为95.7%，φA的裂解率为19.1%，φF的裂解率为48.9%。φ10可以裂解透亮的菌株为1株，φ12可以裂解透亮的菌株为4株，φ26可以裂解透亮的菌株为9株，φA可以裂解透亮的菌株为1株，φF可以裂解透亮的菌株为0株。因此φ26的裂解范围最广，透亮的数目也最多。

2.3 噬菌体的噬菌斑图以及透射电镜形态图

噬菌斑见图2A所示，大小为1 mm左右，模糊不够透亮。透射电镜图见图2B所示，这是一株长尾噬菌体，φ26头部直径大约为50 nm，尾部长度约为60 nm。

2.4 不同温度和不同pH值对噬菌体滴度的影响

该噬菌体对温度比较敏感见图3A，4、20、30、40 ℃，效价都保持在10⁵ PFU/mL左右，但当温度为50 ℃时，噬菌体滴度出现下降，约为10⁴ PFU/mL。如温度进一步上升至60 ℃和70 ℃，噬菌体完全失活。

该噬菌体有良好的pH稳定性，在pH 3~7时，效价保持稳定都在10⁵ PFU/mL以上，pH 8~11时，效价都保持在10⁴ PFU/mL左右。只有在pH=2或者pH=12这种极酸或者极碱的情况下噬菌体完全失活，见图3B所示。

2.5 噬菌体全基因组分析

噬菌体φ26全基因组图谱见图4所示。该噬菌体基因组为线性双链DNA，基因组全长为42 061 bp，GC含量为34.71%，利用tRNAscan‑SE在线软件预测，未检测到tRNA。应用在线工具ResFinder 和 VirulenceFinder预测抗生素耐药基因和毒力因子未预测出抗生素耐药基因和毒力因子。但通过开放阅读框人工校准功能注释，发现携带有毒力基因。全基因组通过BLASTn比对，发现与来自山西医院的金黄色葡萄球菌SA20‑SX（登录号CP130525.1）覆盖率100%，同源性99.98%。推测这株金黄色葡萄球菌也携带前噬菌体。利用PHASTR软件对该菌进行噬菌体预测分析^［21］，发现其可以预测到3株完整噬菌体，2株不完整噬菌体，其中一株长度为43.4 kb左右的完整噬菌体和本研究分离的φ26非常接近。

全基因组相近的噬菌体有来自意大利Hesat（覆盖率71%，同源性96.22%）、捷克phiJB（覆盖率78%，同源性95.51%）、波兰AsZ22RN（覆盖率76%，同源性96.47%）、加拿大96（覆盖率67%，同源性96.24%）、澳大利亚phinm4（覆盖率73%，同源性95.88%）、中国北京IME1364_02（覆盖率66%，同源性95.15%）、阿根廷vB_SauS_173（覆盖率83%，同源性97.91%）。利用NCBI在线工具BLASTp（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）对预测开放阅读框人工校准给出最终功能注释，发现酪氨酸型整合酶（ORF6），正如预期的那样是一株温和噬菌体。同时，ORF31和ORF32注释为杀白细胞素（panton‑valentine leukocidin，PVL）相关蛋白。

2.6 噬菌体开放阅读框和功能注释

噬菌体基因组预测有66个开放阅读框，其中21个注释为未知功能蛋白。根据温和噬菌体基因不同功能可将其分为6个模块：（1）噬菌体溶原模块；（2）噬菌体裂解宿主功能模块；（3）噬菌体结构模块；（4）DNA复制模块；（5）噬菌体包装模块；（6）基因调控模块。

（1）噬菌体溶原模块，包括噬菌体整合酶（ORF6）、切除酶（ORF7）、整合酶（ORF6）属于酪氨酸型重组酶。噬菌体整合酶介导两个DNA识别序列，噬菌体附着位点（attP）和细菌附着位点（attB）。酪氨酸家族整合酶催化酪氨酸介导链裂解，识别更长attP序列，并需要由噬菌体或宿主细菌编码的其他蛋白质。另一种丝氨酸家族的噬菌体整合酶较大，使用催化丝氨酸进行链切割，识别较短的attP序列，并且不需要宿主辅因子^［22］。切除酶（ORF7）是噬菌体在生命循环中将自身的DNA从细菌染色体上切离时所必需的。

（2）宿主裂解功能模块，包括穿孔素（ORF2）、酰胺酶（ORF3）和水解酶（ORF59）。穿孔素是一种疏水的跨膜蛋白，是触发细菌裂解的“闹钟”，可以调节噬菌体感染周期^［23］。

（3）噬菌体结构模块，包括噬菌体头形态蛋白（ORF45）、尾蛋白（ORF54）、头尾衔接蛋白（ORF50）、衣壳蛋白（ORF48）等。这些结构模块组成了噬菌体φ26二十面体的头部和长的尾巴。

（4）噬菌体包装模块，包括门蛋白（ORF44）、末端酶小亚基（ORF42）、末端酶大亚基（ORF43）等。

（5）DNA复制模块，包括单链DNA结合蛋白、dUTP焦磷酸酶（ORF36）等。dUTP酶代表了一个金属酶家族，可催化dUTP水解为dUMP和焦磷酸盐，防止dUTP被DNA聚合酶掺入DNA中，保持较低的dUTP/dTTP比值^［24］。dUTP酶对细胞存活至关重要，因为过量的dUTP被掺入DNA中，导致切除修复、DNA断裂和死亡。因此，dUTP酶是DNA合成重要的酶，促进NDA复制的正确性和顺利进行。有研究还表明，噬菌体编码的一些二聚体和三聚体dUTP酶调节各种金黄色葡萄球菌菌株中移动遗传元件的转移，从而可能有助于其致病性^［24］。

（6）基因调控模块，包括XRE家族转录调节（ORF9）、Rha家族转录调节蛋白（ORF11）、噬菌体转录激活RinB（ORF40）等。XRE家族转录调节因子具体的功能不是很清楚。李宗梅利用转录组学对嗜热链球菌的耐酸相关基因进行研究发现，XRE调节因子参与调节嗜热链球菌的耐酸性中起到作用^［26］。Liu等^［27］利用转录组学对耐辐射球菌进行了DNA辐射研究，发现XRE转录调节因子DR2574可能与DNA修复有关。Rha蛋白是一种与调控噬菌体溶源转化有关的功能性家族蛋白，经常存在于溶源性和前噬菌体中，缺乏整合宿主因子菌株中会阻止噬菌体感染的发生，因此推测噬菌体φ26具有溶源转化的能力。

2.7 全基因组进化树及相近噬菌体共线性分析

基于全基因组构建系统进化树，发现噬菌体φ26与噬菌体3MRA（NC_028917）、phiJB（NC_028669）、phiNM4‑gamm4（KP209285）、phinm4（NC_028864）位于同一分支，属于亲缘关系较近的噬菌体，见图5。

基于全基因组序列，挑选通过BLASTn比对同源关系较近的噬菌体，利用DiGAlign进行共线性分析，见图6。发现噬菌体φ26与意大利Hesat（登录号OP947204.1）、捷克phiJB（登录号KT344895.1）、波兰AsZ22RN（登录号ON513432.1）、加拿大96（登录号NC_007057.1）、澳大利亚phinm4（登录号NC_028864）、中国北京IME1364_02（登录号MW238767.1）、阿根廷vB_SauS_173（登录号OM439672.1）之间共线性较差。说明这些噬菌体虽然亲缘关系较近，大小相似，都属于金黄色葡萄球菌噬菌体中的长尾噬菌体，但各个噬菌体模块存在差异，基因组分布不同。

3 讨论

本研究对临床19株MRSA通过加丝裂霉素C进行诱导分离噬菌体，其中10株通过实验证明诱导成功。噬菌体诱导率较高达到52.6%。用分离的溶原噬菌体（φ10、φ12、φ26、φ40、φF、φA）对ATCC25923和临床46株MRSA点滴法进行实验发现裂解谱各不相同，说明诱导分离出各种不同的溶原噬菌体。结果显示φ26的裂解范围最广，噬菌斑裂解透亮数目最多。对φ10、φ12、φ26、φ40、φF、φA的溶原噬菌体进行单独噬菌斑的纯化，经历5轮以上，只有φ26的噬菌体效价在10⁶ PFU/mL，其他溶原噬菌体效价都低于该值。

分离纯化26号噬菌体，命名为φ26。对该噬菌体φ26进行相关生物学实验。在pH稳定性方面，φ26在pH 3~7时，效价保持稳定都在10⁵ PFU/mL滴度以上，在pH 8~11时，效价下降一个数量级。在温度方面，φ26在60 ℃完全失活，找不到任何噬菌斑，50 ℃实验处理后噬菌体滴度有所下降大概在10⁴ PFU/mL。4、20、30、40 ℃实验处理后噬菌体滴度都能保持在10⁵ PFU/mL左右。

通过二代测序基因组分析该噬菌体全长为42 061 bp，GC含量为34.71%，不含tRNA，含有66个ORF，其中21个ORF为未知功能。根据基因不同功能将其分为溶原模块、裂解功能模块、结构模块、包装模块、复制模块和调控基因模块。通过全基因比对分析与亲缘关系相近的7株噬菌体分别为：Hesat、phiJB、AsZ22RN、96、phinm4、IME1364_02、vB_SauS_173。它们属于长尾噬菌体科，大小在42 000~44 000 bp之间，分离自不同国家。噬菌体φ26根据基因组大小同时参考透射电镜形态图有长的尾巴形态，符合长尾噬菌体特征。但相近噬菌体之间的共线性差异较大，这与短尾噬菌体恰恰相反。可能是短尾噬菌体作为裂解噬菌体频繁的进行模块的交换，基因广泛的交流^［28］。但长尾噬菌体大多数为温和噬菌体，预测的开放阅读框序列功能比对其中一部分与细菌中的基因序列高度同源，猜测长尾噬菌体与细菌之间的交流广泛于长尾噬菌体与噬菌体之间的基因交流。

通过对该噬菌体基因组分析其含有溶原相关基因，符合温和噬菌体特征。进一步分析发现ORF2、ORF3、ORF59共同构成了噬菌体裂解宿主所需的元件，具有开发为新型抗菌制剂的潜力。但该噬菌体发现还携带编码杀白细胞素的基因（orf31和orf32）。杀白细胞素（PVL）是一种由 lukF‑PV 和 lukS‑PV 基因编码并通过克隆扩增和水平转移传播的外毒素。它与中性粒细胞和单核细胞膜结合，可导致细胞裂解或凋亡，还可以作为超级抗原并引发大规模的免疫^［29］。早期研究猜测该基因的传播由噬菌体所介导^［30］。例如菌株P83中的PVL样基因由一种被称为φPV83‑pro的噬菌体携带^［31］。另一项研究表明PVL阴性的金黄色葡萄球菌菌株可以通过感染一种新的温和噬菌体φSLT转化为PVL阳性的菌株，该噬菌体是从产生PVL的临床分离株A980470分离出来的^［31］。有研究显示，在中国PVL阳性的金黄色葡萄球菌主要携带φ7247PVL/φST5967PVL和φPVL^［33］。

本研究分离到一株全新的温和噬菌体φ26，通过对其进行部分生物学特性实验和全基因组比较分析，扩展了对金黄色葡萄球菌温和噬菌体的认识。海南岛独特的地理特点导致海南与中国大陆常见MRSA类型不同，MLST45‑SCCmecIVa是海南MRSA分离株中最常见的ST和SCCmec类型组合^［33］。但关于该噬菌体是否与这种特殊有关以及该噬菌体与细菌如何交流介导毒力转移还有待进一步研究。

作者贡献度说明：

李艳梅：负责实验实施，资料收集，文稿撰写；田申：进行实验设计与指导，文章修改；夏乾峰：审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82260003)