鳖甲煎丸含药血清抑制胰腺癌AsPC‑1细胞恶性生物学行为及机制研究

Study on Biejiajian Pill‑containing serum inhibiting the malignant biological behavior of pancreatic cancer AsPC‑1 cells and its mechanism

摘要

目的 探讨鳖甲煎丸（BJJP）含药血清对胰腺癌AsPC-1细胞恶性生物学行为的影响及其可能的分子机制。 方法 采用72只健康Sprague-Dawley（SD）大鼠制备正常大鼠血清以及低（0.55 g/kg）、中（1.1 g/kg）、高（2.2 g/kg）剂量的鳖甲煎丸含药血清。将对数生长期的胰腺癌AsPC-1细胞分为空白对照组（BC）、正常大鼠血清处理组（NC）以及低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清处理组（BJJP-L、BJJP-M、BJJP-H），各组用10%相应血清处理细胞48 h后进行后续实验。H&E染色评估鳖甲煎丸对健康SD大鼠肝脏、肾脏和心脏组织学变化的影响。CCK-8检测AsPC-1细胞增殖；集落形成实验检测AsPC-1细胞集落形成；TUNEL实验检测AsPC-1细胞凋亡；划痕实验检测AsPC-1细胞迁移；Transwell实验检测AsPC-1细胞迁移和侵袭；Western blot实验检测AsPC-1细胞中增殖相关蛋白（Ki-67、PCNA）、凋亡相关蛋白（Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-xl、Bcl-2）、上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白（p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT）的表达水平；免疫荧光实验检测AsPC-1细胞中EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的荧光强度。超高效液相色谱-串联静电场轨道阱质谱联用（UHPLC-MS/MS）技术检测鳖甲煎丸含药血清的入血成分。 结果 H&E染色显示低、中、高剂量的鳖甲煎丸对健康SD大鼠的主要脏器无毒副作用。与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的OD值、集落形成数量、划痕愈合率、迁移数量、侵袭数量、Ki-67、PCNA、Bcl-xl、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达水平以及N-cadherin和Vimentin荧光强度均显著降低；TUNEL凋亡率、Caspase 3、Caspase 9、Bax、E-cadherin蛋白表达水平及E-cadherin荧光强度均显著升高（P<0.05）。UHPLC-MS/MS检测结果显示鳖甲煎丸含药血清中共有67种入血原型成分，其中包括高熊果苷、槲皮素和苍术素等30种有效成分。 结论 鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌AsPC-1细胞的恶性生物学行为，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。

Abstract

Objective To explore the effect and possible molecular mechanism of Biejiajian Pill （BJJP）-containing serum on the malignant biological behavior of pancreatic cancer AsPC-1 cells. Methods A total of 72 healthy Sprague-Dawley（SD） rats were used to prepare normal rat serum and low-（0.55 g/kg）， medium-（1.1 g/kg）， and high-（2.2 g/kg） doses of BJJP-containing serum. Pancreatic cancer AsPC-1 cells in the logarithmic growth phase were divided into the blank control group （BC）， normal rat serum treatment group （NC） and low-， medium-， and high- doses of BJJP-containing serum treatment groups （BJJP-L， BJJP-M， and BJJP-H）； these cells in each group were treated with 10% corresponding serum for 48 h before subsequent experiments were performed. H&E staining was used to assess the effect of BJJP on the histological changes of liver， kidney， and heart of healthy SD rats. The proliferation ability of AsPC-1 cells was detected by CCK-8 assay； the colony formation ability of AsPC-1 cells was detected by colony formation assay； the apoptosis of AsPC-1 cells was detected by TUNEL assay； the migration of AsPC-1 cells was detected by scratch assay； the migration and invasion of AsPC-1 cells were detected by Transwell assay； the expression levels of the proliferation-related proteins （Ki-67 and PCNA）， apoptosis-related proteins （Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-xl， and Bcl-2）， epithelial-mesenchymal transition （EMT）-related proteins （E-cadherin， N-cadherin， and Vimentin） and PI3K/AKT signaling pathway-related proteins （p-PI3K/PI3K and p-AKT/AKT） of AsPC-1 cells were detected by Western blot； the fluorescence intensity of EMT-related proteins （E-cadherin， N-cadherin， and Vimentin） of AsPC-1 cells were detected by immunofluorescence. UHPLC-MS/MS was used to detect the chemical components of BJJP-containing serum. Results H&E staining showed that low-， medium-， and high- doses of BJJP had no obvious toxic on the main organs of healthy SD rats. Compared to the NC group， the OD value， colony formation number， scratch healing rate， migration number， invasion number， the protein expression levels of Ki-67， PCNA， Bcl-xl， Bcl-2， N-cadherin， Vimentin， p-PI3K/PI3K， and p-AKT/AKT， and the fluorescence intensity of N-cadherin and Vimentin were significantly reduced； TUNEL apoptosis rate， the protein expression levels of Caspase 3， Caspase 9， Bax， and E-cadherin， and the fluorescence intensity of E-cadherin were significantly increased in the low-， medium-， and high-dose BJJP-containing serum groups （P<0.05）. UHPLC-MS/MS results showed that a total of 67 blood prototype components in BJJP-containing serum， including 30 active ingredients such as homoarbutin， quercetin， and atractylodin. Conclusion BJJP-containing serum inhibits the malignant biological behavior of pancreatic cancer AsPC-1 cells， and its mechanism may be related to inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

鳖甲煎丸 / 胰腺癌 / 增殖 / 上皮-间充质转化 / PI3K/AKT信号通路

Key words

Biejiajian Pill / Pancreatic cancer / Proliferation / Epithelial-mesenchymal transition / PI3K/AKT signaling pathway

胰腺癌是一种预后不良的高度恶性胃肠道肿瘤，具有进展快、致死率高的特点。胰腺癌患者的总体预后低于20%，5年生存率低于5%^［1］。目前，胰腺癌唯一可能治愈的治疗方法是手术切除，但由于缺乏典型的早期诊断症状和生物标志物，超过80%的胰腺癌患者在确诊时已属晚期并伴有局部侵袭或远处转移而不适合手术治疗^［2］。因此，寻找安全有效的药物抑制胰腺癌进展具有重要意义。中药在治疗胰腺癌方面具有多组分、多靶点的优势，这是单一化学成分的西药无法比拟的^［3］。中药复方鳖甲煎丸源自汉代张仲景《金匮要略》，由鳖甲、蜂房、阿胶等23味药材组成，该方寒热并用、攻补兼施，具有行气活血、化瘀散结之功效^［4］。一些成分，如大黄^［5］和柴胡^［6］，已被证明通过中断细胞信号通路，抑制肿瘤增殖和转移。重要的是，鳖甲煎丸对包括肝癌在内的多种癌症的临床治疗具有改善作用^［7］。然而，鳖甲煎丸在胰腺癌中的作用以及药理机制尚未完全阐明。本研究利用鳖甲煎丸含药血清处理胰腺癌细胞株，探讨其对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等恶性生物学行为的影响及其可能的分子机制，采用液相色谱-质谱联用技术鉴定鳖甲煎丸含药血清的主要入血成分，并且评估了鳖甲煎丸的大鼠体内生物安全性，以期为鳖甲煎丸在胰腺癌治疗中的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物、细胞

6周龄健康雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，每只体重约130 g，购自北京华阜康生物科技有限公司［实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2020-007］。实验大鼠在恒温（23±2）℃，相对湿度65%~70%，自然昼夜（12 h光照/12 h黑暗）和自由饮水的环境下适应性喂养一周后进行实验。所有动物实验均经过华北理工大学实验动物伦理委员会批准（批准号：2022-SY-022）。

人胰腺癌细胞AsPC-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。AsPC-1细胞在含10%胎牛血清的1640完全培养基中培养，培养条件为5% CO₂、37 ℃。

1.1.2 实验药物

鳖甲煎丸购自国药集团中联药业有限公司（批号：210600，批准文号：国药准字Z42020772），由鳖甲胶、阿胶、蜂房（炒）、鼠妇虫、土鳖虫（炒）、蜣螂、硝石（精制）、柴胡、黄芩、半夏（制）、党参、干姜、厚朴（姜制）、桂枝、白芍（炒）、射干、桃仁、牡丹皮、大黄、凌霄花、葶苈子、石韦和瞿麦共计23味药材组成。

1.1.3 主要试剂和仪器

胎牛血清（普诺赛生命科技有限公司）；1640细胞培养基、青霉素-链霉素混合液、胰酶（中生奥邦生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（聚合美生物科技有限公司）；Transwell小室（BIOFIL公司）；H&E染色试剂盒、4%多聚甲醛、Triton-X-100和抗荧光衰减封片剂（索莱宝科技有限公司）；荧光二抗、DAPI和TUNEL试剂盒（碧云天公司）；Matrigel基质胶（Corning公司）；Ki-67和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）抗体（万类生物科技有限公司）；Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-xl、p-AKT、AKT抗体（Cell Signaling Technology公司）；Bcl-2、PI3K、GAPDH抗体（Proteintech公司）；E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）抗体（Affinity公司）；p-PI3K抗体（Abmart公司）；HRP标记的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（普利莱公司）；正置显微镜和荧光倒置显微镜（Olympus公司）；酶标仪（Bio-Rad公司）；超高效液相色谱和高分辨质谱（Thermo公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 鳖甲煎丸含药血清的制备及体内毒性试验

72只健康SD大鼠随机分为阴性对照组（NC）、低剂量（0.55 g/kg BJJP）鳖甲煎丸组（BJJP-L）、中剂量（1.1 g/kg BJJP）鳖甲煎丸组（BJJP-M）以及高剂量（2.2 g/kg BJJP）鳖甲煎丸组（BJJP-H），每组18只。将鳖甲煎丸溶解于无菌纯水，BJJP-L、BJJP-M和BJJP-H组大鼠分别灌胃相应剂量的鳖甲煎丸混悬液，NC组大鼠给予等量无菌纯水灌胃，每天2次，中间间隔12 h，连续灌胃3 d。在末次灌胃2 h后麻醉大鼠，进行腹主动脉取血和组织（肝脏、肾脏、心脏）取材。血样标本在4 ℃下静置4 h，3 500 r/min离心15 min分离血清，并按照分组混合均匀，56 °C水浴30 min灭活补体，0.22 μm过滤膜过滤除菌，-80 ℃保存备用；组织标本用4%多聚甲醛固定，经脱水、包埋、切片、脱蜡后用H&E染色试剂盒进行染色，正置显微镜镜下观察，采集图像进行分析。

1.2.2 细胞培养与分组

取处于对数生长期且状态良好的AsPC-1细胞，将其分为空白对照组（BC）、正常大鼠血清处理组（NC）以及低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清处理组（BJJP-L、BJJP-M和BJJP-H），各组用10%相应血清处理细胞48 h后进行后续实验。

1.2.3 CCK‑8实验检测细胞增殖

各组AsPC-1细胞以2×10³个/孔的密度接种于96孔板中，按每组3个复孔在96孔板中合理安排孔位。在培养24、48、72、96 h后，按每孔CCK-8试剂10 μL+培养基100 μL的比例配制CCK-8工作液，实验孔和对照孔的每孔均加入110 μL工作液，37 ℃培养箱孵育2 h，用酶标仪（波长：450 nm）测定各孔光密度（OD值）。

1.2.4 集落形成实验检测细胞集落形成能力

加药处理后的AsPC-1细胞以1×10³个/孔的密度接种于6孔板中。在CO₂培养箱中培养，每2~3 d更换1次培养液，当显微镜下观察到细胞团生长为大于50个细胞的数量时即可固定细胞，0.2%结晶紫溶液染色，拍照，计数。

1.2.5 TUNEL实验检测细胞凋亡

预先在新6孔板中放置细胞爬片，之后将加药处理后的细胞消化收集，取适量细胞接种至新6孔板中继续培养，待细胞密度达到50%左右时即可进行如下操作：弃去原培养液，4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.3% Triton-X-100处理细胞5 min，PBS洗涤，加入TUNEL工作液（5 μL TdT酶+45 μL荧光标记液）37 ℃避光孵育1 h，DAPI染核5 min。在避光条件下将细胞爬片用抗荧光淬灭剂黏附至载玻片上进行封片，在荧光正置显微镜（×400）下观察拍照。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移

各组AsPC-1细胞接种于6孔板，待细胞汇合度达70%~80%时，用200 μL枪头在孔内均匀画直线，生理盐水清洗细胞碎片，加入无血清培养基。之后在倒置显微镜（×40）下捕获培养0、24、48 h 3个时间点的图像，ImageJ软件测量各组划痕面积，计算公式为：划痕愈合率=（0 h的划痕面积-24/48 h的划痕面积）/ 0 h的划痕面积×100%。

1.2.7 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭

向Transwell体系（24孔、8 μm孔径）的上室添加150 μL无血清培养基，下室添加650 μL高浓度血清培养基（20%胎牛血清），其中侵袭实验需在上室预铺Matrigel基质胶。随后将各组AsPC-1细胞重新重悬至无血清培养基中，按8×10⁴个/150 μL的密度接种于上室。在37 ℃下培养24 h，弃掉培养基，用湿润的棉棒小心去除小室上面未穿过膜的细胞，将小室下面已通过膜的细胞固定染色，生理盐水清洗，晾干小室后于倒置显微镜下（×100）观察，随机选取视野并进行采图，Image J软件计数穿过小室的细胞总数，即为迁移/侵袭细胞数量。

1.2.8 免疫荧光实验检测细胞E‑cadherin、N‑cadherin和Vimentin的荧光强度

加药处理后的AsPC-1细胞接种至共聚焦小皿中，待细胞密度达到50%左右时缓慢移除皿内的原培养基，PBS清洗。4%多聚甲醛固定细胞30 min，去除固定液，PBS清洗。打孔操作加入500 μL 0.2% Triton-X-100，免疫封闭操作加入500 μL 5% BSA。在相应一抗：E-cadherin、N-cadherin、Vimentin（比例均为1∶250）于室温下孵育30 min后，置于4 ℃孵育过夜。次日在荧光二抗（1∶500）中室温避光孵育45 min，DAPI染核5 min，荧光倒置显微镜（×200）下观察、拍照，ImageJ软件分析荧光强度的比值。

1.2.9 Western blot实验检测细胞增殖、凋亡以及EMT相关标志物的蛋白表达水平

用RIPA裂解液（含1% PMSF）提取各组细胞的总蛋白，将蛋白定量、电泳、转膜、封闭后，分别用相应一抗：Ki-67（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、Caspase-3（1∶2 000）、Caspase-9（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-xl（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶3 000）、N-cadherin（1∶3 000）、Vimentin（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）于4 ℃下孵育过夜。第二日，在相应HRP标记的二抗（1∶5 000）下进行室温2 h的孵育，TBST洗涤3次。最后，于暗室内加入ECL试剂，利用凝胶成像系统进行发光显影，采用ImageJ软件计算各蛋白条带的灰度值。

1.2.10 超高效液相色谱‑串联静电场轨道阱质谱联用（UHPLC‑MS/MS）技术检测鳖甲煎丸含药血清入血成分

将鳖甲煎丸含药血清和正常大鼠血清各1 mL在4 ℃下缓慢解冻，分别与等体积的甲醇乙腈溶液混合；称取100 mg鳖甲煎丸药剂，加入100 µL预冷水，震荡60 s，加入400 µL预冷甲醇乙腈溶液。将上述3组样品涡旋60 s，低温超声30 min，2次，-20 ℃静置1 h，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清真空干燥复溶于200 µL 30%ACN，震荡，14 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清上机检测。

1.3 统计学处理

所有实验均至少独立重复3次，Graphpad Prism 9.5.1用于统计分析及绘图。符合正态分布的计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，多组别间的比较采用单因素方差分析的方法。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鳖甲煎丸体内毒性试验

H&E染色结果显示，与对照组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸给药后健康SD大鼠的肝脏、肾脏和心脏均未出现明显的器官损伤和病理变化，表明鳖甲煎丸对健康SD大鼠无毒副作用。见图1。

2.2 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示，与BC组相比，NC组细胞的增殖能力无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，在24、48、72、96 h四个时间点，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的增殖能力均显著降低（P<0.05）。结果表明鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌AsPC-1细胞增殖。见图2。

2.3 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞增殖相关标志物表达的影响

Western blot实验结果显示，与BC组相比，NC组细胞的增殖相关标志物Ki-67和PCNA蛋白的表达水平无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的Ki-67和PCNA蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。以上结果表明鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌AsPC-1细胞的增殖能力。见图3。

2.4 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞集落形成的影响

集落形成实验结果显示，BC组与NC组细胞之间的集落形成能力无明显差异（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的集落形成能力均显著降低（P<0.05）。结果表明鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌ASPC-1细胞的集落形成能力。见图4。

2.5 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞凋亡的影响

TUNEL实验结果显示，BC组与NC组细胞之间的凋亡率无明显差异（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的凋亡率均显著增加（P<0.05）。结果表明鳖甲煎丸含药血清可促进胰腺癌AsPC-1细胞凋亡。见图5。

2.6 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞凋亡相关标志物表达的影响

Western blot实验结果显示，与BC组相比，NC组细胞的凋亡相关标志物Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-xl、Bcl-2蛋白的表达水平无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的Caspase 3、Caspase 9、Bax蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05），Bcl-xl、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。以上结果表明鳖甲煎丸含药血清可促进胰腺癌AsPC-1细胞的凋亡能力。见图6。

2.7 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞迁移和侵袭的影响

划痕实验结果和Transwell迁移实验结果（图7C、D）显示，与BC组相比，NC组细胞的划痕愈合率和迁移数量无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的划痕愈合率和迁移数量均明显减少（P<0.05）。见图7A、B。Transwell侵袭实验结果显示，与BC组相比，NC组细胞的侵袭数量无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的侵袭数量均明显减少（P<0.05）。以上结果表明鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌AsPC-1细胞的迁移和侵袭能力。见图7C、E。

2.8 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞EMT进程的影响

免疫荧光实验结果和Western blot实验结果显示，BC组与NC组细胞之间的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的荧光强度和蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞的EMT进程中上皮样标志物E-cadherin的荧光强度和蛋白表达水平均显著升高，间质样标志物N-cadherin和Vimentin的荧光强度和蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。以上结果表明鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌AsPC-1细胞的EMT进程。见图8~11。

2.9 鳖甲煎丸含药血清对胰腺癌AsPC‑1细胞中PI3K/AKT信号通路的影响

Western blot实验结果显示，BC组与NC组细胞之间的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平无明显变化（P>0.05）；而与NC组相比，低、中、高剂量的鳖甲煎丸含药血清组细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平均显著降低（P<0.05）。以上结果表明鳖甲煎丸含药血清可抑制胰腺癌AsPC-1细胞中PI3K/AKT信号通路。见图12。

2.10 鳖甲煎丸含药血清化学成分分析

基于UHPLC-MS/MS技术对鳖甲煎丸含药血清的化学成分进行鉴定，通过与标准化合物的保留时间、分子式、m/s和质谱碎片特征离子进行对比，扣除正常大鼠血清组的原有成分后，共鉴定出鳖甲煎丸含药血清入血原型成分67个。结合文献检索，共筛选得到30个具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒及活血化瘀作用的有效成分，其中排名前3的成分分别为高熊果苷、槲皮素和苍术素。见图13、表1。

3 讨论

胰腺癌是一种进展迅速、致死率高的胰腺恶性肿瘤。阐明胰腺癌的潜在机制，开发更有效、安全的天然药物治疗胰腺癌至关重要^［8］。近年来，传统中医药因其毒副作用低、多靶点、多机制的优势在胰腺癌的辅助治疗、减轻患者症状、提高生存率等方面发挥着显著优势^［9］。中医理论根据胰腺癌发病的症状和体征，将胰腺癌归属“黄疸”、“癜瘕积聚”、“伏梁”等范畴，其发病与肝失疏泄，痰瘀毒邪，损及胰腺密切相关^［10］。鳖甲煎丸是《金匮要略》记载的复方之一，具有行气化瘀、软坚散结和攻补兼施之效，使瘀塞得通，气血得运^［11］。本研究的结果表明，鳖甲煎丸含药血清具有抑制胰腺癌AsPC-1细胞增殖、迁移、侵袭和EMT等恶性生物学行为并促进其凋亡的作用，且其对健康SD大鼠主要脏器基本无毒副作用，提示鳖甲煎丸可能成为临床上具有抗胰腺癌功效的潜在药物。

细胞增殖和凋亡在肿瘤发展中起着关键作用。Ki-67和PCNA是临床上常用于评估肿瘤细胞增殖、恶性程度和预后的重要指标。研究报道，胰腺癌患者中PCNA高表达，提示预后不良^［12］。Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路是介导细胞凋亡的关键通路，其中Bcl-2蛋白家族成员是细胞凋亡的重要调控因子，Bcl-2通过激活Caspase-9和Caspase-3，启动细胞凋亡级联反应，最终导致细胞凋亡^［13］。本研究显示，鳖甲煎丸含药血清显著降低了Ki-67、PCNA、Bcl-xl、Bcl-2蛋白表达，显著增加了Caspase 3、Caspase 9、Bax蛋白表达，提示鳖甲煎丸含药血清可通过调控增殖和凋亡信号，抑制胰腺癌细胞恶性进展。

EMT是指上皮细胞通过塑性改变和短暂去分化呈现间充质表型的多步骤生物学过程，表现为维持上皮细胞表型的E-cadherin下调，维持间充质表型的N-cadherin、Vimentin上调。EMT是肿瘤转移的早期事件，经历EMT的胰腺癌细胞在此期间表现出增强的迁移和侵袭能力，影响胰腺癌的复发和预后^［14］。本研究发现鳖甲煎丸含药血清在体外有较强的抑制胰腺癌AsPC-1细胞EMT进程的能力，并且抑制了细胞迁移和侵袭。

PI3K/AKT信号通路是细胞内一条重要的细胞传导通路，涉及包括细胞生长、增殖、分化和凋亡在内的多种生物过程^［15］。据报道，负调控PI3K/AKT通路可抑制胰腺癌细胞增殖并促进凋亡^［16］；抑制PI3K/AKT通路可抑制肝癌细胞^［17］和胃癌细胞^［18］的恶性表型。因此，抑制PI3K/AKT信号通路激活可能是一种很有前途的治疗胰腺癌的策略。Western blot实验表明，鳖甲煎丸含药血清抑制了胰腺癌AsPC-1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达，提示鳖甲煎丸含药血清抑制胰腺癌AsPC-1细胞恶性生物学行为的分子机制可能与拮抗PI3K/AKT通路相关。

综上所述，鳖甲煎丸含药血清能够显著抑制胰腺癌AsPC-1细胞增殖、集落形成、迁移、侵袭和EMT进程，促进细胞凋亡，具体分子机制可能涉及抑制PI3K/AKT信号通路。此外，本研究基于UHPLC-MS/MS技术，鉴定出鳖甲煎丸含药血清排名前3的入血有效活性成分：高熊果苷、槲皮素和苍术素。有研究报道，槲皮素可抑制胰腺癌细胞的生长、迁移、侵袭并诱导其凋亡^［19］；高熊果苷^［20］和苍术素^［21］可阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路促进细胞凋亡。由此可见，这些活性成分可能是鳖甲煎丸对胰腺癌具有抗癌作用的主要基础物质，也提示鳖甲煎丸是通过多种化合物之间的协同作用共同实现抗癌作用。但鉴于中药复方鳖甲煎丸成分复杂，探究关键成分在抗胰腺癌发病中的作用以及在体内实验中的验证是未来研究应着重考虑的方面。

作者贡献度说明：

崔笑妍：实验设计、实施以及论文撰写；李尹凡：实验实施；丁焕然、刘国荣：实验设计指导；张荣花、于笑涵：实验结果分析；王梅梅：论文撰写指导；章广玲：项目构思者及负责人、基金获取。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

河北省教育厅在读研究生创新能力培养资助项目(CXZZSS2024056)

河北省自然科学基金资助项目(H2023209047)

河北省重点研发计划项目(213777115D)