海南萝芙木果胶多糖通过MAPK/NF‑κB信号通路调控小鼠溃疡性结肠炎的焦亡机制研究

The pyroptosis mechanism of pectic polysaccharides of Rauvolfia erticillata(Lour.) Baill.var. hainanensis Tsiang in regulating ulcerative colitis mice through MAPK/NF‑κB signaling pathway

摘要

目的 研究海南萝芙木果胶多糖（pectic polysaccharides，PPs）对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的小鼠溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的治疗作用及其通过介导丝裂原活化蛋白激酶（mitogen‑activated protein kinase，MAPK）/核因子κB（nuclear factor kappa‑B，NF‑κB）/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide‑binding oligomerization domain‑like receptorprotein 3，NLRP3）信号通路对结肠上皮细胞焦亡的影响。 方法 将24只6~8周龄的C57雄性小鼠随机分成3组：正常对照组、模型组、和果胶多糖治疗组，每组8只。除正常组外，其余2组分别予以5%葡聚糖硫酸钠盐（DSS）自由饮用7 d制备UC小鼠模型，成功造模后，果胶多糖治疗组小鼠继续灌胃治疗7 d。记录小鼠体重变化、便血情况和疾病活动指数（DAI），分离完整结肠测量长度；苏木素‑伊红（HE）染色观察结肠组织病理变化；免疫组化法检测检测Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α的表达，Western blotting检测结肠组织细胞焦亡（Caspase‑1、IL‑18、IL‑1β、NLRP3、Cleaved‑GSDMD）和MAPK/NF‑κB 通路（p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK）蛋白表达；通过透射电镜观察细胞焦亡形态；双荧光素酶报告基因实验和 ChIP 实验检测 NF‑κB p65 与 NLRP3 启动子的结合情况。 结果 与模型组相比，PPs治疗组能减缓小鼠体重下降，抑制结肠缩短、减轻结肠病理损伤，DAI评分低于DSS模型组（P<0.05），结肠上皮细胞焦亡相关因子NLRP3、Caspase‑1、IL‑1β、IL‑18、TNF‑α、Cleaved‑GSDMD的蛋白表达显著降低（P<0.01），结肠组织中p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK蛋白的表达显著降低（P<0.05）。透射电镜观察到细胞焦亡形态在部分细胞呈现焦亡的改变；双荧光素酶报告基因实验和 ChIP 实验证实NF‑κB p65 基因靶向作用于NLRP3基因的启动子区域，PPs通过增强 促进 NLRP3 的转录。 结论 PPs可通过MAPK/NF‑κB信号通路抑制细胞焦亡，从而抑制DSS小鼠结肠炎症；NF‑κB 转录结合NLRP3启动子可能是影响结直肠细胞焦亡的关键机制。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic efficacy of pectic polysaccharides （PPs） on dextran sulfate sodium salt （DSS） induced ulcerative colitis in mice. The therapeutic effect of ulcerative colitis （UC） and its role in mediating mitogen‑activated protein kinase （MAPK）/nuclear factor kappa‑B （NF‑κB），and effect of NF‑κB/nucleotide‑binding oligomerization domain‑like receptorprotein 3 （NLRP3） signaling pathway on pyroptosis in colonic epithelial cells was also identified. Methods The study utilized a total of 24 male C57 mice， aged between 6‑8 weeks， which were randomly assigned into three groups： control group， model group， and PPs treatment group. Each group consisted of 8 mice. In addition to the control group， the other two groups were given 5% dextran sulfate sodium salt （DSS） to drink freely for 7 days to prepare UC mouse model. After successful modeling， the mice in the PPs treatment group continued to receive gavage for 7 days. The changes in body weight， presence of blood in stool， and disease activity index （DAI） of the mice were recorded， and the whole colon was separated and measured. The pathological changes of colon were observed by hematoxylin‑eosin （HE） staining. The expressions of caspase‑1， IL‑1β and TNF‑α were detected by immunohistochemistry， while pyroptosis （caspase‑1， IL‑18， IL‑1β， NLRP3， Cleaved GSDMD） and the protein expression of MAPK/NF‑κB pathway （p38， p‑p38， p65， p‑p65， JNK， p‑JNK， ERK， p‑ERK） in colon tissues was analyzed using Western blotting. The morphology of pyroptosis was observed by transmission electron microscope. Dual luciferase reporter gene assay and ChIP assay were used to detect NF‑κB p65 binding to NLRP3 promoter. Results Compared with the model group， treatment with PPs attenuated weight loss in mice and inhibited colon shortening while alleviating colon pathological injury； DAI score was lower than that of DSS model group （P<0.05）. The protein expressions of NLRP3， caspase‑1， IL‑1β， IL‑18， TNF‑α， cleaved GSDMD in colon epithelial cells were significantly decreased （P<0.01），and the expressions of p38， P‑P38， p65， P‑P65， JNK， P‑JNK， ERK， P‑ERK proteins in colon tissues were significantly decreased （P<0.05）. The morphology of pyroptosis in some cells was observed by transmission electron microscope. Dual luciferase reporter gene assay and ChIP assay confirmed that NF‑κB p65 gene targeted the promoter region of NLRP3 gene， and PPs promoted NLRP3 transcription by enhancing it. Conclusion PPs may exert an inhibitory effect on cell pyroptosis through the modulation of the MAPK/NF‑κB signaling pathway， subsequently attenuating colonic inflammation in DSS‑induced mice models. The transcriptional binding of NF‑κB to the NLRP3 promoter may be represents a pivotal mechanism that influences the pyroptosis of colorectal cells.

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 果胶多糖 / 海南萝芙木 / MAPK信号通路 / 核因子‑κB / 细胞焦亡

Key words

Ulcerative colitis / Pectic polysaccharides / Rauvolfia erticillata（Lour.） Baill.var.hainanensis Tsiang / MAPK signaling pathway / Nuclear factor‑κB / Pyroptosis

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性反复发作的非特异性炎症性肠道疾病，其特征是黏膜及黏膜下层的持续性炎症反应，可严重影响患者的生活，导致长期负担^［1］。UC目前常用的治疗药物包括水杨酸类制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂。这些药物可以控制减轻症状并帮助维持缓解，但疗效不稳定，常出现不良反应及副作用，价格昂贵，停药后易复发，患者依从性及耐受性差^［2］。近年来，从天然植物中寻找有效的治疗UC的药物逐渐成为研究热点之一^［3］。

细胞焦亡（Pyroptosis）是不同于细胞凋亡和细胞坏死特征的另外一种程序性细胞死亡方式。其主要受两个主要途径调控，即依赖于半胱天冬酶（Caspase）‑1的经典焦亡途径和依赖于Caspase‑4/5/11的非经典焦亡途径^［4］。其需要两步机制——炎性小体NLPR3的激活和焦亡的诱导。首先是启动步骤，在此过程中产生转录前促炎介质，如proIL‑1β，炎性体NLPR3和Caspase‑11。其次是激活步骤，炎性小体被组装，Caspase‑1被激活。激活后的Caspase‑1具有蛋白水解活性，将proIL‑1β和proIL‑18切割成活性形式。此外，Caspase‑1还能切割Gasdermin D诱导焦亡^［5］。近期研究表明，NLRP3激活可导致GasderminD蛋白介导的细胞焦亡^［6］，抑制过度的NLRP3激活可以缓解DSS诱导的小鼠结肠炎炎症反应^［7］。活化的Caspase激活导致细胞焦亡，会引发炎症反应并分泌促炎细胞因子，可能是UC治疗的有潜力的靶标^［8］。反式‑10‑羟基‑2‑癸酸可以通过抑制焦亡来治疗UC，而且它还可以增强结肠的屏障功能^［9］。这些结果表明为研究细胞焦亡在UC中的机制和治疗提供了新的线索和途径。

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen‑activated protein kinase，MAPK）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，包括p38MAPK，胞外合成调控激酶 （ERK），c‑Jun氨基末端激酶（JNK）和ERK5等主要亚家族组成。有研究表明，降低p38、ERK、JNK和NF‑κB的磷酸化可减少细胞焦亡和炎症反应^［10］，而MAPK信号通路还可以通过磷酸化和调节核因子‑κB（NF‑κB）的活性，影响细胞炎症反应^［11］。MAPK/NF‑κB信号通路共同在免疫和炎症反应中起关键作用，是溃疡性结肠炎等炎症疾病研究的焦点^{［12，13］}，MAPK/NF‑κB信号通路发挥抗炎作用可能与焦亡相关^［10］。

海南萝芙木是一种原产于中国海南岛的药用植物，被广泛使用作为我国重要的南药。前期研究发现海南萝芙木提取物中的果胶多糖（PPs）能够抑制DSS诱导的小鼠结肠炎^［14］，这一作用可能涉及对MAPK/NF‑κB信号通路以及细胞焦亡过程的调控^［10］。然而，PPs是否具有通过调控MAPK/NF‑κB/NLRP3信号通路来抑制细胞焦亡作用，从而缓解UC炎症状态，目前尚不清楚。本研究旨在深入探讨PPs在UC治疗中的潜在作用机制，特别是其在调节MAPK/NF‑κB/NLRP3信号通路方面的作用，为海南萝芙木治疗UC的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

从湖南SJA实验动物有限公司购买24只6~8周龄BALB/C雄性小鼠，体重17~22 g/只，在西安21世纪生物科技有限公司实验室使用架式笼饲养，小鼠被放置在标准环境条件下，温度保持在（23±1） ℃，湿度50%~60%，12 h的光/暗循环，并且可以自由获取食物和水。食用消毒后的实验动物配合饲料，饮用水亦过滤、消毒。本研究动物实验获得海南省人民医院动物伦理委员会批准（20210305）。

1.1.2 细胞

实验所用细胞为人肾上皮细胞系293T购自上海玉博生物有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM培养基（来源于赛默飞世尔科技中国），在37 ℃饱和湿度、含5%CO₂的孵箱中培养。

1.1.3 药材

葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量36 000~50 000），翊圣生物公司提供。海南萝芙木根于2022年11月采于海南省尖峰岭国家森林公园，植物采集后经海南大学药学研究员刘平怀教授鉴定为海南萝芙木。

1.1.4 抗体及试剂

兔抗Caspase‑1多抗、鼠抗TNF‑α单抗以及兔抗Cleaved‑GSDMD多抗、抗人甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体由Proteintech公司提供。兔抗IL‑18单抗、鼠抗IL‑1β单抗、兔抗NLRP3单抗、鼠抗p‑p38单抗、兔抗JNK单抗、兔抗p‑JNK单抗、鼠抗ERK单抗等抗体皆由CST公司提供。鼠抗p38单抗由BIORBYT公司提供。兔抗p65单抗由Abcam公司提供。兔抗p‑p65多抗由sigma公司提供。兔抗p‑ERK多抗由Abclonal公司提供。兔抗山羊IgG‑HRP多抗由爱必信公司提供。

RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒由碧云天公司提供。PVDF膜由Merck Millipore公司提供。DAB显色试剂盒由AURAGENE公司提供。DMEM培养基、胎牛血清由Gibco公司提供。胰酶由Genview公司提供。双荧光素酶检测试剂盒由promega公司提供。转染试剂由汉恒生物公司提供。SimpleChIP^® Enzymatic Chromatin IP Kit （Magnetic Beads）（品牌：Cell Signaling 货号：9003S）。

1.1.5 仪器

电泳仪电源、双垂直电泳仪来自北京六一品牌。快速转膜仪来自金斯瑞生物科技品牌。水平脱色摇床来自海门其林贝尔品牌。台式高速冷冻离心机来自Thermo品牌。化学发光仪来自上海勤翔品牌。生化培养箱来自一恒仪器品牌。显微镜来自莱卡品牌。微波炉来自美的品牌。生物组织摊烤片机来自武汉俊杰电子有限公司。盖玻片来自Wexis品牌。载玻片来自亿洲品牌。CO₂恒温培养箱来自Thermo Fisher品牌。透射电子显微镜来自日立有限公司。倒置显微镜来自CKX41品牌。离心机来自平凡品牌。荧光素酶检测仪来自BLT品牌。

1.2 研究方法

1.2.1 果胶多糖（PPs）提取

按照其描述的方法提取PPs，并对其进行了细微的修改^［15］。简而言之，取5 g根茎，40 ℃干燥，50 ℃稀盐酸（pH 4.4）处理3 h， 0.7%草酸铵水溶液提取，多糖部分用10 mL 96%乙醇沉淀，之后8 000 g离心过滤10 min，得到沉淀，在40 ℃下干燥。

1.2.2 动物的分组及处理

将24只小鼠编号后抽签随机分为3组，每组8只，进行前瞻随机对照实验。3组分别是：（1）正常对照组；（2）DSS模型组；（3）DSS+PPs治疗组。分笼喂养，除正常对照组外其余2组参照Cooper等^［16］的方法建立DSS小鼠结肠炎模型。步骤如下：将DSS溶于蒸馏水中配成5%DSS溶液，让小鼠自由饮用7 d。药物干预组（DSS + PPs组）从造模结束24 h（即第8天）开始给予海南萝芙木提取物果胶多糖（100 mg/kg）灌胃，每只小鼠每次灌胃0.2 mL，每天1次；对照组和DSS模型组用0.9%生理盐水每日灌胃0.2 mL，每天1次，连续灌胃7 d后处死各组小鼠。

1.2.3 一般情况观察

每日对小鼠的进食、精神状态、食欲、毛发、营养状况等一般情况进行评价，每日体重称量并记录，观察小鼠的腹泻、血便情况，记录粪便性状（正常、半松软、松软）并使用联苯胺法测定粪便潜血情况。结合小鼠体重下降情况、粪便性状、血便情况对小鼠DAI进行评估，DAI评分用于评估结肠炎的严重程度^［17］，将体重下降、观察直肠出血大便、大便黏稠度作为总评分计算。最大值为14分。

实验结束后，各组小鼠采用颈椎脱臼法处死。取完整结肠测量长度并拍照，同时取结肠后段2~3 cm 处剖开拍照，剩余结肠分段保存于4%多聚甲醛和-80 ℃冰箱待用。剖腹分离结肠，并沿肠系膜纵行剖开，用冰生理盐水反复冲洗，取病变明显处，以10%中性福尔马林固定，常规包埋，切片。

1.2.4 组织学评价

取4%多聚甲醛固定的结肠组织，脱水后石蜡包埋，切成5 μm薄片，进行苏木素‑伊红（H&E）染色。于光学显微镜下观察组织形态。

1.2.5 免疫组织化学检测黏膜组织细胞Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α蛋白表达

将石蜡组织块切片，厚度4 μm；脱蜡水化，常温下PBS冲洗5 min；分别滴加正常小牛血清，滴加Caspase‑1抗体、IL‑1β、TNF‑α工作浓度依次为1∶200，1∶400，1∶200，底物DAB显色，苏木素复染，封片。在光镜下，细胞质和细胞核内出现棕黄色颗粒的细胞为染色阳性细胞，在40倍高倍镜下选取典型视野计数100个细胞，其中阳性细胞数作为Caspase‑1抗体、IL‑1β、TNF‑α计数值，并以百分率计算。

1.2.6 透射电子显微镜观察

1%锇酸固定剂固定组织样品溶液1~2 h，用0.1 mol磷酸溶液漂洗3次，每次5 min，并使用乙醇脱水。用100%纯丙酮包埋溶液（1∶2），在37 ℃烘箱内过夜，然后在45 ℃和60 ℃烘箱内分别孵育12 h、48 h。Lycra EMUC7超薄切片机制备70 nm切片。切片染色用2%乙酸铀酰柠檬酸铅双染色，透射电子显微镜（日立有限公司）HT7800135（80 kV）观察，拍片。

1.2.7　蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测结肠组织细胞焦亡（Caspase‑1、IL‑18、IL‑1β、NLRP3、Cleaved‑GSDMD）和MAPK/NF‑κB 通路相关蛋白（p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK）的表达情况参照试剂盒蛋白提取说明书进行，提取肠黏膜总蛋白。具体步骤：用干净的剪刀将0.2~0.5 g组织尽量剪碎，加2~5 mL细胞组织裂解液于匀浆器中，在冰上进行匀浆，置于冰上裂解30 min后，然后在4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清分装后置于-80 ℃保存。

制备SDS‑聚丙烯酰胺凝胶（SDS‑PAGE）8%分离胶和4%浓缩胶，每个泳道上样100 μg，80 V恒压40 min，120 V恒压50 min，至前沿到胶底。电泳结束后，胶和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）分别在转移缓冲液中平衡30 min，100 V恒压湿法电转移120 min。电转结束后PVDF膜用丽春红S染色，作分子量marker标记。用含0.05%Tween 20的三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBS）缓冲液漂洗3次，每次15 min，置于5%脱脂奶粉／TBST中4 ℃冰箱中封闭过夜，一张PVDF膜用Caspase‑1、IL‑18、IL‑1β、NLRP3、Cleaved‑GSDMD、p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK的抗体（分别为1∶500，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，l∶500，1∶500，l∶500，1∶1 000，l∶1 000，1∶500稀释溶于含5%BSA的TBS液）孵育，另一张PVDF膜用GAPDH抗体（1∶2 000稀释，溶于含5%BSA的TBS液）孵育，4 ℃过夜。以TBS洗膜3次，每次10 min。对应上述不同的膜分别加入HPR标记的兔抗山羊IgG二抗（l∶10 000溶于含5%BSA的TBS液），TBST漂洗15 min×3次。暗室中化学发光法检测 （ECL试剂），曝光。将获得的X光片结果扫描入计算机，用天能GIS凝胶图像处理系统软件对目标条带进行光密度分析。

1.2.8 染色质免疫共沉淀（ChIP）测定

将293T细胞在 10 cm的组织培养皿中生长。次日，用1%甲醛交联10 min，再悬浮和裂解。然后通过超声波将 DNA 剪切到 150~900 bp。加入NF‑κB抗体免疫沉淀富集蛋白与DNA复合物，分别收集input与IP的RNA，使用NLRP3引物进行PCR检测，得到的PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离并分析。上游NLRP3引物为 5'‑GCTGGCATCTGGATGAGGAA‑3'，下游引物为5'‑GTGTGTCCTGAGCCATGGAA‑3'。

1.2.9 双荧光素酶报告基因检测

取处于对数生长期的293T细胞，接种到24孔板中，待细胞生长密度至70%~90%后进行转染。根据结合位点设计NLRP3启动子野生型与反义突变型载体，构建到启动子介导表达的萤火虫荧光素酶（Firefil Luciferase）和海肾荧光素酶（Ranilla Luciferase）pGL3basicr载体中，与NF‑κB过表达质粒分别共同转染结直肠细胞，酶标仪检测萤火虫荧光与海肾荧光值，并统计分析NF‑κB与NLRP3结合关系。

1.2.10 统计学处理

采用GraphPad Prism软件（版本8.0.2）进行统计分析。两两比较采用t检验，多重比较采用单向方差分析（ANOVA）。数据以（\overline{x}\pm s）表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PPs对小鼠一般情况、体重及DAI评分的影响

正常组小鼠反应灵敏，喜动善食，毛发顺滑有光泽，体质量稳中有升，大便正常；造模3 d后，DSS模型组小鼠体重，活动次数减少且易蜷卧，摄食、饮水量减少，拱背，毛失光泽，精神倦怠，出现腹泻和血便；经PPs治疗后，小鼠体重回增，但与DSS模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），活动次数增多，摄食、饮水量增加，毛发有光泽，精神状态转好，血便逐渐消失，稀便逐渐减少。连续14 d对小鼠体重进行测定，对照组小鼠体重稳步增长，DSS模型组小鼠随着造模时间的延长体重显著减轻（P<0.01），DSS+PPs治疗组，在前4 d（造模时间）时体重下降，第8天开始萝芙木多糖给药开始，体重没有出现明显的下降，状况有所改善（P<0.01），见表1。与正常组比较，饮用DSS后各组的小鼠DAI积分随时间逐渐增加，在第8天开始，DSS+PPs组小鼠进行了3 d灌胃后，DSS+PPs组小鼠的DAI积分开始低于DSS模型组（P<0.05），见表2。

2.2 PPs对小鼠结肠长度影响

解剖发现 DSS模型组小鼠结肠长度变短，与周围组织黏连明显，肠壁明显厚、出现水肿，部分肉眼可见黏膜下充血、甚至出血及明显溃疡，正常组小鼠结肠无明显异常。与正常组比较，模型组小鼠结肠长度显著缩短（P<0.05）；DSS+PPs组小鼠结肠长度显著增加（P<0.05），见表3。

2.3 PPs对小鼠组织病理学的影响

正常组小鼠结肠组织镜下可见黏膜上皮结构完整清晰，腺体排列整齐规则，未见炎性细胞浸润；DSS模型组可见组织黏膜上皮细胞脱落，腺体结构紊乱，隐窝消失，有明显溃疡，黏膜及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润；与模型组相比，DSS+PPs组镜下各层组织结构存在，可辨清，黏膜损伤及黏膜下水肿较DSS模型组轻，且炎症细胞浸润较DSS模型组减少，由此可见给予PPs后均可减少黏膜损伤和黏膜下水肿，炎症浸润较少，组织学改变得到明显改善，见图1。

2.4 PPs对小鼠结肠组织Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α阳性细胞表达明显增高（P<0.05） ；在DSS + PPs组中，与DSS组相比，受损细胞的数量相对较少，Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α阳性细胞表达明显降低（P<0.05），见图2。

2.5 透射电镜检查观察PPs对细胞焦亡的影响

电子显微镜检查显示，对照组小鼠结肠组织形态正常（对照组为红色箭头）。用DSS小鼠结肠表现出典型的焦亡改变，其特征是细胞异常扩大、细胞膜破裂和细胞内容物释放引发局部炎症（DSS组为红色箭头）。在用PPs处理的DSS小鼠中部分细胞呈现焦亡的改变，而其余细胞没有（DSS+PPs组的红色箭头），见图3。

2.6 PPs对小鼠结肠组织Caspase‑1、IL‑18、IL‑1β、NLRP3、Cleaved‑GSDMD、p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK的蛋白表达的影响

与正常组相比，DSS模型组Caspase‑1、IL‑18、IL‑1β、NLRP3、Cleaved‑GSDMD、p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK蛋白的表达增高明显（P<0.05）；与DSS模型组比较，DSS+PPs治疗组Caspase‑1、IL‑18、IL‑1β、NLRP3、Cleaved ‑GSDMD、p38、p‑p38、p65、p‑p65、JNK、p‑JNK、ERK、p‑ERK蛋白的表达降低（P<0.05），见图4、5。

2.7 ChIP实验验证NF‑κB与NLRP3结合关系

通过hTFtarget数据库合位点（图6），结合（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget#！/）预测发现，RELA（即p65，别名NF‑κB）与NLRP3具有结合序列为：“TTGGAAAATCCA”。从定量PCR结果可以看出，阴性对照相比阳性对照的相对富集丰度显著增加（P<0.01），表明体系可信，ChIP样本的相对富集丰度显著增加（P<0.01）；表明p65（NF‑κB）与NLRP3启动子结合。见图7。

2.8 双荧光素酶实验验证NF‑κB与NLRP3启动子结合关系

各组别双荧光素酶检测数据如下所示（图8），第1组pcDNA3.1‑P65+psicheck2与第2组pcDNA3.1‑P65+NLRP3 promotor‑WT相比较，第1组双荧光素酶活性降低；第4组pcDNA3.1+NLRP3 promotor‑WT与第2组pcDNA3.1‑P65+NLRP3 promotor‑WT相比较，第4组双荧光素酶活性降低；第2组pcDNA3.1‑P65+NLRP3 promotor‑WT与第3组pcDNA3.1‑P65+NLRP3 promotor‑MUT相比较，第2组双荧光素酶活性降低。以上结果说明：P65基因靶向作用于NLRP3基因的启动子区域。

3 讨论

UC是一种慢性反复发作的结肠炎症性疾病，目前尚无有效的治愈方法，从天然植物中寻找有效的治疗UC的药物是当前该领域研究的热点。海南萝芙木，一种源自中国海南岛的药用植物，主要生长在海南乐东尖峰岭和陵水吊罗山等热带雨林区域，是我国重要的南药，其药物有效成分主要是植物提取的果胶多糖^［18］。Popov等^［15］通过实验发现，使用0.7%草酸铵溶液可以从印度萝芙木中提取出果胶多糖，结肠炎小鼠灌服该粗提物过后，观察到结肠溃疡的面积和直肠髓过氧化物酶的含量均有所减少，表明萝芙木植物中的糖类成分具有抗炎特性，但机制不清。前期研究证实海南萝芙木提取物，特别是果胶多糖对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎小鼠模型有治疗作用，可能通过调节NF‑κB途径和IL‑17^{［19，20］}。通过进一步的探讨发现其机制可能与NF‑κB和MAPK信号通路有关，其中小鼠骨髓来源的树突状细胞发挥着重要作用^［21］。

细胞焦亡的特点在于由Gasdermin家族蛋白介导形成的细胞孔洞，导致细胞肿胀并最终破裂，释放炎症介质，从而促进炎症反应的进展过程，是一种程序性细胞死亡形式。其作用机制通过两种不同的途径实现，分别由不同的分子介导，一种途径涉及Caspase‑1介导的细胞程序性死亡，另一种途径则由Caspase‑4/5/11介导。Caspase‑11还可以裂解Gasdermin D引发细胞焦亡，裂解的Gasdermin D还可以通过细胞内源途径触发caspase‑1的NLRP3依赖性激活，即使导致NLRP3激活的确切机制尚不清楚^［4］。细胞焦亡主要在巨噬细胞和树突状细胞这两种细胞类型中被观察到^［22］，而α肿瘤坏死因子（TNF‑α）是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与炎症反应和免疫反应。有研究发现，抑制巨噬细胞的焦亡可能是一种新颖的方法来治疗DSS小鼠结肠炎^［23］。在研究中，DSS组小鼠结肠组织中的Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α的表达显著升高；经PPs治疗后，Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α的表达水平显著低于DSS组，这表明焦亡可能参与了UC的发生和发展过程，PPs抑制UC的机制可能与降低焦亡关键蛋白Caspase‑1、IL‑1β与TNF‑α有关。透射电镜检查也证实PPs可通过影响细胞焦亡改善DSS诱导结肠炎症。

NLRP3是一个与炎症反应密切相关的因子，在多种疾病的炎症过程中扮演重要角色^［24］。在先天免疫系统中，NLRP3能够识别无菌性炎症信号，是机体对病原体和组织损伤做出反应的关键调控因子，当细胞遭遇特定的损伤或感染信号时，NLRP3会被激活，形成炎症小体复合体^［25］。焦亡是一种由炎症小体触发的细胞死亡形式，与免疫调节密切相关，在炎症性疾病中发挥核心作用。炎症小体作为一种平台，能够促进前炎症细胞因子的转化，通过激活炎症相关的Caspase，进而驱动Gasdermin D的裂解，并控制Caspase‑1的活化，最终促使IL‑1β和IL‑18的生成与成熟^［26］。而且IL‑1细胞因子家族参与调节肠道内环境的稳定、肠道炎症反应以及维持健康菌群的平衡，特别是NLRP3炎症小体能够诱导骨髓细胞产生IL‑1β，从而加剧肠道炎症的形成^［27］。研究表明，在UC中，细胞焦亡被认为是导致肠道炎症和组织损伤的关键机制之一^{［23，24］}。因此，抑制细胞焦亡可能成为治疗UC的一种潜在策略。

MAPK信号通路是一种重要的细胞信号传导途径，可以通过磷酸化和NF‑κB的活性来影响细胞的炎症反应^［11］。而抑制MAPK信号通路（JNK，ERK‑1/2和p38）和NF‑κB活性和磷酸化，可以抑制炎症细胞因子的产生^［28］。MAPK信号通路激活可以通过调节经典NF‑κB信号转导的下游激活导致炎症，其中显示p65磷酸化适度但持续增加^［11］。而下调NF‑κB p65的表达，可以显著抑制NF‑κB p65的核转位，减少IL‑8等炎症因子的释放，达到改善UC症状，减轻肠道的炎症反应^［29］。PPs能够对DSS诱导的小鼠产生治疗效果，这一作用可能是通过抑制MAPK/NF‑κB信号通路的激活来实现的。此外，有证据表明，参与焦亡的NLRP3炎症小体的激活也与MAPK/NF‑κB信号通路密切相关^［30］，MAPK/NF‑κB信号通路可以通过抑制细胞焦亡改善炎症反应^［10］。且NF‑κB信号传导通路导能够促进NLRP3、pro IL‑1β和pro IL‑18等炎症因子的转录和生成，进而触发NLRP3炎症小体的激活^［23］。有研究表明，通过抑制P38 MAPK信号通路，可以增强急性肺损伤模型中巨噬细胞内NLRP3炎性小体的激活及细胞焦亡过程^［31］。布司特通过抑制 TLR4介导的NF‑κB和MAPK信号传导通路来阻断细胞焦亡，从而减轻由叶酸引起的急性肾脏损害^［10］。HET0016可能通过抑制p38 MAPK的磷酸化来缓解神经元细胞焦亡^［32］。P‑II通过NF‑κB信号通路抑制NLRP3炎症小体的产生，缓解了DSS诱导的UC^［33］。在肺癌的发展过程中，NF‑κB能够调控细胞凋亡与焦亡之间的转换^［34］。以上研究表明，MAPK/NF‑κB 信号通路可能与焦亡相关。在本研究中通过hTFtarget数据库预测发现，NF‑κB p65与NLRP3具有结合位点，结合序列为：“TTGGAAAATCCA”。进一步通过双荧光素酶报告基因实验和 ChIP 实验证实NF‑κB p65基因靶向作用于NLRP3基因的启动子区域，PPs可能通过抑制NLRP3 的转录，证实了上述研究结论。

上述研究进一步证实萝芙木果胶多糖PPs对DSS小鼠结肠炎有治疗作用，其作用机制可能与PPs抑制MAPK/NF‑κB信号通路和细胞焦亡有关。而进一步研究发现，NF‑κB和NLRP3启动子结合，NF‑κB P65基因靶向作用于NLRP3基因的启动子区域，而NLRP3激活还可以导致细胞焦亡^［6］，必然对受细胞焦亡的相关炎症因子表达释放产生影响。MAPK信号通路可能通过促进NLRP3转录促进细胞焦亡，提示PPs治疗UC的机制可通过调节MAPK/NF‑κB信号通路抑制细胞焦亡起到改善炎症的作用。

该研究揭示了海南萝芙木在治疗UC中的潜在机制，为开发具有海南特色的南药治疗UC提供了理论依据，为临床治疗UC提供了新的治疗靶点和选择。在传统药物治疗效果不佳的情况下，海南萝芙木辅助治疗UC可能成为一种新的治疗途径，有助于提高UC患者的治疗效果和生活质量。

作者贡献度说明：

王柳丹：动物造模、数据筛选、数据分析、文章绘图及撰写论文；陈旭永：协助动物药物干预及造模、细胞培养、细胞处理；吴海东：协助动物饲养、取材，指标检测；苗新普：实验设计、论文修改及文章审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金(821MS126)

海南省教育厅重点课题(Hnky2021ZD‑13)

海南省研究生创新科研课题(HYYB2023A25)

海南省重点研发计划项目(ZDYF2022SHFZ099)