Rac1/JNK对肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡的影响及相关机制研究

Effect of Rac1/JNK on apoptosis of lung tissue cells in mice with emphysema and its related mechanisms

摘要

目的 探讨Rac1/JNK通路在肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡中的潜在作用机制。 方法 40只雄性C57BL/6健康小鼠，随机分为对照组、肺气肿组、肺气肿+Rac1抑制剂NSC23766干预组（肺气肿+NSC组）、肺气肿+JNK抑制剂SP600125干预组（肺气肿+SP组），每组均为10只。采用香烟熏吸结合腹腔注射香烟烟雾提取物方法构建模型，肺气肿+NSC组和肺气肿+SP组在模型建立之初每组均接受相应抑制剂进行腹腔注射，连续用药28 d。Western blot检测肺组织Rac1、JNK、p-JNK 、c-Jun和Bax蛋白的表达水平。H&E染色对肺组织的病理变化进行观察，并计算肺泡的平均内衬间隔（mean linear intercept，MLI）以及肺泡的破坏指数（destruction index， DI），qRT-PCR方法检测肺组织中Rac1 mRNA和JNK mRNA的相对表达水平，TUNEL技术评估小鼠肺组织细胞凋亡的情况，并计算凋亡指数（apoptosis index， AI）。 结果 与对照组相比，肺气肿组MLI、DI、AI升高（P<0.05），JNK、Rac1、p-JNK、c-Jun、Bax表达水平及Rac1 mRNA、JNK mRNA相对表达量升高（P<0.05）；与肺气肿组相比，用了Rac1抑制剂及JNK干预剂组的MLI、DI、AI降低（P<0.05），JNK、Rac1、p-JNK、c-Jun、Bax表达水平及Rac1 mRNA、JNK mRNA相对表达量降低（P<0.05）。 结论 抑制Rac1可抑制肺气肿小鼠肺组织中JNK的磷酸化，抑制Rac1-JNK通路可减轻肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡，这可能与其减少促凋亡蛋白Bax的表达有关。

Abstract

Objective To investigate the potential mechanism of Rac1/JNK pathway in apoptosis of lung tissue cells in emphysema mice. Methods A total of 40 male C57BL/6 healthy mice were randomly divided into a control group， an emphysema group， an emphysema+Rac1 inhibitor NSC23766 intervention group （emphysema+NSC group）， and an emphysema+JNK inhibitor SP600125 intervention group （emphysema+SP group）， with 10 mice in each group. The models were constructed by cigarette smoke combined with intraperitoneal injection of cigarette smoke extract for the emphysema+NSC group and the emphysema+SP group. At the beginning of the establishment of the models， each group received intraperitoneal injection of the corresponding inhibitor for 28 consecutive days. Western blot was used to detect the expression levels of Rac1， JNK， p-JNK， c-Jun， and Bax proteins in lung tissues. The pathological changes of the lung tissues were observed using H&E staining， the mean lining interval （MLI） and the destruction index （DI） of alveoli were calculated， the relative expression levels of Rac1 mRNA and JNK mRNA in lung tissue were detected by qRT-PCR， the apoptosis of mouse lung tissue cells was evaluated by the TUNEL technology， and the apoptosis index （AI） was calculated. Result Compared to the control group， MLI， DI， and AI in the emphysema group were increased （P<0.05）， and the expression levels of JNK， Rac1， P-JNK， c-Jun， and Bax and the relative expression levels of Rac1 mRNA and JNK mRNA were increased （P<0.05）. Compared to the emphysema group， MLI， DI， and AI in the Rac1 inhibitor and JNK intervention group were decreased （P<0.05）， and the expression levels of JNK， Rac1， P-JNK， c-Jun， and Bax and the relative expression levels of Rac1 mRNA and JNK mRNA were decreased （P<0.05）. Conclusion Inhibition of Rac1 can suppress the phosphorylation of JNK in the lung tissue of mice with emphysema and inhibition of the Rac1-JNK pathway can alleviate apoptosis of lung tissue cells in mice with emphysema， which may be related to its reduction in the expression of the pro-apoptotic protein Bax.

Graphical abstract

关键词

Rac1 / JNK / 肺气肿 / 细胞凋亡指数

Key words

Rac1 / JNK / Emphysema / Apoptosis index

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种常见的，可预防和可治疗的呼吸系统疾病，是由呼吸道和/或肺泡异常诱发的持续呼吸症状和气流限制，并受到个体宿主因素（包括基因异常、肺发育异常和加速衰老）的影响^［1］。该病具有高患病率、高死亡率、治疗时间长、治疗费用高，且易复发等特点^［2］。慢阻肺发病机制复杂，目前公认的发病机制有慢性气道和肺部炎症形成、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化剂/抗氧化剂失衡、细胞凋亡以及先天免疫系统失衡等^［3-6］，肺气肿是COPD的主要病理特征，是COPD发生机制的研究重点，通过构建肺气肿模型是研究COPD的发病机制有效方法^［7］。

吸烟被认为是影响慢阻肺发病的主要因素之一，烟草烟雾会诱导氧化应激、炎症、细胞凋亡及自噬，从而促进COPD肺气肿的发展^［8，9］。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，在多细胞生物体的发育和稳态中起着关键作用^{［10，11］}。研究表明，Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物 1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1， Rac1），是Rho GTP酶的重要成员之一，参与细胞周期、凋亡和增殖^［12］；香烟烟雾可通过Rac1相关通路参与慢阻肺的病理生理过程^{［13，14］}。NSC23766是Rac1的特异性抑制剂^［15］。另外也有研究表明，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成员之一^［16］。JNK的激活通常与促进凋亡有关^［17］。SP600125能特异性抑制JNK表达，可减少细胞凋亡^［18］。Rac1通过激活JNK相关信号通路促进细胞凋亡来加重糖尿病肾病^［19］。在上述文中提到：JNK、Rac1均可促进细胞凋亡，且Rac1、JNK参与慢性阻塞性肺疾病的发生发展均已得到证实。本研究拟通过香烟熏吸（cigarette smoke，CS）结合腹腔注射香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）方法构建肺气肿小鼠模型，测定肺部组织中的Rac1和JNK的表达水平，以及评估肺泡的破坏程度和细胞凋亡的情况，探讨Rac1、JNK与肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡关系及该通路在肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡中的调控机制，从而为慢阻肺的防治提供新的思路，寻找新的治疗分子靶点。

1 试剂、材料与方法

1.1 动物

购自北京的斯贝福生物技术有限公司的雄性6~8周龄C57BL/6J健康小鼠40只，许可证号：SCXK：（京）2019-0010，合格证号：110324220107201621，体重18~20 g，饲养于贵州医科大学动物实验房内，环境恒温（25±2）℃、恒湿（55±10）%。向小鼠提供自然饮用水和无菌的全面营养饲料，以供其自由饮水和进食。经过7 d的适应性喂养后开始构建实验模型。本实验严格遵守《实验动物管理条例》和伦理委员相关规定，并于2022年10月11日通过贵州医科大学实验动物伦理委员会审核批准，审批编号为：2201508，操作步骤符合规范。

1.2 主要药物试剂

SP600125（MedChemExpress，MCE），NSC23766 （MedChemExpress，MCE），JNK抗体（Bioswamp），p-JNK抗体（abcam），Rac1抗体（Bioswamp），Bax抗体（Bioswamp），c-Jun抗体（Bioswamp），H&E染液（赛维尔），反转录cDNA试剂盒（thermoscientific），One Step qRT-PCR SYBR^® Green（诺唯赞），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）（碧云天），超纯RNA提取试剂盒（康为世纪），Marker Ⅱ DNA Ladder（Solarbio），超敏ECL化学发光试剂盒（biosharp），高灵敏化学发光试剂盒（赛维尔）。

1.3 主要材料、仪器

芙蓉王牌烟草（中国长沙中烟湖南实业有限公司），黄果树牌烟草（贵州黄果树烟草有限责任公司），实时荧光定量仪（美国Applied Biosystems公司），全自动封闭式组织脱水机（常州中威，TSJ-Ⅱ型），病理组织漂烘仪（常州市中威，PHY-Ⅲ型），正置显微镜（Leica），凝胶成像仪（天能），垂直电泳槽（BIO-RAD）。

1.4 方法

1.4.1 构建肺气肿模型及药物干预

参照 He及姜等^{［20，21］}的研究实验，使用CSE腹腔注射结合CS暴露的方法，构建肺气肿小鼠模型。肺气肿模型建立之初参考预实验和Veluthakal等^［22］ 的研究实验，于烟草烟雾暴露结束30 min后，每次予2.5 mg/kg（体重）进行腹腔注射NSC23766药物，每天1次；根据预实验和Wang等^［23］研究实验，每日予30 mg/kg（体重）进行腹腔注射SP600125药物，每天1次。肺气肿组和对照组接受相同频率0.3 mL/20 g的PBS溶液腹腔注射。

1.4.2 小鼠一般情况记录及标本采集

记录40只C57BL/6J小鼠行动、生理指标及外观特征，主要包括小鼠行动、毛发、反应、饮食、饮水、口鼻腔分泌物等情况。观察28 d，在第29天各组小鼠麻醉后收集血清及组织。

1.4.3 肺组织H&E染色及病理分析

将固定好的组织经过一系列脱水、包埋和切片处理，后进行二甲苯脱蜡、乙醇浸泡、H&E染色、盐酸酒精分化、伊红染色等步骤，最后完成固定。对肺组织进行镜检和拍照分析，每张切片于100倍下观察肺组织。采用双盲法阅片进行肺泡内衬间隔（MLI）的计算，每个标本随机选取5个视野，计算平均MLI，MLI=总长度/肺泡间隔数。使用Image J 软件，以视野中心画十字交叉线，测出十字线总长度，数出与十字交叉线相交的肺泡隔数量^［24］。肺泡破坏指数（DI）=破坏的肺泡数/计数的肺泡总数×100%^［25］。

1.4.4 小鼠肺组织qRT‑PCR测定

使用RNA提取试剂盒提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，逆转录生产cDNA，一步法实时荧光定量聚合酶链式反应，PCR扩增设置为：95 ℃ 5 min，（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s）×45个循环，扩增结束后进行熔解曲线检测。采用2^-△△CT法进行Rac1、JNK mRNA的相对定量分析，见表1。

1.4.5 Western blot检测小鼠肺组织Rac1、JNK、p‑JNK、c‑Jun、bax蛋白表达

肺组织样本蛋白提取，使用BCA蛋白质定量试剂盒测定样本中的蛋白浓度，制胶，将样品蛋白进行电泳转膜、然后封闭及抗体抗原反应，最后曝光显影拍摄。

1.4.6 TUNEL检测小鼠肺组织细胞凋亡

1.4.6.1 标本处理及制片

固定组织经过全自动脱水机脱水处理，经75%酒精（4 h）、85%酒精（2 h）、95%酒精（1 h）、100%酒精（3次，0.5 h/次）、二甲苯（2次，10 min/次）、石蜡（3次，时间分别为1、2、3 h），然后进去包埋和切片处理。往样本中注入50 μL的生物素标记液，随后在37 ℃的环境中，避免光照的条件下孵化60 min，PBS清洗3次。将样品与包含Streptavidin-HRP的50 μL工作液混合，然后在室温下静置30 min。进行DAB显色后进行H&E复染。随后3次脱水后，二甲苯透明化处理2次。最后，进行封片操作并观察。

1.4.6.2 图像采集及分析

显微镜观察拍片，采用Image J图像分析，其中阳性细胞指的是细胞核被标记成呈棕褐色的细胞，而阴性细胞指的是细胞核被标记成蓝紫色的细胞。含有支气管或大细支气管的被排除在分析之外。每个样本在200倍下随机取至少5个视野，每1个视野随机计数100个细胞中的阳性细胞数，计数5个视野取其平均值作为最终的肺组织细胞凋亡指数（AI）^［26］。

1.5 统计学处理

用SPSS 27.0软件完成数据分析，通过GraphPad Prism 10.0软件实现图表的绘制。采用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验。数据呈现正态分布，结果将通过（\overline{x}\pm s）表示；方差齐，用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较。如果存在显著差异，进一步通过LSD-t法来进行组间的两两比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况观察结果

40只C57BL/6小鼠在实验前活动、摄食、饮水、活动、毛发、精神、反应等正常。实验观察28 d后，对照组小鼠与实验前比较未见明显异常，其他三个模型组小鼠行动迟缓，挠鼻次数、口鼻分泌物增多，毛发脱落，精神萎靡、对外界刺激较迟钝，摄食、饮水量减少。

2.2 小鼠左肺组织病理切片H&E染色

2.2.1 切片H&E染色后光镜下观察（×200）

对照组可见肺组织结构清楚，各级支气管分支结构完整，偶见少量支气管上皮细胞脱落于支气管腔内，肺泡壁均匀，少量肺泡间隔、肺泡壁断裂破坏。肺气肿组：肺泡间隔、肺泡壁断裂破坏严重，泡腔扩大或形成大疱肺。肺气肿+SP组和肺气肿+NSC组：部分肺泡间隔、肺泡壁断裂破坏、肺泡腔扩大或形成大疱肺，见图1。

2.2.2 肺组织MLI及DI结果

肺气肿中MLI及DI较对照组明显升高（P<0.05），而肺气肿+NSC组、肺气肿+SP组中MLI及DI较肺气肿组降低（P<0.05），见图2。

2.3 Western blot检测小鼠右肺组织蛋白表达

肺气肿组中JNK、p-JNK、Rac1、Bax、c-Jun蛋白表达水平较对照组明显升高（P<0.05）；而肺气肿+NSC组、肺气肿+SP组中JNK、p-JNK、Rac1、Bax、c-Jun蛋白表达水平较肺气肿组明显降低（P<0.05），见表2、3。

2.4 各组小鼠AI比较

对照组几乎未见被染色细胞（棕褐色）即阳性细胞（凋亡细胞），而肺气肿组可见大量被染色（棕褐色）细胞，肺气肿+NSC组及肺气肿+SP组可见较多的被染色细胞，见图3。进一步计算AI发现肺气肿中MLI及DI较对照组明显升高（P<0.05），而肺气肿+NSC组、肺气肿+SP组中MLI及DI较肺气肿组降低（P<0.05），见图4。

2.5 肺组织Rac1 mRNA、JNK mRNA相对表达量结果

肺气肿组与对照组比较，Rac1 、JNK mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）；肺气肿+NSC组、肺气肿+SP组与肺气肿组比较，Rac1、JNK mRNA相对表达量明显降低（P<0.05），见表4。

3 讨论

COPD具有显著的临床异质性以及高发病率和死亡率，是呼吸系统常见的一种疾病^［27］。其作为一种高致死率的疾病，不仅严重降低了患者的生活质量，同时也为社会和家庭带来了沉重的经济压力。因此深入研究COPD的发病机制，寻找新的诊疗分子靶点具有极为重要的理论价值和现实意义。

吸烟是COPD的主要致病因素，且有文献报道，香烟烟雾可通过Rac1相关通路启动上皮细胞-间充质转化（EMT）从而参与慢阻肺的病理生理过程^{［13，14］}。Rac1是小GTP酶Rho家族的一个亚家族。Rac1可参与基因表达、细胞增殖、细胞存活、细胞粘附、细胞凋亡、细胞间接触，以及EMT、细胞迁移侵袭、氧化应激、炎症反应等^{［12，28-30］}。多项研究表明，Rac1可参与细胞凋亡的调节，如Rac1的过表达可增强细胞ROS从而促进心肌细胞凋亡^［31］，miR-133a过表达通过下调Rac1表达来抑制帕金森病细胞模型中的细胞凋亡^［32］。此外研究表明香烟烟雾提取物可促进肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡^［33］。目前关于Rac1如何介导肺气肿肺组织细胞凋亡的具体机制尚不明确，仍需要大量研究探索。

本研究的实验结果表明：肺气肿组中Rac1、Rac1 mRNA、Bax表达水平、AI明显升高，而加用了Rac1抑制剂组小鼠肺组织中Rac1、Rac1 mRNA、Bax蛋白表达水平及AI降低，而且相关研究表明Rac1在香烟烟雾引起的肺部炎症中起到关键作用，抑制Rac1的表达可减轻香烟烟雾诱导的小鼠肺部炎症^［34］。基于这些观察，本课题组发现抑制Rac1可减轻肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡，将进一步探索CS联合CSE诱导的Rac1调控肺气肿小鼠肺泡凋亡的分子机制。有文献报道，Rac1是JNK上游的激活剂^［35］。JNK是MAPK家族的一员，与炎症、氧化应激、细胞凋亡等密切相关。c-Jun是JNK下游的早期转录因子，激活Rac1可同时激活JNK、c-Jun^［36］。近年来多项研究表明，CSE可通过JNK信号通诱导细胞凋亡，如CSE可诱导JNK的激活从而促进COPD的发展，抑制JNK可抑制细胞凋亡^［37］；CSE的暴露可增加JNK的磷酸化水平，NYT 治疗通过抑制人肺成纤维细胞中的JNK 信号通路改善了CSE 诱导的细胞凋亡和炎症^［38］。此外，Ying等^［19］报道Rac1通过激活JNK相关信号通路促进细胞凋亡来加重糖尿病肾病，Jin等^［39］报道了抑制Rac1可以通过抑制JNK激活来保护细胞免于凋亡。

本研究发现，与对照组比较肺气肿模型组小鼠肺泡腔明显扩大，大量肺泡腔融合形成肺大疱，MLI及DI指标明显升高；且肺组织中Rac1、JNK、c-Jun蛋白表达水平明显上调，JNK磷酸化水平明显增加，Rac1 mRNA及JNK mRNA表达水平升高，这表明Rac1、JNK及其下游蛋白c-Jun参与了小鼠肺气肿的调控。此外CS及CSE诱导肺气肿小鼠中JNK的磷酸化，这与Murata等^［38］的研究一致。进一步比较肺气肿模型组与Rac1及JNK干预剂组，发现用了Rac1抑制剂NSC23766及JNK抑制剂SP600125组的DI及MLI较肺气肿模型组下降，且肺组织中Rac1、JNK、c-Jun、Rac1 mRNA、JNK mRNA表达水平明显降低，JNK磷酸化水平降低；其中用了JNK抑制剂组小鼠肺组织中JNK的磷酸化明显下调，这提示抑制Rac1可能通过抑制JNK通路的激活从而延缓CS及CSE诱导的小鼠肺气肿的进展。此外肺气肿组中磷酸化的JNK明显增加，同时在肺组织还检测到促凋亡蛋白Bax大量表达、AI明显增加，这与Blatt等^［40］研究中提出的JNK可激活Bax的表达促进细胞凋亡观点相同。另一方面，研究中发现用了Rac1抑制剂及JNK抑制剂组小鼠中Bax蛋白表达水平及AI较肺气肿组明显降低，说明抑制Rac1及JNK可减少促凋亡蛋白Bax的表达减轻肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡。

综上所述，本研究目前的结果表明，Rac1、JNK在CS及CSE诱导的肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡中有着重要的作用，且抑制Rac1可抑制JNK的磷酸化及其下游c-Jun蛋白的激活；另外抑制Rac1-JNK通路可减轻肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡，这可能与其减少促凋亡蛋白Bax的表达有关。然而，其他机制是否也参与调节香烟烟雾诱导的肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡，仍需要进一步研究。本研究的意义在于明确Rac1-JNK通路在肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡中的作用，抑制Rac1可能抑制JNK蛋白的磷酸化从而减轻肺气肿小鼠肺组织细胞凋亡，而肺气肿作为慢阻肺的主要病理特征，研究清楚肺气肿的发病机制，能进一步为慢阻肺的防治提供新的思路，寻找新的治疗分子靶点。

作者贡献度说明：

金晓迪：动物模型构建、数据统计分析、结果解释及文章撰写； 罗兰、郑远江、李珊珊：动物模型构建、指标检测；汪洋、钟娟：文章核对及数据统计分析；叶贤伟：论文设计、文章修改及资金支持。

所有作者声明不存在利益冲突。

参考文献

[1] 陈亚红. 2021年GOLD慢性阻塞性肺疾病诊断、治疗及预防全球策略解读［J］. 中国医学前沿杂志， 2021， 13（1）： 16-37.

[2] Chen Y. Interpretation of global strategy for the diagnosis， management， and prevention of chronic obstructive pulmonary disease 2021 report ［J］. Chin J Front Med Sci， 2021， 13（1）： 16-37.

[3] Guo Y， Bai J， Zhang X， et al. Secular trends of mortality and years of life lost due to chronic obstructive pulmonary disease in Wuhan， China from 2010 to 2019： Age-period-cohort analysis［J］. Int J Environ Res Public Health， 2022， 19（17）： 10685.

[4] Rao W， Wang S， Duleba M， et al. Regenerative metaplastic clones in COPD lung drive inflammation and fibrosis［J］. Cell， 2020， 181（4）： 848-864.e18.

[5] Kelly-Robinson GA， Reihill JA， Lundy FT， et al. The serpin superfamily and their role in the regulation and dysfunction of serine protease activity in COPD and other chronic lung diseases［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（12）： 6351.

[6] Boukhenouna S， Wilson MA， Bahmed K， et al. Reactive oxygen species in chronic obstructive pulmonary disease［J］. Oxid Med Cell Longev， 2018， 2018： 5730395.

[7] Kotlyarov S. Involvement of the innate immune system in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease［J］. Int J Mol Sci， 2022， 23（2）： 985.

[8] 罗丽娟， 陈燕. 肺气肿动物模型研究进展［J］. 结核与肺部疾病杂志， 2022， 3（1）： 60-64.

[9] Luo L， Chen Y. Research progress of animal models of emphysema［J］. J Tuberc Lung Dis， 2022， 3（1）： 60-64.

[10] Sun X， Feng X， Zheng D， et al. Ergosterol attenuates cigarette smoke extract-induced COPD by modulating inflammation， oxidative stress and apoptosis in vitro and in vivo ［J］. Clin Sci （Lond）， 2019， 133（13）： 1523-1536.

[11] Vij N， Chandramani-Shivalingappa P， Van Westphal C， et al. Cigarette smoke-induced autophagy impairment accelerates lung aging， COPD-emphysema exacerbations and pathogenesis［J］. Am J Physiol Cell Physiol， 2018， 314（1）： C73-C87.

[12] Pistritto G， Trisciuoglio D， Ceci C， et al. Apoptosis as anticancer mechanism： Function and dysfunction of its modulators and targeted therapeutic strategies［J］. Aging （Albany NY）， 2016， 8（4）： 603-619.

[13] Sauler M， Bazan IS， Lee PJ. Cell death in the lung： The apoptosis-necroptosis axis［J］. Annu Rev Physiol， 2019， 81： 375-402.

[14] Liang J， Oyang L， Rao S， et al. Rac1， A potential target for tumor therapy［J］. Front Oncol， 2021， 11： 674426.

[15] Su X， Wu W， Zhu Z， et al. The effects of epithelial-mesenchymal transitions in COPD induced by cigarette smoke： An update［J］. Respir Res， 2022， 23（1）： 225.

[16] Shen H， Sun Y， Zhang S， et al. Cigarette smoke-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition is mediated by Rac1 activation［J］. Biochim Biophys Acta， 2014， 1840（6）： 1838-1849.

[17] Zheng C， Wu X， Zeng R， et al. Computational prediction of hot spots and binding site of inhibitor NSC23766 on Rac1 binding with tiam1［J］. Front Chem， 2021， 8： 625437.

[18] Yang R， Zhao G， Yan B. Discovery of novel c-Jun N-terminal kinase 1 inhibitors from natural products： Integrating artificial intelligence with structure-based virtual screening and biological evaluation［J］. Molecules， 2022， 27（19）： 6249.

[19] Yue J， López JM. Understanding MAPK signaling pathways in apoptosis［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（7）： 2346.

[20] Zhang F， Lu W， Yuan W， et al. Regulation of c-Jun N-terminal protein kinase （JNK） pathway in apoptosis of endothelial outgrowth cells induced by asymmetric dimethylarginine［J］. Med Sci Monit， 2017， 23： 2535-2542.

[21] Ying C， Dai J， Fan G， et al. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 combining with the mixed lineage kinase 3- mitogen-activated protein kinase 7- c-Jun N-terminal kinase signaling module accelerates diabetic nephropathy［J］. Front Physiol， 2021， 12： 679166.

[22] He S， Li L， Sun S， et al. A novel murine chronic obstructive pulmonary disease model and the pathogenic role of MicroRNA-21［J］. Front Physiol， 2018， 9： 503.

[23] 姜友军. PDK1对COPD小鼠气道上皮细胞PI3K-AKT信号通路以及p16和LC3B蛋白的影响［D］. 贵阳： 贵州医科大学， 2021.

[24] Jiang Y. Effects of PDK1 on the PI3K-AKT signal pathway and p16 and LC3B proteins in airway epithelial cells of COPD mice［D］. Guiyang： Guizhou Medical University， 2021.

[25] Veluthakal R， Sidarala V， Kowluru A. NSC23766， a known inhibitor of Tiam1-Rac1 signaling module， prevents the onset of type 1 diabetes in the NOD mouse model［J］. Cell Physiol Biochem， 2016， 39（2）： 760-767.

[26] Wang Q， Wang J， Hu M， et al. Uncoupling protein 2 increases susceptibility to lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice［J］. Mediators Inflamm， 2016， 2016： 9154230.

[27] Knudsen L， Weibel ER， Gundersen HJ， et al. Assessment of air space size characteristics by intercept （chord） measurement： An accurate and efficient stereological approach［J］. J Appl Physiol （1985）， 2010， 108（2）： 412-421.

[28] 宋健， 邓爱兵， 王静， 等. 丹参酮ⅡA对慢性阻塞性肺疾病伴呼吸衰竭患者JNK通路的作用机制分析［J］. 临床和实验医学杂志， 2021， 20（15）： 1613-1617.

[29] Song J， Deng A， Wang J， et al. A Mechanism of tanshinone ⅡA on patients with chronic obstructive pulmonary disease ［J］. J Clin Exp Med， 2021， 20（15）： 1613-1617.

[30] 马丽， 张璐， 张程， 等. 抗血管内皮细胞抗体在吸烟肺气肿大鼠肺泡隔细胞凋亡中的作用及甲泼尼龙的干预效果［J］. 广东医学， 2016， 37（10）： 1447-1450.

[31] Ma L， Zhang L， Zhang C， et al. The role of anti-endothelial cell antibodies in the apoptosis of alveolar septal cells in smoking-induced emphysema rats and the intervention effect of methylprednisolone［J］. Guangdong Med J， 2016， 37（10）： 1447-1450.

[32] Ferrera MC， Labaki WW， Han MK. Advances in chronic obstructive pulmonary disease［J］. Annu Rev Med， 2021， 72： 119-134.

[33] Kotelevets L， Chastre E. Rac1 signaling： From intestinal homeostasis to colorectal cancer metastasis［J］. Cancers （Basel）， 2020， 12（3）： 665.

[34] Marei H， Malliri A. Rac1 in human diseases： The therapeutic potential of targeting Rac1 signaling regulatory mechanisms［J］. Small GTPases， 2017， 8（3）：139-163.

[35] Verma SK， Lal H， Golden HB， et al. Rac1 and RhoA differentially regulate angiotensinogen gene expression in stretched cardiac fibroblasts［J］. Cardiovasc Res， 2011， 90（1）： 88-96.

[36] Li C， Li Y， Li Y， et al. MicroRNA-194-5p attenuates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in H9C2 cardiomyocytes by inhibiting the over-activation of RAC1 protein［J］. Mol Med Rep， 2023， 27（2）： 33.

[37] Lu W， Lin J， Zheng D， et al. Overexpression of MicroRNA-133a inhibits apoptosis and autophagy in a cell model of Parkinson’s Disease by downregulating Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 （RAC1）［J］. Med Sci Monit， 2020， 28： e938747.

[38] Chen L， Luo L， Kang N， et al. The protective effect of HBO1 on cigarette smoke extract-induced apoptosis in airway epithelial cells［J］. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis， 2020， 15： 15-24.

[39] Jiang J， Zhang S， Shen H， et al. Rac1 signaling regulates cigarette smoke-induced inflammation in the lung via the Erk1/2 MAPK and STAT3 pathways［J］. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis， 2017， 1863（7）： 1778-1788.

[40] Terakado M， Gon Y， Sekiyama A， et al. The Rac1/JNK pathway is critical for EGFR-dependent barrier formation in human airway epithelial cells［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2011， 300（1）： L56-L63.

[41] Zhao J， Jie Q， Li G， et al. Rac1 promotes the survival of H9c2 cells during serum deficiency targeting JNK/c-JUN/Cyclin-D1 and AKT2/MCL1 pathways［J］. Int J Med Sci， 2018， 15（10）： 1062-1071.

[42] Hao D， Li Y， Shi J， et al. Baicalin alleviates chronic obstructive pulmonary disease through regulation of HSP72-mediated JNK pathway［J］. Mol Med， 2021， 27（1）： 53.

[43] Murata K， Fujita N， Takahashi R. Ninjinyoeito ameliorated cigarette smoke extract-induced apoptosis and inflammation through JNK signaling inhibition in human lung fibroblasts［J］. BMC Complement Med Ther， 2022， 22（1）： 96.

[44] Jin S， Ray RM， Johnson LR. Rac1 mediates intestinal epithelial cell apoptosis via JNK［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2006， 291（6）： G1137- G1147.

[45] Blatt NB， Boitano AE， Lyssiotis CA， et al. Bz-423 superoxide signals apoptosis via selective activation of JNK， Bak， and Bax［J］. Free Radic Biol Med， 2008， 45（9）： 1232-1242.

基金资助

中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2019PT320003)