利福平通过NRF2/NQO1通路对小鼠肝细胞造成氧化损伤

Oxidative damage to mouse liver cells caused by rifampicin through the NRF2/NQO1 pathway

摘要

目的 探究利福平（Rifampicin，RFP）调节NRF2/NQO1通路对小鼠肝细胞AML12造成的影响。 方法 培养正常的小鼠肝细胞系AML12。采用不同浓度的利福平对细胞进行染毒，CCK8法检测细胞活力，根据结果选取适用于本研究的染毒浓度（50、100、200 µmol/L）。采用微孔板法检测AML12细胞内过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活力以及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量；采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量以及通过检测JC-1荧光探针分析线粒体内膜电位变化；采用qRT-PCR方法测定NQO1、SOD、NRF2基因的mRNA表达水平，Western Blot 法检测NRF2、NQO1的蛋白表达水平。 结果 随着利福平染毒浓度的升高，AML12细胞活力也随之减少。与对照组相比，利福平染毒处理组中AML12细胞的MDA含量、CAT活力、ROS水平均升高，且随着染毒浓度的增加线粒体膜电位也随之升高，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，SOD活性以及NQO1、SOD、NRF2三个基因的mRNA表达水平随利福平染毒浓度上升有所降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。NQO1、NRF2的蛋白表达水平随利福平染毒浓度上升降低。 结论 利福平可能通过NRF2/NQO1通路调节ROS对小鼠肝细胞AML12造成氧化损伤，且具有浓度依赖性。

Abstract

Objective To explore the effect of rifampicin regulating NRF2/NQO1 pathway on AML12 in mouse hepatocytes. Methods Normal mouse liver cell line AML12 cells were cultured in this study. The cells were treated with various concentrations of rifampicin， and cell viability was assessed by CCK8 method. Based on the CCK8 results， suitable concentration of rifampicin were determined to be 50， 100 and 200 µmol/L. The activity of catalase， superoxide dismutase （SOD） and the levels of malondialdehyde were detected using the microporous plate method. The levels of intracellular reactive oxygen species and the mitochondrial membrane potential were assessed by DCFH-DA and JC-1 fluorescence probe respectively using flow cytometry. The mRNA expression levels of NQO1， SOD and NRF2 genes were determined by qRT-PCR， and the protein expression levels of NRF2 and NQO1 were detected by Western Blot. Results The activity of AML12 cells decreased with the increase of rifampicin concentration. Compared with the control group， the malondialdehyde content， catalase activity and reactive oxygen species levels of AML12 cells were increased in treated groups， as well as the mitochondrial membrane potential（P<0.05）. The SOD activity and the mRNA expression levels of NQO1， SOD and NRF2 genes all demonstrated a significant decrease in response to increasing concentrations of Rifampicin （P<0.05）. Consequently， the expression levels of NQO1 and NRF2 exhibited a similar trend. Conclusion Rifampicin can cause oxidative damages through NRF2/NQO1 pathway by a concentration-dependent manner in mouse hepatocyte AML12 cell line.

Graphical abstract

关键词

利福平 / AML12细胞 / 氧化损伤

Key words

Rifampin / AML12 hepatocytes / Oxidative damage

截至2023年，结核病（Tuberculosis， TB）仍然是全球高死亡率和高发病率的主要疾病^［1］，其治疗方式以长期服药为主^［2］。抗结核的一线药物主要有利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和吡嗪酰胺等，该类药物的共同特点是治疗效果相对较好，但均需联合用药且服药周期长^［3，4］。利福平（Rifampicin，RFP）为利福霉素B衍生物，长期大剂量服用可引起严重肝损伤^［5］。有研究表明，异烟肼和利福平可通过产生NADPH氧化酶介导的氧化应激激活肝星状细胞，从而导致肝纤维化的发生发展^［6］。氧化应激是指活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量生成与抗氧化功能的失衡，常伴随着细胞凋亡与炎症反应的发生，是RFP引起肝损伤的重要机制之一^［7］。NRF2（NF-E2-related factor 2）是细胞内源性抗氧化应激的主要转录因子之一，在细胞受到刺激时可以结合到抗氧化基因的启动子区，启动抗氧化基因的表达。本研究旨在通过建立利福平对小鼠正常肝细胞系AML12细胞的损伤模型，探讨利福平通过NRF2信号通路对小鼠肝细胞氧化损伤的影响，为进一步研究利福平致肝损伤的机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

反转录试剂盒、qPCR SYBR Green Master Mix（翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号：11139ES60，11202ES08）；过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A007-1-1、A001-3-2）；丙二醛（MDA）检测试剂盒、JC-1染料、DCFH-DA 荧光探针（上海碧云天生物技术有限公司，货号：S0131S，C2005、SOO3S）；利福平（RFP）（成都锦华药业有限责任公司，货号：R0079）；NRF2、β-actin（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：80593-1-RR、 66009-1-Ig）；NQO1（生工生物工程（上海）股份有限公司，货号：D261049-0025）。多功能酶标仪（Molecular Devices公司，型号：M5）；流式细胞仪，（贝克曼库尔特公司，型号：CytoFLEX）；凝胶成像系统（Azure Biosystems 公司，型号：C500）；荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific Inc公司， 型号：ABI step one plus）。

1.2 AML12细胞培养

AML12细胞（购自上海和元生物），用含有10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基在37 ℃、5% CO₂的条件下进行培养。

1.3 CCK8检测药物最适浓度

在96孔板中接种细胞（2×10³个/孔），设置空白组和对照组，设计染毒组分别为25、50、100、200、300、400 µmol/L，每组平行3个复孔，37 ℃，5% CO₂条件下培养24 h后，每孔加10 μL的CCK8溶液，继续培养2 h。培养结束后，在450 nm波长处测量OD值。计算细胞存活率，挑选细胞活力在80%左右的三个浓度用于后续细胞染毒。

1.4 SOD和CAT活力与MDA含量检测

染毒24 h后收获细胞，按照试剂盒说明书进行操作。对SOD和CAT活力，以及MDA含量进行测定，采用BCA试剂盒对AML12蛋白样品进行浓度测定，最终计算单位蛋白浓度内SOD和CAT活力，以及MDA的含量。

1.5 流式细胞术检测ROS水平以及线粒体膜电位

将AML12细胞接种在六孔板中，用不同浓度的利福平溶液染毒处理24 h后，使用不含Ca²⁺的胰酶消化细胞，将细胞转移至离心管中，使用PBS洗涤细胞1次。在细胞沉淀中加入1 mL无血清培养基配置的DCFH-DA染料工作液重悬细胞，放入培养箱中37 ℃避光孵育30 min，再用无血清培养基清洗细胞1次。采用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

同样方法获得各组细胞沉淀中加入1 mL的JC-1染色工作液，反复颠倒混匀，37 ℃烘箱中孵育20 min后，离心（1 000 r/min，3 min）弃上清液，加500 μL无血清培养基重悬细胞，采用流式细胞仪，记录线粒体膜电位变化，荧光颜色向绿色的转变代表膜电位的降低。

1.6 qRT‑PCR检测相关基因mRNA的表达水平

采用TRIzol法提取总RNA，采用试剂盒对RNA进行反转录，放入-20 ℃保存待用。以磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）作为内参基因，设计引物序列，见表1。配置20 μL PCR反应体系：MIX 10 μL，cDNA 1 μL，DEPC水8 μL，上下游引物各0.5 μL。反应条件：变性95 ℃ 20 s→退火60 ℃ 20 s→延伸70 ℃ 20 s，40个循环。

1.7 Western blot检测蛋白含量

对细胞用不同浓度利福平处理24 h后，提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。配置10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转印到PVDF膜上，牛奶封闭，孵育一抗（1∶5 000），过夜洗脱再孵育二抗（1∶10 000），显影，采用Image J软件测定条带的灰度值。

1.8 统计学处理

实验数据采用SPSS23.0软件进行统计分析，采用GraphPad8进行统计绘图工作，多组间均数的比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用最小显著性差异法（LSD）；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 利福平对AML12细胞中氧化应激指标的影响

与0 µmol/L组相比，利福平染毒处理组中氧化指标MDA含量以及CAT活力均随着利福平浓度的增大而升高，SOD的活力则随着利福平浓度的增大而降低，与各自对照组相比均具有统计学差异（除MDA的50 μmol/L以外）。见表2及图1。

2.2 利福平对于AML12细胞中ROS的影响

采用流式细胞术对不同浓度的利福平处理组进行ROS水平的检测。见图2，与对照组相比，各利福平染毒处理组，ROS水平明显上升。

2.3 利福平促进AML12细胞发生凋亡

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。本研究采用JC-1技术检测各组线粒体膜电位水平的变化。见图3，横坐标代表绿色荧光信号通道，纵坐标代表红色荧光信号通道，绿色荧光信号强度增加，表示线粒体膜电位降低。Q1-LR表示的是AML12细胞中早期凋亡的细胞。实验结果显示，随着利福平染毒浓度的不断增大，右下象限所占比例越大，处于细胞凋亡早期的细胞数量越多。

2.4 利福平降低AML12细胞中NQO1、NRF2和SODmRNA水平的表达水平

NQO1、NRF2和SOD基因都是AML12细胞内调控氧化应激反应的重要基因。见表3和图4，不同浓度的利福平对AML12细胞处理后，相关基因的表达NQO1，NRF2，SOD基因都有不同程度的降低。

2.5 利福平降低AML12细胞中NQO1、NRF2蛋白的表达水平

不同浓度的利福平对AML12细胞处理后，相关蛋白的表达水平不同程度的降低。见图5，NQO1和NRF2的蛋白表达水平随着利福平浓度的升高而降低。

3 讨论

氧化应激与急性肝损伤和常见的感染性或代谢性慢性肝病的发病机制有关，如乙型或丙型病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。此外，氧化应激与肝脏疾病的研究进展在肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）中起着至关重要的作用^［8］。利福平也被证明与患者和其他实验动物模型的肝炎和肝功能异常有关^［9］。蔡轶等^［10］实验采用大鼠模型证明氧化应激参与了利福平导致的大鼠肝损伤适应性现象，且RFP等大多数抗结核药物属于浓度依赖性药物^［11］。有研究发现，RFP剂量效应表现为：在一定范围内，剂量增加可以提高血药浓度，增强抗菌效果，然而，过高的剂量可能导致药物不良反应的发生率增加^［12］。例如，大剂量间歇疗法后可能出现流感样症候群、肝毒性、血小板减少症等。本研究通过对小鼠正常肝细胞AML12进行不同浓度利福平处理24 h后，无论是MDA含量、CAT活力的升高还是SOD活力的下降以及其它检测指标，均是随着浓度的变化而变化，因此，在临床使用利福平时，应根据疾病的种类选择适合的剂量，并在医生的指导下进行用药。

肝脏凭借其强大的代谢和解毒功能，是ROS产生的重要场所^［8］。研究表明，当肝细胞受到氧化应激损伤时，ROS超载导致线粒体通透性转换孔打开，致使线粒体功能障碍和膜电位丧失，进而引发氧化损伤、肝细胞凋亡和坏死，影响肝组织结构和正常功能^［13］。本研究发现利福平能够诱导小鼠AML12细胞发生氧化应激损伤，其ROS水平在利福平处理24 h后具有明显的上升。此外本研究还对线粒体膜电位进行了检测，结果显示随着染毒浓度增加线粒体膜电位降低，表明细胞经处理后发生了凋亡的现象。

NRF2作为氧化剂抵抗的主要调节因子，与一系列与氧化应激相关的毒性和慢性疾病有关。此外，NRF2能够控制ROS消除酶的基因表达，对ROS的产生也具有一定的调节作用。在应激反应中，NRF2诱导参与抗氧化防御和解毒的靶基因表达^［14］。HO-1和NQO1是控制氧化应激和对抗某些毒素的关键酶。Yang等^［15］研究证明PIM1能够通过调节NRF2/HO-1/NQO1信号通路减轻高脂饮食诱导的小鼠肝脏氧化应激和NAFLD。当细胞受到氧化压力时，可能会触发复杂的信号通路，导致NRF2和NOQ1等相关蛋白的表达水平发生变化。本研究中NRF2、NQO1的mRNA以及蛋白表达水平均随着染毒浓度的增加而降低，这提示利福平在肝细胞内的代谢，很可能促进细胞ROS产生增多，同时破坏了NRF2抗氧化系统，进而造成了细胞损伤。

综上所述，利福平在治疗结核病时，若长期服用可能会通过氧化应激造成一定的肝损伤，且浓度越大危害会越大，然而，对于利福平对肝损伤造成影响的通路机制仍需进一步研究，为临床治疗提供更多的科学依据。

作者贡献度说明：

李亚奇：主要实验实施及文章撰写；郑志坚、张美诗、符王洋：文献收集、部分实验及数据整理；孟春燕、钱庆增：课题的构思与论文指导与修改、经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

河北省高等学校基本科研业务费(JQN2021032)