柴胡皂苷D调节cGAS‑STING信号通路改善重症急性胰腺炎大鼠肠损伤

Saikosaponin D modulates cGAS‑STING signaling pathway to improve intestinal injury in rats with severe acute pancreatitis

摘要

目的 探讨柴胡皂苷D（SSD）调节环磷酸鸟苷‑腺苷酸合成酶（cGAS）‑干扰素基因刺激因子（STING）信号通路对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠损伤的影响。 方法 建立SAP大鼠模型，造模成功的SAP大鼠随机分为模型组、SSD低剂量组（12.5 mg/kg）、SSD中剂量组（25 mg/kg）、SSD高剂量组（50 mg/kg）、阳性药物组（2×10⁴ U/kg的乌司他丁）、SSD高剂量+cGAS过表达组（50 mg/kg的SSD+100 μL的cGAS重组质粒pcDNA3.1载体），每组12只。另取12只大鼠设为假手术组。各组给予相应药物干预7 d，1次/d。全自动生化分析仪检测血清中脂肪酶、淀粉酶水平；酶联免疫吸附法检测回肠组织中白细胞介素（IL）‑6、IL‑1β、肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）水平；苏木素‑伊红染色检测胰腺组织和回肠组织病理变化；TUNEL染色检测回肠组织中细胞凋亡；蛋白印迹法检测回肠组织中闭合蛋白（Occludin）、闭锁小带蛋白‑1（ZO‑1）、cGAS、STING蛋白表达。 结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清脂肪酶、淀粉酶、回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、胰腺、回肠组织病理评分、回肠组织中细胞凋亡率、cGAS、STING蛋白表达显著升高，Occludin、ZO‑1蛋白表达显著降低（P<0.05）；与模型组比较，SSD低、中、高剂量组大鼠血清脂肪酶、淀粉酶、回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、胰腺、回肠组织病理评分、回肠组织中细胞凋亡率、cGAS、STING蛋白表达呈剂量依赖性降低，Occludin、ZO‑1蛋白表达呈剂量依赖性升高（P<0.05）；cGAS过表达可减弱高剂量SSD对SAP大鼠上述指标的作用效果（P<0.05）。 结论 SSD可能通过抑制cGAS‑STING信号通路，减轻回肠组织炎症反应和细胞凋亡，改善SAP大鼠肠损伤。

Abstract

Objective To investigate the impacts of saikosaponin D （SSD） on intestinal injury in rats with severe acute pancreatitis （SAP） by regulating the cyclic GMP‑AMP synthase （cGAS）‑stimulator of interferon gene （STING） signaling pathway. Methods SAP rat model was established.And randomly divided into the model group，the SSD low dose group （12.5 mg/kg），the SSD medium dose group （25 mg/kg），the SSD high dose group （50 mg/kg），the positive drug group （2×10⁴ U/kg ulinastatin）， and the SSD high dose+cGAS overexpression group （50 mg/kg SSD+100 μL cGAS recombinant plasmid pcDNA3.1 vector）， with 12 mice per group. Another 12 rats were selected as the sham operation group. Each group was given corresponding drug intervention for 7 days， once a day. The levels of serum lipase and amylase were detected by automatic biochemical analyzer； ileal tissue interleukin （IL）‑6， IL‑1β and tumor necrosis factor‑α （TNF‑α） levels were detected by enzyme‑linked immunosorbent assay； the pathological changes of pancreatic and ileal tissue were detected by hematoxylin‑eosin staining； TUNEL staining was used to detect apoptosis in ileal tissue； Western blot detected the expression of Occludin， zonula occludens‑1 （ZO‑1）， cGAS and STING in ileal tissue. Results Compared with the sham operation group， the serum lipase， amylase， ileal tissue IL‑6， IL‑1β， TNF‑α， pathological scores of pancreas and ileal tissue， apoptosis rate of cells in ileal tissue， cGAS and STING protein expression in the model group were significantly increased，and the expressions of Occludin and ZO‑1 protein were significantly decreased （P<0.05）. Compared with model group， the serum lipase， amylase， ileal tissue IL‑6， IL‑1β， TNF‑α， pathological scores of pancreas and ileal tissue， apoptosis rate of cells in ileal tissue，and cGAS and STING protein expression in ileal tissue of rats in SSD low， medium， high dose groups were decreased in a dose‑dependent manner，and the expression of Occludin and ZO‑1 protein were increased in a dose‑dependent manner （P<0.05）. Overexpression of cGAS can reduce the effect of high dose SSD on the above indexes in SAP rats （P<0.05）. Conclusion SSD may inhibit cGAS‑STING signaling pathway， reduce ileal tissue inflammatory response and cell apoptosis， and improve intestinal injury in SAP rats.

Graphical abstract

关键词

柴胡皂苷D / 重症急性胰腺炎 / 环磷酸鸟苷‑腺苷酸合成酶 / 干扰素基因刺激因子 / 肠损伤

Key words

Saikosaponin D / Severe acute pancreatitis / Cyclic GMP‑AMP synthase / Stimulator of interferon gene / Intestinal injury

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种伴有全身炎症反应并可损害其他器官或系统功能的严重危及生命的疾病^［1］。 肠道是SAP损伤的重要器官，肠损伤也可加重SAP^［2］。SAP过程中肠损伤可能与炎症介质过度释放、肠上皮细胞凋亡等因素有关^［3，4］。尽管SAP的治疗有了很大进展，但SAP患者的死亡率仍然居高不下^［5］。因此，开发新的药物来改善SAP过程中的肠损伤具有重要意义。柴胡皂苷D（saikosaponin D，SSD）是从柴胡中分离得到的活性成分，具有抗炎、抗肿瘤和抗病毒作用^［6］。已有研究报道，SSD可通过抑制腺泡细胞凋亡来减轻胰腺损伤^［7］。SSD对胰腺有保护作用。前期研究显示，抑制环磷酸鸟苷‑腺苷酸合成酶（cyclic GMP‑AMP synthase，cGAS）‑干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）信号通路可改善非酒精性脂肪性胰腺炎大鼠炎症反应^［8］。有报道发现，cGAS‑STING信号传导的失活是缺血/再灌注诱导的肠损伤的治疗靶点^［9］。但SSD能否通过调控cGAS‑STING信号通路改善SAP大鼠肠损伤尚不清楚。故本研究分析SSD对SAP过程中肠损伤的改善效果及机制，为治疗SAP肠损伤的新药探索提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

从广州赛业百沐生物科技有限公司［生产许可证号SCXK（粤）2020‑0055］购进雄性SD大鼠（SPF级，体质量为335~354 g，10周龄）。饲养于25 ℃左右的动物房中，自由饮食及饮水。本研究获得遵义市第一人民医院伦理委员会的批准（批准号：基础L‑2023‑039）。

1.1.2 药物

柴胡皂苷D（原料药，纯度>98.75%，批号P872‑14‑5）购自北京普非生物科技公司；乌司他丁注射液（批号20230414）购自广东天普生化医药公司。

1.1.3 试剂与仪器

电化学发光（ECL）试剂（批号P604‑3）均购自北京普非生物科技公司；牛磺胆酸钠（批号JG19173）、大鼠白细胞介素IL‑6（批号JG30511）、IL‑1β（批号JG31483）、肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）（批号JG40152）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、苏木素‑伊红（H＆E）染液（批号JG19162）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（批号JG16527）均购自上海吉至生化科技有限公司；cGAS重组质粒pcDNA3.1载体由武汉华美生物工程公司合成；兔源闭合蛋白（Occludin）（批号ab4016）、闭锁小带蛋白‑1（ZO‑1）（批号ab1925）、cGAS（批号ab2371）、STING（批号ab2469）、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）（批号ab1006）多克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（批号ab2874）均购自英国Abcam公司；全自动生化分析仪（型号ADVIA1800）、荧光显微镜（型号ZLDF‑KY2）均购自温州欧斯达康生物科技公司；酶标仪（型号ACT‑AMPR750）、蛋白成像系统（型号FluorChem FC3）均购自嘉德信国际有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SAP大鼠模型的构建

参考文献［10］中的方法进行造模：将大鼠在造模前12 h禁食不禁水，2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，去腹毛，消毒后在腹部切口，找到胰胆管和肝门部肝总管，夹闭肝门位置的小动脉，在十二指肠与壶腹部交汇处用注射针头穿刺胰胆管，插入深度约0.5 cm，缓慢注入5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg），5 min后出现胰腺充血、水肿，胰胆管扩张即表示SAP大鼠造模成功^［10］。去掉动脉夹，肠管复位，关腹。

1.2.2 动物分组及给药处理

72只SAP模型大鼠随机分成模型组、SSD低剂量组（12.5 mg/kg）、SSD中剂量组（25 mg/kg）、SSD高剂量组（50 mg/kg）^［11］、阳性药物组（2×10⁴ U/kg的乌司他丁）^［12］、SSD高剂量+cGAS过表达组（50 mg/kg的SSD+100 μL的cGAS重组质粒pcDNA3.1载体），每组12只。另取12只大鼠不注射牛磺胆酸钠，其余操作同造模过程设为假手术组。SSD低剂量组、SSD中剂量组、SSD高剂量组大鼠分别腹腔注射12.5、25、50 mg/kg的SSD^［11］（注射体积10 mL/kg浓度分别为1.25、2.5、5 mg/mL的SSD生理盐水药液）；阳性药物组大鼠腹腔注射2×10⁴ U/kg的乌司他丁^［12］（注射体积10 mL/kg浓度为2×10³ U/mL的乌司他丁生理盐水药液）；SSD高剂量+cGAS过表达组大鼠腹腔注射50 mg/kg的SSD以及尾静脉注射100 μL的cGAS重组质粒pcDNA3.1载体^［13］；假手术组、模型组大鼠腹腔注射10 mL/kg生理盐水。给药1次/d，连续7 d。

1.2.3 标本收集

末次给药结束后24 h，每组选取全部大鼠，2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血，经离心（3 900 r/min，8 min）得血清用于脂肪酶、淀粉酶水平的检测。血清收集完成后，处死大鼠，收集大鼠胰腺组织和回肠组织，所有胰腺组织用于H＆E染色；回肠组织分为两部分（每部分6只大鼠的回肠组织），一部分置于4%多聚甲醛用于H＆E、TUNEL染色，另一部分储存在液氮中用于IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平的检测和蛋白印迹实验。

1.2.4 血清中脂肪酶、淀粉酶水平的检测

利用全自动生化分析仪检测血清脂肪酶、淀粉酶水平。

1.2.5 ELISA法检测回肠组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平

解冻回肠组织，将其匀浆化，取部分回肠组织，离心（3 900 r/min，8 min）取上清，ELISA法检测上清IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平。

1.2.6 H＆E染色检测胰腺组织和回肠组织病理变化

将包埋在石蜡中的胰腺、回肠组织样本切成5 μm厚的切片。随后，将组织切片脱石蜡、再水化，并用H＆E染色以进行组织学检查。参照文献［14］进行胰腺组织（Schmidt评价标准，为0~16分，得分越高病理损伤越严重）、回肠组织（Chiu评价标准，为0~5分，得分越高病理损伤越严重）病理评分。

1.2.7 TUNEL染色检测回肠组织中细胞凋亡

取1.2.6中的回肠组织切片，脱石蜡并在37 °C下用蛋白酶K处理30 min。PBS洗涤2次后，加入TUNEL检测液孵育1 h。然后，将切片在DAPI溶液中避光放置10 min。通过荧光显微镜捕获凋亡细胞（绿色荧光），并计算细胞凋亡率（视野中凋亡细胞数/视野中总细胞数×100%）。

1.2.8 蛋白印迹法检测回肠组织中Occludin、ZO‑1、cGAS、STING蛋白表达

使用RIPA裂解缓冲液提取大鼠回肠组织匀浆液中总蛋白。将蛋白进行定量、电泳、转膜、封闭后，加入兔源一抗Occludin（1∶1 280）、ZO‑1（1∶1 090）、cGAS（1∶2 100）、STING（1∶2 100）、GAPDH（1∶2 450）在4 ℃孵育过夜，继续添加羊抗兔二抗（1∶3 100）进行3 h的孵育，蛋白印迹采用ECL试剂显色，ImageJ软件定量蛋白印迹灰度值。

1.3 统计学处理

使用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，符合正态分布且方差齐性的数据表示为均数±标准差（\overline{x}\pm s），单因素方差分析用于多组间的差异比较，进一步两两比较采用SNK‑q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SSD对SAP大鼠血清脂肪酶、淀粉酶水平的影响

模型组血清脂肪酶、淀粉酶较假手术组显著升高（P<0.05）；SSD低、中、高剂量组血清脂肪酶、淀粉酶较模型组呈剂量依赖性降低（P<0.05）；SSD高剂量组血清脂肪酶、淀粉酶与阳性药物组差异无统计学意义（P>0.05）；SSD高剂量+cGAS过表达组血清脂肪酶、淀粉酶较SSD高剂量组显著升高（P<0.05）。见表1。

2.2 SSD对SAP大鼠回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平的影响

模型组回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α较假手术组显著升高（P<0.05）；SSD低、中、高剂量组回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α较模型组呈剂量依赖性降低（P<0.05）；SSD高剂量组回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α与阳性药物组差异无统计学意义（P>0.05）；SSD高剂量+cGAS过表达组回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α较SSD高剂量组显著升高（P<0.05）。见表2。

2.3 SSD对SAP大鼠胰腺组织、回肠组织病理变化的影响

胰腺组织、回肠组织HE染色结果显示：假手术组大鼠胰腺腺泡的结构和形态正常，回肠肠黏膜无明显炎症细胞浸润现象；模型组大鼠胰腺腺泡的正常结构和形态被完全破坏，大量胰腺腺泡细胞坏死和炎性细胞浸润，回肠肠黏膜炎症细胞浸润明显增多；SSD低剂量组、SSD中剂量组、SSD高剂量组大鼠胰腺腺泡结构和形态逐渐恢复，胰腺腺泡细胞坏死和炎性细胞浸润逐渐减少，回肠肠黏膜炎症细胞浸润逐渐减轻；SSD高剂量组和阳性药物组大鼠胰腺组织和回肠组织病理变化相近；SSD高剂量+cGAS过表达组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤较SSD高剂量组加重。模型组胰腺、回肠组织病理评分较假手术组显著升高（P<0.05）；SSD低、中、高剂量组胰腺、回肠组织病理评分较模型组呈剂量依赖性降低（P<0.05）；SSD高剂量组胰腺、回肠组织病理评分与阳性药物组差异无统计学意义（P>0.05）；SSD高剂量+cGAS过表达组胰腺、回肠组织病理评分较SSD高剂量组显著升高（P<0.05）。见图1、2、表3。

表3 各组大鼠胰腺组织、回肠组织病理评分比较（分，\overline{x}\pm s）

2.4 SSD对SAP大鼠回肠组织细胞凋亡的影响

假手术组、模型组、SSD低剂量组、SSD中剂量组、SSD高剂量组、阳性药物组、SSD高剂量+cGAS过表达组大鼠回肠组织中细胞凋亡率分别为（3.25±0.41）%、（18.83±2.52）%、（15.51±2.44）%、（11.75±1.91）%、（7.06±1.26）%、（7.01±1.24）%、（13.34±2.33）%。模型组回肠组织细胞凋亡率较假手术组显著升高（P<0.05）；SSD低、中、高剂量组回肠组织细胞凋亡率较模型组呈剂量依赖性降低（P<0.05）；SSD高剂量组回肠组织细胞凋亡率与阳性药物组差异无统计学意义（P>0.05）；SSD高剂量+cGAS过表达组回肠组织细胞凋亡率较SSD高剂量组显著升高（P<0.05）。见图3。

2.5 SSD对SAP大鼠回肠组织Occludin、ZO‑1蛋白及cGAS‑STING信号通路相关蛋白表达的影响

模型组回肠组织Occludin、ZO‑1蛋白表达较假手术组显著降低，cGAS、STING蛋白表达较假手术组显著升高（P<0.05）；SSD低、中、高剂量组回肠组织Occludin、ZO‑1蛋白表达较模型组呈剂量依赖性升高，cGAS、STING蛋白表达较模型组呈剂量依赖性降低（P<0.05）；SSD高剂量组回肠组织Occludin、ZO‑1、cGAS、STING蛋白表达与阳性药物组差异无统计学意义（P>0.05）；SSD高剂量+cGAS过表达组回肠组织Occludin、ZO‑1蛋白表达较SSD高剂量组显著降低，cGAS、STING蛋白表达较SSD高剂量组显著升高（P<0.05）。见图4、表4。

3 讨论

SAP是一种潜在的致命疾病，具有相当高的发病率和死亡率。常伴有全身炎症反应综合征、败血症和器官功能障碍^［15］。肠道是SAP过程中受损的远程器官之一。它不仅是SAP的“受害者”，还进一步促进了病情的恶化^［16］。脂肪酶、淀粉酶是由胰腺分泌的，其水平可反映胰腺损伤程度^［17］；炎症被认为是SAP发展的标志，在应激条件下，浸润性炎症细胞通常通过释放促炎因子IL‑6、IL‑1β、TNF‑α来响应SAP刺激^［18］。本研究通过胰胆管注入5%牛磺胆酸钠的方式构建SAP大鼠模型，结果显示，与假手术组比较，模型组血清脂肪酶、淀粉酶、回肠组织IL‑6、IL‑1β、TNF‑α显著升高，胰腺组织病理损伤严重，提示SAP大鼠模型构建成功。紧密连接蛋白Occludin和ZO‑1是用于评估肠黏膜功能障碍的2种重要蛋白质，且细胞凋亡可能是炎症性疾病中肠屏障功能障碍的重要机制^［19］。本研究发现，与假手术组比较，模型组大鼠回肠组织病理评分、细胞凋亡率显著升高，Occludin、ZO‑1蛋白表达显著降低，表明5%牛磺胆酸钠诱导的SAP大鼠存在肠损伤。

SSD是中药柴胡中的活性成分，具有抗炎和免疫调节作用^［20］。据报道，SSD可减轻脓毒症小鼠模型中的肾脏炎症和细胞凋亡^［21］；SSD可改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎^［22］；SSD可抑制炎症小体活化，减轻了四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤，从而预防肝纤维化^［23］。本研究结果与他人研究^{［21‑23］}是一致的，本研究显示，SSD可呈剂量依赖性的改善SAP大鼠脂肪酶和淀粉酶分泌、炎症反应及胰腺和回肠病理损伤，抑制回肠组织中的细胞凋亡，促进Occludin、ZO‑1蛋白表达，进而减轻SAP大鼠肠损伤。提示SSD可能成为治疗SAP潜在的有效药物。

cGAS是一种炎症通路激活传感器，STING是cGAS的下游信号，当cGAS‑STING信号通路被激活时，Ⅰ型干扰素和其他炎症细胞因子的表达被诱导，并触发先天免疫反应^［24］。因此，加强对cGAS‑STING信号通路的调控，可能会为炎症性疾病的治疗提供一种新的方法。近期，多项研究表明cGAS‑STING信号通路与炎症性疾病的发生有关。Lu等^［25］研究显示，下调cGAS‑STING信号通路可减轻糖尿病心肌病小鼠心肌细胞自噬和炎症反应。Wu等^［26］报道发现，抑制cGAS‑STING通路可减轻小鼠免受辐射诱导的结肠组织炎症和损伤。本研究发现，SAP大鼠回肠组织中cGAS、STING蛋白表达较假手术组显著升高，表明cGAS、STING蛋白在SAP大鼠肠损伤中的重要促进作用，而SSD可呈剂量依赖性的抑制SAP大鼠回肠组织中cGAS、STING蛋白表达，推测SSD可能通过抑制cGAS‑STING信号通路改善SAP大鼠肠损伤。为了验证该推测，本研究在高剂量SSD作用的基础上采用cGAS重组质粒pcDNA3.1载体使cGAS过表达来干预SAP大鼠进行挽救实验，结果显示，cGAS过表达减弱了高剂量SSD对SAP大鼠回肠组织中cGAS、STING蛋白表达的抑制作用以及肠损伤的改善作用，证实了猜想的正确性，即SSD可能通过抑制cGAS‑STING信号通路改善SAP大鼠肠损伤。

综上所述，SSD可能通过抑制cGAS‑STING信号通路，减轻回肠组织炎症反应和细胞凋亡，改善SAP大鼠肠损伤，本研究为SSD治疗SAP提供了药物应用前景，也为SAP的靶向治疗提供了依据。但SSD对SAP大鼠肠损伤的改善作用可能还涉及其它通路，这将是后续研究的重点内容之一。

作者贡献度说明：

陈铮月：设计实验方案，论文写作和修改；邓晚秋：进行论文校审及指导；尹建军、刘微：实施实验过程，数据收集；温建立：数据整理，统计学分析。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwjkj2022‑1‑224)