周末勇士运动抑制炎症和铁死亡减轻β‑肾上腺素能超载诱导的心脏损伤

Weekend warrior exercise reduces β‑adrenergic overload induced cardiac injury by inhibition of inflammation and ferroptosis

摘要

目的 探讨周末勇士运动（weekend warrior exercise，WWE）对β‑肾上腺素能超载诱导心脏损伤的影响及可能机制。 方法 将小鼠随机分为对照组（Con组）、模型组［异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）组］和周末勇士运动组（WWE+ISO组）。周末训练持续4周后，采用颈部皮下注射ISO方法建立小鼠心脏损伤模型，3 d后，检测小鼠心脏质量指数（HMI）、血清中肌酸激酶同工酶（CK‑MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）浓度，HE染色和天狼星红染色观察心脏损伤和纤维化程度，TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况，定量PCR、Western blot和免疫荧光染色检测小鼠心脏纤维化和肥大相关基因的表达、炎症相关细胞因子水平以及铁死亡相关基因和蛋白的表达。 结果 与ISO组相比，WWE+ISO组HMI值、CK‑MB浓度显著降低（P<0.05），cTnI浓度呈现下降趋势（P>0.05）。与ISO组相比，WWE+ISO组心肌细胞排列较为整齐，炎性细胞浸润显著减少，心脏纤维化面积显著减少（P<0.01）。与ISO组相比，WWE+ISO组I型胶原（Col 1）、Ⅲ型胶原（Col 3）和心房利钠肽（Anp）的mRNA水平显著降低（P<0.05），TUNEL阳性细胞数量显著减少（P<0.05）。与ISO组比较，WWE+ISO组白介素6（IL‑6）、肿瘤坏死因子α（Tnf‑α）和IL‑1β的mRNA水平显著降低（P<0.05）。WWE+ISO组核因子E2相关因子2（Nrf2）的mRNA水平、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白表达均显著高于ISO组（P<0.05），WWE+ISO组血红素氧合酶1（HO‑1）的mRNA和蛋白表达均明显低于ISO组（P<0.05），WWE+ISO组HO‑1荧光阳性细胞数量显著低于ISO组（P<0.05）。 结论 周末勇士运动能够减轻β‑肾上腺素能超载诱导的心脏损伤，其机制可能与抑制心脏炎症和铁死亡有关。

Abstract

Objective To explore the effect and possible mechanism of weekend warrior exercise （WWE） on β‑adrenergic overload induced cardiac injury. Methods The mice were randomly divided into Con group， ISO group and WWE+ISO group. After 4‑weeks weekend training， the mouse cardiac injury model was established by subcutaneous injection of ISO into the neck. After 3 days， HMI， serum CK‑MB and cTnI concentration were measured. HE staining and Sirius red staining were used to observe the degree of cardiac injury and fibrosis. TUNEL staining was used to observe myocardial cell apoptosis. The qRT‑PCR， Western blot and immunofluorescence staining were used to detect the expression of genes related to cardiac fibrosis and hypertrophy， the levels of inflammation related cytokines and the expression of ferroptosis related genes and proteins in mice. Results Compared with ISO group， HMI value and CK‑MB concentration in WWE+ISO group significantly decreased （P<0.05）， and cTnI concentration showed a downward trend （P>0.05）. Compared with ISO group， WWE+ISO group had a more orderly arrangement of myocardial cells and a significant decrease in inflammatory cell infiltration. The area of cardiac fibrosis in WWE+ISO group was significantly lower than that in ISO group （P<0.01）. Compared with ISO group， the mRNA levels of Col 1， Col 3 and Anp in WWE+ISO group were significantly reduced （P<0.05）. The number of TUNEL positive cells in WWE+ISO group was significantly lower than that in ISO group （P<0.05）. Compared with ISO group， the mRNA levels of IL‑6， Tnf‑α and IL‑1β were significantly reduced in WWE+ISO group （P<0.05）. The mRNA levels of Nrf2 and GPX4 protein expression in WWE+ISO group were significantly higher than those in ISO group （P<0.05）， the mRNA and protein expression of HO‑1 in WWE+ISO group were significantly lower than those in ISO group （P<0.05）. The number of HO‑1 fluorescent positive cells in WWE+ISO group was significantly lower than that in ISO group （P<0.05）. Conclusion Weekend warrior exercise can reduce β‑adrenergic overload induced cardiac injury， the mechanism may be related to the inhibition of cardiac inflammation and ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

周末勇士运动 / 异丙肾上腺素 / 心脏损伤 / 炎症 / 铁死亡

Key words

WWE / ISO / cardiac injury / inflammation / ferroptosis

心血管疾病是威胁人类健康的头号危险因素，1990~2022年全球心血管病的疾病负担报告显示，2022年心血管疾病导致全球约1 980万人死亡^［1］。急性交感神经应激导致β‑肾上腺素能受体（β‑adrenergic receptor，β‑AR）过度激活是心脏疾病的重要病理因素^［2］。研究显示，运动可以改善心血管疾病患者的预后状态和结局，降低心血管疾病和恶性心血管事件发生的风险^{［3， 4］}。运动可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP‑activated protein kinase，AMPK）减轻β‑AR激动剂异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的心脏炎症^［5］。此外，运动通过调控白细胞介素10（interlukin‑10，IL‑10）/信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）/S100钙结合蛋白A9（S100A9）信号通路帮助心脏抵抗ISO诱导的心力衰竭^［6］。周末勇士运动（weekend warrior exercise，WWE）指的是每周通过1~2次集中运动训练就能满足一周目标运动量的一种运动方式。根据美国运动医学学会制定的体力活动指南，建议健康人群每周进行至少150分钟中等强度运动或至少75分钟高强度有氧运动以维持健康^［7］。研究显示，运动量和运动强度足够的前提下，WWE带来的心血管健康益处与每周内运动量分布均匀的人是相似的，风险下降幅度在17%~38%之间（包括房颤、心肌梗死、心力衰竭和卒中的风险）^［8］。运动流行病学研究数据已经表明WWE对心血管健康有益处并可以减少全因死亡率^［9‑11］。以往人们已经对规律运动方式产生的健康效应及机制有了较多的探索，然而，WWE是否可以保护心脏抵抗急性交感神经过度激活诱导的心脏损伤，目前尚未揭示。

ISO是一种非选择性β‑AR激动剂，常用于病理性心脏重塑动物模型的建模。研究显示，ISO可以诱导心脏组织促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）、IL‑6、IL‑18等增加从而促进病理性心脏肥大和纤维化重构^［12］。研究发现，ISO通过促进心肌细胞谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）降解以及促进血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO‑1）表达，引起心肌细胞铁死亡，导致心脏病理性重构和心力衰竭^［13］。据报道，中等强度的跑台运动通过干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）通路减轻了创伤性脑损伤诱导的神经细胞铁死亡和认知功能障碍^［14］。然而，运动是否可以通过调控铁死亡通路保护心脏抵抗β‑肾上腺素能过度激活诱导的心脏损伤尚未见报道。因此，本研究拟通过跑台运动构建一个周末勇士运动动物模型，结合急性ISO刺激，观察WWE模式是否可以通过调控心肌细胞炎症反应和铁死亡信号途径保护心脏抵抗β‑肾上腺素能过度激活诱导的心脏损伤，为WWE模式的心血管健康效应提供动物实验依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

ISO（美国Sigma‑Aldrich公司，溶剂为生理盐水）；蛋白酶K、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测液、强RIPA裂解液（上海碧云天公司）；抗荧光淬灭封片剂（美国Southern Biotech公司）；Trizol、增强型化学发光ECL（美国Thermo Fisher Scientific公司）；HiScript^R III RT SuperMix for qPCR试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞公司）；蛋白酶抑制剂（美国MCE公司）；磷酸酶抑制剂（瑞士罗氏公司）；BCA试剂盒（上海雅酶公司）；谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗体、HO‑1抗体、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗（英国abcam公司）；内参GAPDH、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠或抗兔IgG二抗（美国Proteintech公司）；改良型柠檬酸钠抗原修复液（中国biosharp公司）；即用型山羊血清（武汉博士德公司）。AU2700全自动生化分析仪（日本Olympus公司）；ACS‑180全自动化学发光仪（德国BAYER公司）；研磨匀浆机（美国OMNI公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；石蜡包埋机、切片机、捞片机、烘片机（德国Leica公司）；显微镜（德国Zeiss公司）；定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；酶标仪（瑞士Tecan公司）；电泳仪、转印仪（美国Bio‑Rad公司）；全自动化学发光图像分析仪（上海天能公司）。

1.2 实验动物与运动方案

6~8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠，体质量约16 g，购于江苏华创信诺医药科技有限公司［许可证号SCXK（苏）2020‑0009］。本实验经南京体育学院实验动物伦理委员会批准（G2RDW‑2021‑03）。小鼠饲养在江苏省农业科学院动物房［SYXK（苏）2020‑0024］，昼夜各半循环照明，湿度45%~55%，温度20 ℃~25 ℃，各组小鼠自由饮食饮水。小鼠随机分为对照组（Con组）、模型组（ISO组）和周末勇士运动组（WWE+ISO组），每组8只。所有小鼠适应性喂养1周，期间对WWE+ISO组小鼠进行10 m/min×10 min、1次/d、连续5 d的跑台适应性训练。第2周开始正式训练，13 m/min（约75%~80% VO₂ max），75 min/次，1次/天，周末连续2天，持续训练4周。训练结束后，ISO组和WWE+ISO组均颈部皮下注射1次ISO（10 mg/kg），Con组注射等量生理盐水。

1.3 心脏称重和血液生化指标检测

注射ISO 3 d后，测量小鼠体质量（body mass，BM），麻醉小鼠，收集眼球血，生理盐水灌注后摘取心脏，用滤纸吸干表面水分，测量心脏质量（heart mass，HM），计算心脏质量指数（heart mass index，HMI=HM/BM）。小鼠眼球血3 000 r/min离心15 min后吸取上清，在全自动生化分析仪上采用免疫抑制法检测小鼠血清中肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme‑myocardial band，CK‑MB）浓度，在全自动化学发光仪上采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清中心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）浓度。

1.4 病理组织切片

小鼠新鲜心脏组织在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，流水冲洗组织块。将组织先后置于梯度浓度酒精和二甲苯中进行脱水、透明，完成浸蜡、包埋后进行切片与贴片，石蜡切片常规脱蜡至水。

1.5 苏木精‑伊红（hematoxylin‑eosin，HE）染色

苏木精染色6 min，流水冲洗3 min，1%盐酸酒精分化3 s，流水冲洗3 min，伊红染色3 min，流水冲洗后进行脱水、透明、封片，显微镜下观察，在400倍放大倍数下随机挑选5个不同视野拍摄。

1.6 天狼星红染色

滴加Fast Green天狼星红染色液，常温避光孵育1 h，水洗40 s，干燥后，中性树胶封片，显微镜下镜检，在200倍放大倍数下随机拍摄5个视野，使用ImageJ软件分析纤维化面积百分比。

1.7 TUNEL染色

蛋白酶K 37 ℃作用5 min，PBST洗5 min/次×3次，滴加TUNEL检测液，37 ℃避光孵育1 h，PBST洗5 min/次×3次，抗荧光淬灭封片液封片后，荧光显微镜下观察，在400倍放大倍数下随机选取5个不同视野，分别记录每个视野中阳性细胞数及细胞总数，计算每个视野的凋亡率，凋亡率（%） =凋亡细胞数/细胞总数×100%，取5个视野凋亡率的平均值。

1.8 免疫荧光染色

使用改良型柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复，PBST洗5 min/次×3次，山羊血清室温封闭45 min，孵育一抗HO‑1（1∶80），4 ℃过夜。次日，室温复温10 min，PBST洗5 min/次×3次，室温避光孵育Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶300）1 h，PBST洗5 min/次×3次，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察阳性细胞（蓝色细胞核周围呈现明亮黄绿色荧光的细胞）并拍摄，计算每个视野的HO‑1阳性率，阳性率（%） =阳性细胞数/细胞总数×100% ，取5个视野阳性率的平均值。

1.9 实时定量PCR（qRT‑PCR）

小鼠心脏组织匀浆，用Trizol试剂提取总RNA。采用HiScript^® Ⅲ RT SuperMix for qPCR试剂盒生成cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在Applied Biosystems StepOne仪器上运行qRT‑PCR，获得的Ct值以2^‑ΔΔCt计算mRNA水平。各个目的基因和内参引物序列见表1。

1.10 Western blot检测

小鼠心脏组织匀浆，采用加入了蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA试剂盒进行蛋白定量。常规制胶、上样、电泳和转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，孵育一抗GPX4（1∶1 000）、HO‑1（1∶1 000）和内参GAPDH（1∶5 000），4℃过夜.次日，PBST洗5 min/次×3次，37 ℃孵育二抗（1∶10 000）1 h，PBST洗5 min/次×3次，ECL发光，全自动化学发光图像分析仪拍照，使用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。

1.11 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理，数据以平均数±标准差（\overline{x}±s）表示，采用单因素方差分析（One‑way ANOVA）及Tukey多重比较检验（Tukey′s multiple comparisons test）法进行组间比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠HMI、CK‑MB和cTnI的测定结果

与Con组相比，ISO组的心脏质量指数HMI值升高，但差异无统计学意义，与ISO组相比，WWE+ISO组的HMI值显著降低（P<0.05）；与Con组相比，ISO组血清中CK‑MB浓度显著增加（P<0.05），cTnI浓度有升高趋势（P>0.05），与ISO组相比，WWE+ISO组的CK‑MB浓度显著降低（P<0.05），cTnI浓度呈现下降趋势（P>0.05）。结果提示，ISO注射后可以诱导心脏损伤，血清中心脏损伤的标志物CK‑MB和cTnI浓度均增加，周末勇士运动对ISO诱导的心脏损伤具有一定保护作用。见图1。

2.2 HE染色检测周末勇士运动对ISO诱导心脏损伤的影响

HE染色结果显示，与Con组相比，ISO组小鼠心肌细胞排列紊乱，炎性细胞浸润心脏组织中的数量明显增加，与ISO组相比，WWE+ISO组的心肌细胞排列相对较为整齐，炎性细胞浸润心脏组织中的数量显著减少。结果表明，周末勇士运动可以减轻ISO诱导的小鼠心脏组织中炎性细胞浸润。见图2A。

2.3 周末勇士运动对ISO诱导心脏纤维化和肥大的影响

天狼星红染色结果显示，ISO组小鼠心脏纤维化面积显著高于Con组（P<0.001），WWE+ISO组的心脏纤维化面积显著低于ISO组（P<0.01）。定量PCR结果显示，与Con组相比，ISO组I型胶原（collagen Ⅰ，Col 1）、Ⅲ型胶原（collagen Ⅲ，Col 3）和心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，Anp）的mRNA水平显著升高（P<0.05），与ISO组相比，WWE+ISO组Col 1、Col 3和Anp的mRNA水平显著降低（P<0.05）；另外，ISO组转化生长因子β（transforming growth factor，Tgf‑β）和脑钠肽（brain natriuretic peptide，Bnp）的mRNA水平高于Con组，但差异无统计学意义，WWE+ISO组的Tgf‑β和Bnp的mRNA水平低于ISO组，差异无统计学意义。结果提示，周末勇士运动可以减轻ISO诱导的心脏纤维化和肥大。见图2B、图3。

2.4 周末勇士运动对ISO诱导心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示，ISO组小鼠心脏组织中TUNEL阳性细胞数量显著高于Con组（P<0.01），WWE+ISO组TUNEL阳性细胞数量显著低于ISO组（P<0.05）。结果表明，周末勇士运动可以减轻ISO诱导的心肌细胞凋亡。见图4。

2.5 周末勇士运动对ISO诱导心脏炎症的影响

定量PCR结果显示，与Con组相比，ISO组Il‑6和Tnf‑α的mRNA水平显著升高（P<0.01，P<0.05），与ISO组比较，WWE+ISO组IL‑6和Tnf‑α的mRNA水平显著降低（P<0.05）；ISO组IL‑1β和单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，Mcp‑1）的mRNA水平高于Con组，但差异无统计学意义，WWE+ISO组IL‑1β和Mcp‑1的mRNA水平均降低，其中IL‑1β的mRNA水平显著低于ISO组（P<0.05）。结果提示，周末勇士运动可以抑制ISO诱导的心脏炎症。见图5。

2.6 周末勇士运动对ISO诱导心脏铁死亡的影响

定量PCR、Western blot和免疫荧光染色检测小鼠心脏组织中铁死亡相关基因和蛋白的表达。定量PCR结果显示，ISO组核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid‑2 related factor 2，Nrf2）的mRNA水平低于Con组，但差异无统计学意义，WWE+ISO组Nrf2的mRNA水平显著高于ISO组（P<0.001）；与Con组相比，ISO组Ho‑1的mRNA水平显著升高（P<0.01），与ISO组比较，WWE+ISO组Ho‑1的mRNA水平显著降低（P<0.05）。Western blot结果显示，ISO组GPX4蛋白表达显著低于Con组（P<0.05），WWE+ISO组GPX4蛋白表达显著高于ISO组（P<0.05），ISO组与Con组相比，HO‑1蛋白表达水平明显上调（P<0.01），WWE+ISO组与ISO组相比，HO‑1蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。免疫荧光染色结果显示，ISO组HO‑1荧光阳性细胞数量显著高于Con组（P<0.05），WWE+ISO组HO‑1荧光阳性细胞数量显著低于ISO组（P<0.05）。结果提示，周末勇士运动可以抑制ISO诱导的心肌细胞铁死亡。见图6、7。

3 讨论

运动可以通过改善心肌细胞能量代谢，激活AMPK、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3‑kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路等发挥对心血管系统的保护效应^{［15‑18］}，然而，运动改善不良心脏重塑的机制仍旧不清楚。心脏疾病的发生和发展往往伴随着交感神经系统的过度激活，运动抑制交感神经，增强心脏对肾上腺能刺激的敏感性，从而降低心脏损伤风险^{［5， 19］}。笔者在本研究中同样发现一种新式的“周末勇士”运动方式，可以通过抑制心脏炎症和心肌细胞铁死亡，帮助心脏抵抗β‑肾上腺素能过度激活诱导的心脏损伤，发挥保护效应。

体力活动指南建议每周进行150分钟或更多中等到剧烈的身体活动（moderate to vigorous physical activity，MVPA）以获得整体健康益处，但集中活动与更均匀分布活动的相对健康效果尚不清楚。研究显示，集中在1~2天内周末勇士体力活动模式与更均匀分布体力活动模式相似，均能够显著改善心血管疾病风险与结局，数据显示两种体力活动模式均可降低房颤［周末勇士运动风险比（hazard ratio，HR）：0.78，均匀分布体力活动HR：0.81］、心肌梗死（周末勇士运动HR：0.73，均匀分布体力活动HR：0.65）、心力衰竭（周末勇士运动HR：0.62，均匀分布体力活动HR：0.64）和卒中的发生率（周末勇士运动HR：0.79，均匀分布体力活动HR：0.83）^{［8， 20］}。此外，其他研究显示，无论是周末勇士运动还是定期均匀分布运动群体，其全因死亡率和特定原因死亡率都低于运动量不达标的群体，且二者之间无显著差异^［9］。与运动量不达标的成年群体相比，周末勇士运动可以降低内脏肥胖指数（visceral adiposity index，VAI），而周末勇士运动与定期均匀分布运动的群体在降低VAI方面无显著差异^［21］。这些体力活动流行病学证据均表明，在体力活动总量达标体力活动指南建议的中等强度活动150分钟/周的基础上，“周末勇士”这种新的体力活动模式可以获得与传统的定期均匀分布活动类似的健康效应，有效地减少全因死亡率和心血管疾病风险。然而，周末勇士运动促进健康效应的潜在分子机制尚未揭示清楚。研究显示，在糖尿病大鼠的运动模型中，运动改善糖尿病大鼠肌肉组织炎症、减少氧化应激和线粒体损伤，并证明在运动总持续时间相同的情况下，周末勇士运动与其他运动方式之间没有显著差异^［22］。本研究通过构建周末勇士运动动物实验模型并结合ISO注射构建的心脏病理重塑模型，检测了心脏组织中炎症、凋亡和铁死亡等相关指标，发现周末勇士运动可能通过抑制心脏炎症、心肌细胞凋亡和铁死亡，帮助心脏抵抗急性交感神经过度激活诱导的心脏损伤，这一研究结果为周末勇士运动方式的心血管保护作用提供新的证据。

急性或慢性的β‑AR过度激活诱导的心肌损伤，最突出的病理特征就是心肌细胞发生大量死亡现象^［23］。研究已经证实病理性心脏损伤与坏死、坏死性凋亡、凋亡、焦亡和铁死亡等多种细胞死亡方式有关^{［24‑26］}。抑制心肌细胞死亡对于减轻病理刺激因素诱导的心脏损伤，改善心脏损伤后的预后具有重要意义。近期研究显示，运动预适应可以通过减少炎症细胞浸润和心脏炎症反应，抑制心肌细胞焦亡和坏死性凋亡信号通路蛋白表达，减弱ISO诱导的心脏纤维化^［27］。铁死亡（ferroptosis）是一种新的、铁依赖性的程序性细胞坏死方式，由氧化应激和脂质过氧化驱动，脂质自由基蓄积诱导细胞内氧化应激反应增强，引起蛋白质、脂质和核酸损伤并导致细胞死亡，其关键调控因素是Fe²⁺蓄积和脂质过氧化^［28］。近年来，铁死亡在心血管疾病的发生、发展过程中的作用与机制被逐渐证实。FUN14结构域蛋白2（FUN14 domain‑containing protein 2，FUNDC2）是一种高度保守且普遍表达的线粒体外膜蛋白，它可以促进铁死亡加重阿霉素诱导的心脏损伤，敲除FUNDC2可以减少心肌细胞铁死亡来保护小鼠心脏免受阿霉素诱导的心脏损伤，其机制与FUNDC2影响溶质载体家族25成员11（solute carrier family 25 member 11，SLC25A11）和GPX4的稳定性、调节线粒体谷胱甘肽（mitochondrial glutathione，mitoGSH）并减弱铁死亡氧化应激有关^［29］。脂氧合酶15（15‑lipoxygenase，Alox15）/15‑羟过氧化二十碳四烯酸（15‑HpETE）介导的心肌细胞铁死亡会加重心脏缺血再灌注损伤，心肌特异性敲除Alox15可以减轻小鼠心脏缺血再灌注损伤，恢复心功能，Alox15特异性抑制剂ML351通过提高过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator‑activated receptor γ coactivator‑1α，pgc1α）蛋白水平，抑制心肌细胞铁死亡^［30］。此外，研究显示运动通过激活溶质载体家族7成员11（SLC7A11）/GPX4通路抑制铁死亡，从而保护大脑缺血再灌注损伤，铁死亡激动剂erastin诱导的SLC7A11下调逆转了运动的神经保护作用^［31］。运动通过抑制心脏HO‑1/GPX4介导的铁死亡缓解糖尿病小鼠心室重构^［32］。运动可以通过调控Nrf2/GPX4通路，抑制心肌细胞铁死亡，减弱高脂膳食诱导的小鼠心肌损伤^［33］。此外，有研究揭示中等强度运动通过增强Nrf2抗氧化信号，减弱ISO诱导的氧化应激，对ISO诱导的心脏损伤具有保护作用^［34］。本研究发现周末勇士运动可以上调Nrf2基因表达，上调GPX4蛋白表达，下调HO‑1基因和蛋白表达，帮助心脏抵抗β‑肾上腺素能超载诱导的心脏损伤。由此，推测运动可能通过调控Nrf2/GPX4/HO‑1通路，抑制ISO诱导的心肌细胞铁死亡，帮助心脏抵抗ISO诱导的心脏损伤与纤维化重构。遗憾的是，本研究未使用任何铁死亡激动剂或抑制剂去验证运动调控铁死亡的心脏保护效应，后续研究需要使用药物或者基因敲除的方式开展实验进一步验证铁死亡信号通路在运动中的作用机制。此外，本研究没有比较同等训练量条件下，周末勇士运动与其他运动方式的心血管保护效应，后续也需要设计实验近一步揭示周末勇士运动促进心血管健康效应的潜在分子机制。

综上所述，周末勇士运动可能通过抑制心脏炎症和铁死亡，帮助心脏抵抗β肾上腺素能过度激活诱导的心脏损伤与纤维化重构，运动抑制心肌细胞铁死亡有希望成为新的心脏保护作用靶点。

作者贡献度说明：

秦娣：实验设计、实验实施、论文撰写；郑一苇、林毅：训练小鼠、实验数据分析处理；秦学林、彭勇：实验设计指导、协助实验操作、论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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