基于PPTA/SP/NK1信号通路探讨橘百芍合方治疗化疗性异食癖恶心呕吐模型大鼠的作用机制

Mechanism of action of JuBaiShao Combination Formula on model of cisplatin‑induced nausea and vomiting in rats based on the PPTA/SP/NK1 signaling pathway

摘要

目的 基于PPTA/SP/NK1信号通路探讨橘百芍合方对化疗性异食癖恶心呕吐模型大鼠的作用机制。 方法 48只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组、顺铂模型组、阿瑞吡坦组（2 mg/kg）、橘百芍低剂量组（1.8 g/kg）、橘百芍中剂量组（3.6 g/kg）、橘百芍高剂量组（7.2 g/kg），每组8只。正常对照组给予腹腔注射0.9 %氯化钠溶液，其余各组腹腔注射5 mg/kg顺铂诱导建立恶心呕吐模型，各组动物在造模前1 h首次灌胃处理，后12 h/次，观察并记录造模前后72 h内高岭土的消耗量，分别于造模后24 h和72 h麻醉后处死动物取血清、回肠及延髓组织。ELISA法测定各组大鼠血清、延髓P物质（substance P，SP）含量。免疫组化染色法检测神经激肽‑1（neurokinin‑1，NK1）受体在大鼠回肠、延髓组织中的表达水平；Real‑time PCR法检测各组大鼠回肠、延髓前速激肽A（preprotachykinin‑A，PPTA）和NK1受体mRNA的表达水平；WB法检测各组大鼠回肠、延髓NK1受体蛋白的表达。 结果 与正常对照组相比，模型组大鼠造模后24 h、72 h高岭土摄入量显著增加（P<0.05）；与模型组相比，阿瑞吡坦组、橘百芍高剂量组大鼠造模后24 h、72 h高岭土摄入量显著降低（P<0.05）。与正常对照组相比，模型组大鼠在造模后24 h、72 h血清和延髓组织中SP含量增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，阿瑞吡坦组、橘百芍中剂量组、橘百芍高剂量组大鼠造模后24 h、72 h血清和延髓组织中SP含量显著下降（P<0.05）。与正常对照组相比，模型组大鼠造模后24 h、72 h回肠和延髓组织中PPTA mRNA、NK1受体mRNA、NK1受体蛋白显著增加（P<0.05）；与模型组相比，阿瑞吡坦组、橘百芍中剂量组、橘百芍高剂量组大鼠造模后24 h、72 h回肠和延髓PPTA mRNA、NK1受体mRNA、NK1受体蛋白显著降低（P<0.05）。 结论 橘百芍合方可能通过抑制中枢和外周PPTA/SP/NK1通路发挥其止吐作用。

Abstract

Objective To study the mechanism of Jubaishao combination formula on chemotherapeutic pica nausea and vomiting model rats based on PPTA/SP/NK1 signaling pathway. Methods A total of 48 SPF Wistar male rats were randomly assigned to six groups， including normal control group， cisplatin model group， aprepitant group （2 mg/kg）， Jupaeone low‑dose group （1.8 g/kg）， Jupaeone medium‑dose group （3.6 g/kg） and Jupaeone high‑dose group （7.2 g/kg）， with eight rats in each group. Except for the normal control group， the rats with pica nausea and vomiting model were treated with 5 mg/kg cisplatin intraperitoneally in other groups. The animals in each group were given intragastric treatment for the first time one hour before modeling and 12 hours after modeling. The consumption of kaolin within 72 hours before and after modeling was observed and recorded. Serum， ileum and medulla oblongata tissues were collected from the animals 24 h and 72 h after anesthesia. The content of Substance P （SP） in serum and medulla oblongata was determined by ELISA. The expression of Neurokinin‑1 （ neurokinin‑1， NK1） receptor in the ileum and medulla oblongata of rats was detected by immunohistochemical staining. The mRNA expression levels of Preprotachykinin‑A （PPTA） and NK1 receptor in ileum and medulla oblongata were detected by Real‑time PCR. Western Blotting method was used to determine the NK1 receptor protein in rat ileum and medulla oblongata. Results At 24 h and 72 h after cisplatin modeling， the intake of kaolin in model group was notably enhanced compared with the normal control group （P<0.05）. The intake of kaolin in aprepitant group and Jubaishao high‑dose group was significantly decreased at 24 h and 72 h after modeling compared with that in model group （P<0.05）. Compared with normal control group， SP content in serum and medulla oblongata of model group was notably enhanced at 24 h and 72 h after modeling （P<0.05）. The content of SP in serum and medulla oblongata of aprepitant group， Jubaishao medium dose group and Jubaishao high dose group was significantly decreased at 24 h and 72 h after model building compared with that of model group （P<0.05）. Compared with normal control group， PPTA mRNA， NK1 receptor protein and NK1 receptor mRNA in rat ileum and medulla oblongata of model group were significantly increased at 24 h and 72 h after modelling （P<0.05）. Compared with model group， PPTA mRNA， NK1 receptor protein and NK1 receptor mRNA in ileum and medulla oblongata of aprepitant group， Jubaishao group and medium and high dose group were significantly decreased at 24 h and 72 h after model building （P<0.05）. Conclusion Jubaishao may exert its antiemetic effect by inhibiting central and peripheral PPTA/SP/NK1 pathways.

Graphical abstract

关键词

橘百芍合方 / 化疗性呕吐 / PPTA/SP/NK1信号通路 / 异食癖 / 大鼠

Key words

JuBaiSao Combination Formula / Chemotherapeutic nausea and vomiting / PPTA/SP/NK1 signaling pathway / Pica / Rat

化学疗法是恶性肿瘤的常用治疗方法，而化疗性恶心呕吐（chemotherapy‑induced nausea and vomiting，CINV）是癌症患者在化疗后主要不良反应之一，其发生率为65 %~85 %，其中应用铂类化疗引起CINV的发生率大于90 %，美国NCCN指南将其列为高催吐性化疗药物^［1‑3］。CINV不但降低了患者的生活质量和依从性，而且严重的呕吐使患者因不能耐受下一周期的化疗而可能中断或放弃化疗^［4，5］。尽管止吐疗法取得了进步，但高达40%接受化疗的癌症患者未能完全控制恶心和呕吐^［6］。目前临床上使用的止呕药存在着安全性差，应用范围窄，机体易耐药，需要联合用药，价格较高等问题^［7，8］。因此，寻找有效、低毒、广谱、廉价的抗呕吐药是亟需解决的医学问题。

中医药在亚洲具有3 000多年的临床实践史，已成功应用于减轻化疗引起的副作用^［9］。与化学止吐药相比，中药具有作用范围广、机体不易产生耐药性、价格低的优点^［10］。中医学中并无CINV之名，根据其症状，将其归于“呕吐”的范畴，其基本病机为脾胃虚弱，胃气上逆。肿瘤患者长期接受医学治疗处于低质量生活状态，而致肝气郁结、心神失养。化疗药物的中医属性大多为辛温大热之品，最易伤阴血。由此可知，CINV病人病机为脾胃虚弱而致胃气上逆，肝郁、心神失养兼合阴血不足。橘百芍合方由橘皮竹茹汤、百合地黄汤、芍药甘草汤组合而成，此三方均出自汉代张仲景之手，其中橘皮竹茹汤功以健中和胃、降逆止呕，为治疗呕吐之经方，百合地黄汤效以养阴清热、解郁安神，芍药甘草汤滋阴养血，濡养筋脉，三方合用共奏和中降逆，解郁安神，滋阴血之作用，与CINV病机相契合。本团队前期在临床实践过程中已证实，使用合方治疗CINV疗效显著，安全性好^［11］。国内外研究表明，前速激肽A（preprotachykinin‑A，PPTA）/P物质（substance P，SP）/神经激肽‑1（neurokinin‑1，NK1）通路可能是橘百芍合方中药物及其有效成分（如橙皮苷、竹茹多糖、姜辣素、人参皂苷、人参多糖、大枣多糖、甾体皂苷、梓醇、地黄苷、芍药苷、甘草素等）发挥止呕作用的途径之一^［9‑14］。基于此，本研究拟通过构建大鼠异食癖恶心呕吐模型，通过外周（血清、回肠）和中枢（延髓）两个层面，同步观测橘百芍合方对大鼠（24 h、72 h）内SP及其前体PPTA和受体NK1的影响，从整体、分子、基因水平探讨橘百芍合方对CINV的治疗作用及对PPTA/SP/NK1信号通路的影响，以期为中医药治疗CINV的分子机制提供更多实验证据。

1 材料与方法

1.1 动物

自济南朋悦实验动物繁育有限公司购买48只SPF级Wistar体重为200~220 g、鼠龄为8~10周的雄性大鼠。动物生产许可证号：（鲁）2022‑0006，动物使用许可证号：（鲁）2023‑0008。大鼠饲料购自郑州市金水区嘉年实验室用材料经营部，批号：130220913。大鼠实验于河南省中医药研究院实验室进行，饲养室12 h明暗交替，温度为21~24 ℃，相对湿度为40%~70%。本实验经河南省中医药研究院伦理会审查（伦理编号：HNTCMDW ‑20230714）。

1.2 药物与试剂

橘百芍合方（橘皮15 g、竹茹15 g、生姜9 g、人参3 g、甘草9 g、大枣9 g、百合18 g、生地黄15 g、芍药12 g）中药颗粒由河南中医药大学第一附属医院中药房提供，由江阴天江药业有限公司生产（产品批号：2310302）。

顺铂、阿瑞吡坦（齐鲁制药有限公司，批号：FA1A3002B、H20203322）；高岭土、阿拉伯树胶粉（天津市华盛化学试剂，批号：20221002、20211022）；大鼠SP酶联免疫（ELISA）试剂盒、大鼠SP化学发光免疫分析（CLIA）试剂盒（江苏酶免生物科技有限公司，批号：ZY3320‑A、批号EKU09455）；NK1R Antibody（武汉三鹰生物科技有限公司，批号：DF7405‑50）；考马斯亮蓝试剂盒（上海联祖生物科技有限公司，批号：LZ‑S01370）；Tripure Isolation Reagent试剂盒、逆转录试剂盒、Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）试剂盒、（德国Roche公司，批号：C58‑11667165001、5893151001、4913914001）；SR‑3A （H‑138）（美国Santa Cruz公司，批号：sc‑28958）；动物非免疫血清（羊）、山羊抗兔抗体（南通飞宇生物科技有限公司，批号：FY41328、111‑585‑144）；Streptavidin ‑peroxidase酶（上海远慕生物科技有限公司，批号：YM‑MY601J）；DAB显色试剂盒、RIPA裂解液（上海沪峥生物科技有限公司，批号：HZZ028‑2、HZ‑57004）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海酶联生物科技有新公司，批号：mlsw‑E0768）；PMSF（美国Thermo Fisher Sientific公司，批号：36978）；SDS‑PAGE凝胶快速配制试剂盒（上海懋康生物科技有限公司批号：MP2019‑1K1T）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG、一抗稀释液、二抗稀释液、GAPDH 抗体（碧云天生物技术有限公司，批号：A0208、A0256、P0023A、P0023D、AG019）。

1.3 仪器

高速匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：S10）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG‑9420A）；石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）；电热恒温培养箱（常州润华电器有限公司，型号：DNP‑9082‑1D）；酶标仪（美谷分子仪器有限公司，型号：SpectraMax iD5）；集热式磁力搅拌器（力辰仪器科技有限公司，型号：LC‑OB‑0.8L）；-80 ℃超低温冰箱（海尔公司，型号：DW‑86L388J）；光谱仪（上海美析仪器有限公司，型号：UL‑500）；光学显微镜（日本Nikon公司，型号：ECLIPSE E100）；荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：ABI 7500 Fast）；精密pH计（杭州美尼特自动化仪表，型号：pH400EX）；自动三重纯水蒸馏器（上海科晓科学仪器有限公司，型号：SZ‑97A）；超净工作台（苏州佳宝净化有限公司，型号：JB‑CJ‑800U）；电泳槽、玻璃板、电泳仪、转膜仪、3M 滤纸（美国Bio‑rad公司，型号：Mini‑Protean、1653312、Power HC、Trans‑Blot Turbo、170‑3969）；多功能成像仪（美国GE公司，型号：AI600）。

1.4 高岭土的制备

取适量阿拉伯树胶粉在容器中，加入制备的蒸馏水制成2 %阿拉伯树胶溶液，将高岭土粉末加入2 %阿拉伯树胶溶液中制成硬度适中的团块，用5 mL规格注射器针管将该团块制备成普通饲料颗粒相同的尺寸，室温自然干燥。

1.5 分组和治疗

将大鼠随机分为6 组，每组8只：正常对照组（Normal control group）、顺铂模型组（Cisplatin model group）、阿瑞吡坦组（Aprepitant group）、橘百芍低剂量组（JBS low dose group）、橘百芍中剂量组（JBS middle dose group）、橘百芍高剂量组（JBS high dose group）。

适应性饲养一周后，将高岭土与普通饲料一起投喂，高岭土消耗量记录时间间隔12 h，当高岭土表面无咬痕后开始进入正式实验。

阿瑞吡坦组、橘百芍低、中、高剂量组每日给药剂量分别为2 mg/kg阿瑞吡坦、1.8、3.6、7.2 g/kg橘百芍颗粒，正常对照组和模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液，均每日2次（间隔12 h）灌胃，持续3 d，以上干预措施均于造模前1 h（7∶00 am）开始给予。首次干预后1 h（8∶00 am）对顺铂模型组、阿瑞吡坦组、橘百芍低、中、高剂量组大鼠单次腹腔注射5 mg/kg（给药浓度为1 g/L，给药体积为5 mL/kg）顺铂进行造模，正常对照组给予腹腔注射0.9%氯化钠溶液。

各组于顺铂造模后24、72 h分别处理4只大鼠，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠全麻，抽取腹主动脉血液，离心机转速3 000 r/min运转20 min，将血清分装，置于-80 ℃超低温冰箱内贮藏。大鼠血液采集后，即刻取其延髓（中间纵向切开分为两份）和回肠2 cm左右（两份），一组样本经液氮速冻后立即置于-80 ℃超低温冰箱内，另一组置于4%多聚甲醛中。

1.6 检测指标与方法

（1）高岭土摄入量：高岭土、普通饲料被分开放置于大鼠笼盖上，每日8∶00 am记录每组大鼠高岭土消耗量。计算公式：24 h高岭土消耗量=前1天添加高岭土总量-当日剩余高岭土量。大鼠笼中放置少量垫料，以便收集啃咬后的高岭土碎屑。

（2）ELISA法检测各组大鼠血清、延髓SP含量：在酶标板上设有标准孔和空白孔，将50 μL对应的标准样本添加到标准孔内，将40 μL的稀释液分别与10 μL血清、10 μL延髓组织匀浆上清液一起添加至样品孔。在每个孔内再加入100 μL HRP标记的抗体（除空白孔），随后使用封板膜将反应孔密封起来，在37 ℃条件下培养60 min，用吸水纸张去除液体，使平板干燥，干燥过程持续5遍，底物A、B各50 μL加入各个孔内，37 °C下培养15 min，向每个孔内加入50 μL的终止液，测定每一个孔在450 nm处的吸光度（A），并算出样本的浓度。

（3）免疫组化法检测大鼠回肠、延髓组织中NK1受体的表达水平：将回肠和延髓组织包埋和切片（厚度为5 μm），然后进行常规免疫组织化学过程处理，以可视化NK1受体蛋白。在室温下，用PBS（pH：7.4）将切片冲洗4次（每次10 min），并用10%的正常山羊血清进行封闭。添加抗NK1抗体，4 ℃过夜。经PBS清洗后，用山羊抗兔抗体室温下培养2 h，并与新鲜的DAB显色试剂染色反应10 min。苏木素（0.5%）染液滴于组织片上进行30 s染色，生理盐水冲洗后复染到细胞核呈蓝色，然后用乙醇、二甲苯、中性树胶使之脱水、透明、封固。在光学显微镜下对切片进行观察。

（4）Real‑time PCR法测定大鼠回肠、延髓内PPTA mRNA和NK1受体mRNA的量：分别将1 mL TRIzol试剂加入100 mg大鼠延髓、回肠组织中，用研磨仪匀浆，依次加入苯酚、异丙醇以及75%的乙醇提取、沉淀、洗涤，然后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，酶标仪评估总RNA的浓度及纯度。按照试剂盒说明书进行逆转录制备cDNA并配制PCR反应体系，以GAPDH为内参进行扩增，检测各组大鼠延髓、回肠组织PPTA和NK1受体mRNA的表达水平。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司生产，引物序列见表1。

反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性3 s、60 ℃退火30 s，40个循环。以2^‑ΔΔCt法计算基因相对表达量。

（5）WB法检测大鼠回肠、延髓NK1受体蛋白的表达：对回肠和延髓组织称重100 mg并将其分成多个小块，置于匀浆机中，用 RIPA裂解液，以重量（g）∶裂解液（mL）为1∶10混匀，在冰上培养1~3 h（5 min震动一次以保证组织充分裂解），4 ℃、12 000 r/min离心10 min后取上清。按1∶1比例将样品与SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液混匀，沸水浴5 min，然后将40 μg的蛋白质样品用10% SDS‑PAGE分离后，转移到 PVDF薄膜上，根据需要的蛋白质分子量进行剪切，按照说明书依次加入一抗、二抗，TBST洗涤3次每次10 min，加ECL显色剂A、B（1∶1）混匀配制显色拍照，AIWBwell^TM软件分析图像，以NK1受体蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学处理

研究结果以平均值±标准差（\overline{x}\pm s）表示，用SPSS 26.0软件进行检测，符合方差齐性的数据采用单因素方差分析进行多组间比较，方差不齐的多组间比较应用Dunnett's T3检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠摄食高岭土的量

顺铂注射前，高岭土投放的72 h内，各组大鼠对高岭土的摄食量呈递减趋势，但差异不明显（P>0.05）。在顺铂给药后24 h和72 h，模型组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），说明本实验造模大鼠异食癖恶心呕吐模型成功。橘百芍合方和阿瑞吡坦均降低造模后大鼠高岭土消耗量，其中橘百芍高剂量组和阿瑞吡坦组的高岭土摄入量在造模后24、72 h与模型组比较均有显著差异（P<0.05），橘百芍中剂量组与模型组、阿瑞吡坦组相比在造模后72 h的高岭土摄入量均有显著差异（P<0.05），橘百芍高剂量组在造模后24、72 h的高岭土摄入量与阿瑞吡坦组相比无明显差异（P>0.05）。见图1。

2.2 大鼠血清和延髓SP含量

在顺铂造模后24 h和72 h，与正常对照组相比，模型组大鼠血清及延髓组织中的SP含量均明显上升（P<0.05）。顺铂造模后24、72 h，与模型组相比，橘百芍低剂量组能使大鼠血清及延髓SP含量有所降低，但无统计学差异（P>0.05），橘百芍中剂量组、橘百芍高剂量组、阿瑞吡坦组血清及延髓SP含量均显著降低（P<0.05）。与阿瑞吡坦组相比，橘百芍高剂量组24、72 h血清及延髓SP含量差异无统计学意义（P>0.05），橘百芍中剂量组24、72 h血清及72 h延髓SP含量差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 大鼠回肠和延髓NK1受体免疫组化表达

免疫组化结果表明，大鼠回肠、延髓组织中均有NK1受体免疫反应阳性产物的表达，其主要存在于回肠组织的黏膜、黏膜下层，延髓组织中的神经元胞质内（NK1受体的免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒）。顺铂造模后，大鼠回肠NK1受体含量显著增加；给予阿瑞吡坦处理后，造模后大鼠回肠NK1受体含量显著下降；给予橘百芍处理后，也使造模后大鼠回肠NK1受体含量下降，且呈剂量依赖性。延髓组织中NK1受体主要表达在神经元胞质内，延髓组织内NK1受体免疫反应阳性产物表达趋势同回肠。见图3。

2.4 大鼠回肠和延髓PPTA mRNA表达情况

顺铂造模后24 h和72 h，与正常对照组相比，模型组大鼠回肠、延髓组织中的PPTA mRNA表达量明显上升（P<0.05）。顺铂造模后24、72 h，与模型组相比，橘百芍低剂量组能降低回肠及延髓PPTA mRNA表达量，但差异无统计学意义（P>0.05），橘百芍中剂量组、橘百芍高剂量组、阿瑞吡坦组回肠及延髓PPTA mRNA表达量均显著降低（P<0.05）。与阿瑞吡坦组相比，橘百芍高剂量组24、72 h回肠及延髓PPTA mRNA表达量差异无统计学意义（P>0.05），橘百芍中剂量组24、72 h回肠及延髓PPTA mRNA表达量差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

2.5 大鼠回肠和延髓NK1受体mRNA表达情况

在顺铂造模后24 h和72 h，与正常对照组相比，模型组大鼠回肠、延髓中的NK1受体mRNA表达量均明显上升（P<0.05）。顺铂造模后24、72 h，与模型组相比，橘百芍低剂量组能降低回肠及延髓NK1受体mRNA表达量，但差异无统计学意义（P>0.05），橘百芍中剂量组、橘百芍高剂量组、阿瑞吡坦组回肠及延髓NK1受体mRNA表达量均显著降低（P<0.05）。与阿瑞吡坦组相比，橘百芍高剂量组24、72 h回肠及延髓NK1受体mRNA表达量差异无统计学意义（P>0.05），橘百芍中剂量组24、72 h回肠及延髓NK1受体mRNA表达量差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

2.6 大鼠回肠和延髓NK1受体蛋白表达情况

顺铂造模后24 h和72 h，与正常对照组相比，模型组大鼠回肠、延髓中的NK1受体蛋白表达量明显上升（P<0.05）。顺铂造模后24、72 h，与模型组相比，橘百芍低剂量组能降低回肠及延髓NK1受体蛋白表达量，但差异不明显（P>0.05），橘百芍中剂量组、橘百芍高剂量组、阿瑞吡坦组回肠及延髓组织中NK1受体蛋白表达量均明显降低（P<0.05）。橘百芍高剂量组24、72 h回肠及延髓NK1受体蛋白表达量与阿瑞吡坦组相比无显著差异（P>0.05），橘百芍中剂量组24、72 h回肠及延髓NK1受体蛋白表达量与阿瑞吡坦组相比差异显著（P<0.05）。

3 讨论

橘百芍合方由橘皮竹茹汤、百合地黄汤、芍药甘草汤组合而成。《金匮要略》曰“哕逆者，橘皮竹茹汤主之”，后世医家发现橘皮竹茹汤可治疗反流性食管炎、胆汁反流性胃炎、妊娠恶阻、CINV等疾病，上述疾病虽不同，但其病机均为久病亏虚、胃气上逆^{［15‑17］}。尤其是肿瘤患者病情迁延，机体胃气本虚，化疗亦加重胃气虚弱而致衰败，橘皮竹茹汤可益气养胃，降逆止呕，改善CINV症状。现代研究还发现橘皮竹茹汤具有调节胃肠道平滑肌、调节肠道菌群、增强机体免疫力、保护神经细胞以及抗炎的功效，进一步说明其治疗CINV的机制^{［18‑20］}。百合地黄汤主要用于治疗百合病（类似于现代医学中的焦虑症）。《金匮要略·百合狐惑阴阳毒病证治三》曰：“百合病者，…… 意欲食，复不能食，常默然，欲卧不能卧，欲行不能行；饮食或有美时，或有不用闻食臭时，诸药不能治，得药则剧吐利”，由此可知，百合病中许多症状与肿瘤患者进展及放疗、化疗等各种不适症状（抑郁、烦躁、饮食时好时坏、呕吐）相类似^［21］。现代研究发现，百合地黄汤具有抗焦虑、抗炎作用，对肺癌、胃癌及肿瘤相关并发症焦虑、抑郁、出血等有治疗作用^{［22，23］}。有76.6%的肿瘤患者存在焦虑情绪，焦虑情绪亦加重CINV恶心呕吐的症状。百合地黄汤中百合解郁清心安神，生地黄清热养阴，共奏养阴清热、解郁安神的作用，能有效改善CINV患者心神失养兼合阴血不足，进而改善其呕吐症状。CINV以脾胃虚损为要，脾胃五行属土，土弱木侮，治疗应重视抑木扶土，调和肝脾。芍药甘草汤出自《伤寒论》，方中白芍养血柔肝，甘草健脾补气，共奏柔肝补脾，滋养阴血之功，用于治疗CINV正契合抑木扶土，调和肝脾之原则。现代医学研究发现，芍药甘草汤具有缓解胃肠道平滑肌痉挛、抗炎的作用，对CINV具有治疗效果^［24］。综上，橘百芍合方健脾和肝，益胃降逆，均能有效改善CINV症状，本实验基于PPTA/SP/NK1通路，构建了大鼠异食癖模型，探讨橘百芍合方的止呕效果及其作用机制。

大鼠没有恶心呕吐行为，但科学研究发现其异食癖行为就等同于那些有呕吐反射动物的恶心呕吐反应，因此恶心呕吐程度可以通过大鼠摄入的高岭土量反映。现代研究中，对大鼠注射高致吐性化疗药物顺铂诱导建立异食癖模型，已在CINV的病理及相应药物研究中广泛应用。本研究中，腹腔注射顺铂后，模型组大鼠啃食高岭土量显著增加。与模型组相比，施用橘百芍合方后整个72 h内，大鼠啃食高岭土的数量显著减少，且呈剂量依赖性。表明橘百芍合方能有效抑制大鼠CINV。

恶心呕吐是人类防御无意吸收有害物质的主要方式，是结构化防御方法的一部分^［25］。由大脑皮层、化学受体器触发区和胃肠迷走神经发出的冲动传导至延髓处的呕吐中枢，再由其传导至腹部、脑神经、唾液和呼吸中枢，触发呕吐反射^{［26，27］}。呕吐中枢是脑干中与呕吐相关的神经核团，它由末端区、孤束核、迷走神经背核和腹外侧区组成的弓形结构组成。CINV的主要作用区域背侧迷走复合体^［28］，它由末端区、迷走神经背核及孤束核共同构成。CINV又分为外周胃肠机制和中枢机制。（1）CINV外周胃肠机制：化疗药物对胃肠道产生损伤作用，促使胃肠内的嗜铬细胞合成并释放包括SP在内的神经递质。这些神经递质与肠黏膜上的相应受体结合，导致该受体被激活。激活后的受体进一步刺激肠黏膜的迷走传入神经和内脏神经，使其兴奋。最终，这些神经冲动通过迷走神经传递至呕吐中枢，引发呕吐^［29］；（2）CINV中枢机制：化疗药物直接将神经冲动传递至延髓化学感受区（chemoreceptor trigger zone， CTZ），然后CTZ释放包括SP在内的神经递质，又激动相关受体（如位于脑后区和孤束核的NK‑1受体），将信号传递至呕吐中枢，引发呕吐^［30］。在此过程中神经递质的SP的生成及其与NK1受体的结合是触发CINV的重要途径。目前临床上通过拮抗NK1受体发挥作用治疗CINV的主要药物为阿瑞吡坦^［31］。SP是含11个氨基酸的多肽，是从Tac1编码的PPTA中裂解而来的非胆碱能兴奋性神经递质，在中枢和外周神经系统中广泛存在^［32］。实验表明，SP可引起雪貂和鼩鼱呕吐^［33］。接受顺铂（>75 mg/m²）治疗的癌症患者血浆SP水平持续升高，这也解释了SP与CINV之间的密切关系^［34］。本研究发现顺铂能显著上调大鼠回肠、延髓PPTA受体蛋白及mRNA表达水平，血清、延髓SP含量亦显著升高，而橘百芍合方能显著下调大鼠回肠、延髓PPTA蛋白及mRNA表达水平，也降低血清、延髓SP含量，且均呈剂量依赖性，说明橘百芍合方对外周及中枢SP的生成有抑制作用。SP处于初级感觉神经元的末端，主要通过NK1受体推动迷走神经传入，并参与多种生理和病理过程，包括呕吐、损伤感受、炎症和抑郁等^{［35‑37］}。本研究结果显示，橘百芍合方能显著降低大鼠回肠和延髓NK1受体蛋白及mRNA表达水平，说明橘百芍合方能抑制外周及中枢SP与NK1受体的结合。

综上，橘百芍合方可抑制CINV模型大鼠恶心呕吐程度，通过抑制PPTA/SP/NK1通路，减少神经递质SP的生成以及其与NK1受体的结合，可能是其发挥作用的一条途径。本研究为中医药防治CINV的基础研究和临床应用提供了科学依据。

作者贡献度说明：

周黎阳：文章整体设计、撰写、数据收集、实验试剂及相关耗材购买；陈萍：指导文章撰写；丁春丽：文章修改，论文整体质量把控并定稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家中医药管理局科技项目(GZY‑KJS‑2022‑041‑1)