黄芩苷通过调控Bcl‑2/Bax/Caspase 3凋亡细胞改善睡眠障碍诱导的认知功能障碍

Baicalin improves cognitive dysfunction induced by sleep disorders by regulating the Bcl‑2/Bax/Caspase 3 apoptosis pathway

摘要

目的 基于网络药理学及动物实验探讨黄芩苷（Baicalin，BA）通过调控Bcl-2/Bax/Caspase 3凋亡细胞改善睡眠障碍（SD）诱导的认知功能障碍的可能机制。 方法 利用网络药理学预测BA和SD的相关靶点，将70只雄性8周龄SD大鼠随机分组：空白组、50 mg组、100 mg组、150 mg组、空白+BA组、模型组和阳性对照艾司唑仑组。采用改良多平台水环境法建立SD模型；水迷宫实验评估大鼠学习记忆能力，旷场实验评估大鼠的焦虑行为；尼氏染色检测大鼠海马CA1区神经元形态学改变并计数；ELISA检测大鼠血清褪黑素的水平；蛋白免疫印迹法检测大鼠海马相关靶点蛋白的表达；RT-qPCR法检测海马相关靶点的mRNA的表达水平。 结果 基于网络药理学研究，预测黄芩苷改善SD诱导的认知功能障碍的生物机制可能为凋亡的调节，Caspase 3可能为其靶点；动物实验结果显示，BA能够改善SD模型大鼠的空间记忆学习能力，改善海马神经元细胞损伤的情况，并增加神经元细胞数量，降低相关靶点Bcl-2蛋白的表达及增加大鼠海马区Bax、Caspase 3蛋白表达。 结论 BA可能通过上调Bcl-2及下调Bax、Caspase 3凋亡蛋白改善SD诱导的认知功能障碍。

Abstract

Objective Exploring the potential mechanism of baicalin （BA） in improving sleep disorder（SD） induced cognitive impairment by regulating the Bcl-2/Bax/Caspase 3 apoptotic pathway based on network pharmacology and animal experiments. Methods Utilizing network pharmacology to predict the related targets of BA and SD， 70 male 8-week-old SD rats were randomly divided into the following groups： control group， 50 mg BA group， 100 mg BA group， 150 mg BA group， control+BA group， model group， and positive control group with estazolam. The modified multiple platform water environment method was used to establish the SD model. The Morris water maze test was employed to assess the learning and memory abilities of the rats， while the open field test was used to evaluate anxiety behavior. Nissl staining was conducted to detect morphological changes and count neurons in the hippocampal CA1 region of the rats. ELISA was used to measure the level of melatonin （MT） in rat serum. Western blotting was applied to detect the expression of related target proteins in the rat hippocampus， and rt-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of the hippocampal-related targets. Results Based on network pharmacology research， the predicted biological mechanism of baicalin in improving SD-induced cognitive impairment might involve the regulation of apoptosis， with Caspase 3 being its potential target. Animal experimental results showed that BA could improve the spatial learning and memory abilities of SD model rats， ameliorate hippocampal neuronal cell damage， increase the number of neuronal cells， reduce the expression of the Bcl-2 protein in related targets， and increase the expression of Bax and Caspase 3 proteins in the hippocampal region. Conclusion BA may improve SD-induced cognitive impairment by upregulating Bcl-2 and downregulating Bax and Caspase 3 apoptotic proteins.

Graphical abstract

关键词

黄芩苷 / 睡眠障碍 / 认知功能 / 凋亡 / 氧化应激

Key words

Baicalin / Sleep disorders / Cognitive function / Apoptosis / Oxidative stress

睡眠障碍（Sleep disorders，SD）指由于昼夜节律失调和睡眠不足导致的警觉性降低，进而导致认知功能的损害^［1］，随着人们社会压力越来越大，目前SD成为了一个重要的健康问题。认知功能障碍是指大脑在获取、存储、处理和使用信息方面出现异常或受损，从而影响个体的记忆、注意力、执行功能等多个方面的能力^［2］。长期的SD对神经和神经内分泌功能的各个方面都有广泛的影响。这些影响包括认知受损、情绪受损、代谢异常、免疫力下降等^［3］。

黄芩是一种传统的药用植物，常用于治疗发烧、咳嗽、腹泻和感染^［4］。黄芩苷（Baicalin，BA）是从黄芩根部中分离得到，是黄芩的有效成分之一^［5］，目前，已有研究表明BA具有抗凋亡、抗氧化、抗炎等药物功效^［5，6］。虽然SD和认知功能障碍之间关系密切，但具体机制尚不清楚，目前仍有很多问题亟待解决。本研究通过建立大鼠睡眠剥夺模型，研究SD与大鼠认知功能障碍之间的联系，探讨其可能的机制，并寻找相应靶点，从而为临床治疗SD导致的认知功能障碍提供一定的理论依据。

１ 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 BA的化学成分与靶点搜索

为了深入探究这一化学成分的特性和功能，采用了PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库作为起点，利用其中的数据资源挖掘化合物的核心信息。SMILES（Simplified Molecular Input Line Entry System）成为连接化合物信息与后续研究的重要桥梁。它通过编码分子结构信息，为化合物的数字化描述提供了统一标准。将获得的SMILES号导入结构相似度预测靶点数据库SwissTargetPrediction中^［7］，为接下来的研究开辟了新路径。这一步骤充分利用了SwissTargetPrediction数据库对于药物与生物靶点间相互作用预测的精准度，进而为药物研发过程中的靶点选择提供了有力支持。通过这种方式得以更加系统、准确地探索BA化学成分的潜在作用机制，为后续药物研发工作的深入开展奠定了坚实基础。

1.1.2 SD靶点的搜索与筛选

本研究通过对GeneCards（https：//www.genecards.org/）与OMIM（https：//www.omim.org/）数据库针对“sleep disorders”关键词的系统检索^［8］，整理并获得了与此病症相关的靶点基因。汇总所有靶点基因之后排除其中的重复项，从而得到最终用作本次研究的疾病相关靶标集合。

1.1.3 交集靶点

基于这些靶标集合，运用Venny工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）的辅助^［9］，识别BA活性成分与SD的交集靶点，建立起了治疗SD的潜在关键靶标点。

1.1.4 “成分‑靶点‑疾病”网络分析

据此，本研究进一步开展了“成分-靶点-疾病”网络分析。我们将黄芩苷、SD以及交集靶点编制成“网络”数据文件和类型文件，借助于Cytoscape 3.9.0软件的功能^［10］，导入上述数据文件，实施了网络拓扑结构分析。通过基于度值（Degree），即各基因的连接数目，本研究在网络图中调整了靶点的图形、颜色、透明度和大小，最终构建出了一张集成的“中药成分-靶点-疾病网络图”，旨在直观展示中药成分与疾病靶点之间的复杂相互作用关系。

1.1.5 蛋白质相互作用网络（Protein-Protein Interaction， PPI）网络构建及网络拓扑分析

利用STRING数据库（https：//string-db.org/），导入所筛选出的交集基因，从而建立蛋白质互作网络。随后，将获得的蛋白质互作关系数据导出，并应用Cytoscape软件（版本3.9.0）进行进一步分析。采用“network Analyzer”工具来计算并获取网络拓扑学的参数。具体而言，我们将制表符分隔值格式的文件导入该软件中，进行蛋白互作网络的构建及其网络拓扑结构的深入分析。为了解析PPI，采用Cytoscape软件进行图谱的构建与分析。通过对相互作用网络中节点的平均度值进行计算，选取度值最高的前10个蛋白质节点，视作关键核心靶点进行后续研究。

1.1.6 基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

本研究采用David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），研究BA和SD高度相关的GO和 KEGG途径^［11］。计算相关GO项和KEGG通路的富集分数。GO分析从生物过程（Biological Process， BP）、细胞成分（Cellular Component， CC）以及分子功能（Molecular Function， MF）三个层面综合注释蛋白质的生物学功能。

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物

随机选取8周龄SPF级雄性SD（Sprague Dawley，SD）大鼠70只，体重260~280 g，购自北京斯贝福，动物生产许可证［SCXK（京）2019-0010］。实验期间，动物饲养与清洁环境，住所设施保持温度控制（24±1）℃，采用12∶12 h的光暗周期适应环境1周，所有大鼠均自由进食标准食物颗粒和水。本实验方案充分考虑动物福利和国家对动物实验管理和伦理的要求，且获得包头医学院动物实验委员会（IACUC）的批准［包医伦审2022第（62）号］。

1.2.2 药品与试剂

BA购自成都草源康生物科技有限公司（纯度≥98%，货号：21967-41-9）；艾司唑仑片购自山东信谊制药有限公司（货号：H37023047）；一抗试剂：Bcl-2（12789-1-AP）、Bax（60267-1-Ig）、Caspase 3（19677-1-AP）、β-actin抗体（20536-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司，均为兔抗；山羊抗兔二抗（#3012）购自武汉亲科生物研究中心有限公司。蛋白质印记法（Wester blot）工作浓度Bcl-2为1∶1 500；Bax工作浓度为1∶8 000，Caspase 3工作浓度为1∶1 000，β-actin为1∶5 000；逆转录cDNA试剂盒（KR116）、荧光定量检测试剂盒（FP209）购自天根生化科技有限公司，rt-qPCR引物：Bcl-2引物（批号：2603688186）、Bax引物（批号：2603688183）、Caspase 3引物（2603688184）、β-actin引物（2603688180）购自生工生物工程股份有限公司。ELISA试剂盒购自江苏酶免实业有限公司（240657R）；Morris水迷宫、旷场实验箱（上海欣软）；蛋白成像分析系统（上海Tanon科技）；荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司）。

1.3.1 动物造模、分组与给药

将70只SD大鼠随机分为7组（每组10只）：空白组（Control）、50 mg⋅kg^-1⋅d^-1组（50 mg）、100 mg⋅kg^-1⋅d^-1组（100 mg）、150 mg⋅kg^-1⋅d^-1组（150 mg）、模型组（Model）、空白+BA组（Control+BA）、艾司唑仑组（Estazolam）0.2 mg⋅kg^-1⋅d^-1。其中空白+BA组中，BA予剂量150 mg⋅kg^-1⋅d^-1灌胃。以上分组除 Control、Control+BA组外，其余组通过改良多平台水环境法建立SD模型，每日从14：00至次日09：00进行19 h的睡眠剥夺，同时予BA连续灌胃21 d，每天1次，固定时间在早晨09：30，空白组予等体积生理盐水灌胃。

1.3.2 Morris 水迷宫实验

（1）大鼠的定位航行行为 实验于启动前5日开始，连续每日采用一致时间点，将实验对象大鼠自水迷宫四个象限分别投入，且确保其首次朝向池壁。通过软件预设，规定大鼠寻找平台的最长时限为1 min以内（即逃避潜伏期）。在此期间，若大鼠成功登上平台站立超过3 s，则记录其所需时间，并立即终止当次试验；反之，若大鼠未能在1 min内登上平台，逃避潜伏期则记为满时长60 s，并需研究者手动将其引导至平台上，使其停留20 s，以促进其学习与记忆的形成。（2）空间探索 于实验的第6天，去除平台。此时，将大鼠放置于与原平台位置相对的象限，并保持其朝向池壁，观测其在1 min内穿越原平台所在点的频次。

1.3.3 旷场实验

采用100 cm ×100 cm×50 cm实验箱，软件将箱体底部划分为9宫格，实验前将各组大鼠放入实验房间内熟悉环境60 min，实验时固定某一位置将各组大鼠依次放入旷场实验箱，记录SD大鼠5 min内在箱体四周行为轨迹的总路程和进入中央宫格次数等数据。整个实验过程保持安静，进行下1只大鼠实验之前用酒精擦拭实验装置，避免上1只大鼠留下的气味影响下1只大鼠的行为。

1.3.4 组织准备

每组分别取3只大鼠进行腹腔注射0.3%戊巴比妥钠溶液（0.15 mL/10 g）麻醉后，经过4%多聚甲醛灌注后，取全脑4%多聚甲醛溶液中固定，后续进行石蜡包埋，石蜡切片，切片厚度为5 μm，剩余大鼠生理盐水灌注后剥离海马， 海马保存于-80℃冰箱。

1.3.5 尼氏染色

常规方法组织脱水、蜡液浸泡及包埋、组织切片，保留厚度为5 μm，蒸馏水冲洗，放入提前配置好的甲苯胺蓝进行染色20 min，显微镜下观察SD大鼠海马CA1区神经细胞形态、数量并使用Image J 软件进行完整锥体细胞计数。

1.3.6 ELISA实验

大鼠腹腔注射麻醉，注射器取腹主动脉血2 mL，离心后采集上清液。 参照说明书进行实验操作。

1.3.7 蛋白印记法

将大鼠海马组织加入RIPA裂解液，研磨后4 ℃离心取上清液，BCA法测蛋白质浓度，变性后于-20 ℃冰箱内保存。电泳80 V恒压电泳55 min，调整为120 V恒压电泳80 min。后用300 mA恒流，转膜130 min，将样品以5%脱脂牛奶封闭处理1 h后，使用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min。随后，样品经4 ℃条件下与一抗孵育整夜，继而室温与二抗共反应2 h，并再次用TBST洗涤3遍。曝光完成后，借助ImageJ软件对蛋白条带的灰度值进行量化分析。

1.3.8 RT-qPCR

实验的样本制备涉及每组3只大鼠的海马组织制备匀浆。Trizol法提取总RNA并进行浓度测定，按照Fasking cDNA试剂盒说明书制备反转录。使用荧光定量试剂盒进行荧光定量扩增反应检测调亡相关蛋白mRNA相对表达水平，结果采用2^-ΔΔCt进行分析，引物序见列表１。

1.4 统计学方法

本研究中由Prism Graphpad 9.0软件完成统计图。统计分析采用SPSS 20.0软件，定量数据均以均数±标准误（mean±SEM）表示。单因素方差分析进行多组间比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

黄芩苷作用靶点与SD疾病交集靶点的获取 通过SwissTargetPrediction 数据库预测BA有效靶点，共得到100个有效靶点。 利用检索GeneCards、OMIM数据库得到SD相关靶点，剔除重复基因，共得到有效靶点3 253个。 通过构建Venn图预测BA有效成分及SD共有靶点，得到BA相应的100个靶基因与SD相关的3 253个靶基因，获取其交集基因52个，见图１。

2.1.1 构建“药物活性成分-疾病-靶点”及PPI网络

运用Cytoscape软件，一个靶点可对应多个BA活性成分，同时一个活性成分也可对应多个靶点，见图２。利用STIRING平台及Cytoscape软件中制作得到PPI图，并根据平均度值筛选前10核心靶点。CASPASE 3与SD密切相关，见图3A、B。

2.1.2 BA改善SD的核心靶点GO、KEGG富集分析结果

数据库David进行GO、KEGG富集分析。GO富集分析生物过程共收集2 707个。KEGG富集通路中凋亡与SD密切相关， 将GO富集分析排名前6的BP、CC、MF及KEGG排名前20富集分析条形图可视化，见图3C、D。

2.2 动物实验结果

2.2.1 Morris水迷宫实验

（1）定位航行实验 与Control相比，Model组在第2天逃避潜伏期下降最快，在第3、第4、第５日逃避潜伏期显著增加（P<0.05）。在第3、第4、第5日，BA组及Estazolam组的大鼠其逃避潜伏期同Model组比较有显著缩短（P<0.05）。（2）空间探索实验 相较于Control，Model组大鼠穿越平台次数显著减少（P<0.01）。而对于Model组来说，BA组及Estazolam组的大鼠穿越平台次数显著增加（P<0.05）。Control与Control+BA比较无显著差异（P>0.05）。见图4。

2.2.2 旷场实验

大鼠在四周总运动的距离，与Control组比较，Model组大鼠四周总运动距离增加（P<0.05），与Model组比较，BA组及Estazolam组大鼠在四周总运动距离减少且在150 mg组表现出显著差异（P<0.01），Control组与Control+BA组比较差异无统计学意义；大鼠进入中央区域次数 与Control组比较，Model组大鼠进入箱体中央区域次数明显减少（P<0.01），与Model组比较，BA组及Estazolam组大鼠进入中央区域次数增加（P<0.05），在50 mg组中无统计学意义；Control组与Control+BA组比较无显著差异（P>0.05）。见图5。

2.2.3 尼氏染色

Model组镜下海马CA1区神经元细胞可见排列疏松，大量变性坏死，神经元细胞严重缺失。BA组及Estazolam组海马CA1区细胞排列相对于Model组来说较为紧密，并可见少许坏死的细胞。与Control组相比，Model组海马CA1区神经元显著减少（P<0.01），BA组及Estazolam组海马CA1区神经元数目明显增多（P<0.05）。Control组与Control+BA组比较无统计学意义（P>0.05）。见图6。

2.2.4 BA对血清褪黑素（MT）的影响

MT是松果体合成和分泌具有调控昼夜节律的内分泌激素，先前的研究假设褪黑激素节律失调是睡眠和昼夜节律紊乱背后的驱动力^［12］。ELISA实验结果，与Control组比较，Model组血清MT明显减少（P<0.05），同时说明睡眠剥夺模型造模成功。与Model组比较，BA组和Estazolam组血清中MT显著增加（P<0.05）。见图7。

2.2.5 Western blot

利用KEGG富集分析检索信号通路以及查阅相关文献可知，Caspase 3的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax^［13］。通过对各组实验大鼠海马组织中上述凋亡蛋白进行检测，研究结果显示，与Control组相较而言，Model组大鼠海马中的Caspase 3及Bax蛋白的表达量显著增加（P<0.05），而Bcl-2的表达水平则显著下降（P<0.05）。此外，与Model组对比，使用BA治疗和Estazolam干预的分组中，Caspase 3及Bax蛋白的表达显著升高（P<0.05），Bcl-2的表达呈下降趋势（P<0.05）。见图8。

2.2.6 RT‑qPCR

进一步通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析海马组织中Bcl‑2与Caspase 3 mRNA的表达影响，结果表明，在与Control组的比较中发现，Model组的Bcl-2 mRNA的表达下降（P<0.05），而BA组及Estazolam能够显著增加Bcl-2以及Caspase 3 的mRNA表达（P<0.05）。与Model组相比，BA及Estazolam可以显著下调Caspase 3 mRNA的表达（P<0.05）。Control组与Control+BA组比较无显著差异（P>0.05）。见图9。

2.2.7 生化检验BA对血清中氧化应激因子的影响

在以往的研究中发现，SD除了导致神经元细胞凋亡外，还可以导致细胞的氧化应激反应^［14］，长期SD可导致活性氧的不断积累而发生氧化应激反应^［15］。该实验为了评估大鼠血清内抗氧化酶的活性，通过生化方法检验超氧化物歧化酶（superoxide Dismutase， SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione Peroxidase， GSH-Px）以及丙二醛（malondialdehyde， MDA）的水平变化，结果显示，Model组的SOD和GSH-Px的活性显著下降（P<0.05），BA相对于Model组可上调SOD、GSH-Px的表达（P<0.05）；而在MDA结果中，Model组MDA表达显著升高（P<0.05），BA、Estazolam可明显下调MDA表达水平（P<0.05）。Control组与Control+BA组无显著差异。以上结果说明SD大鼠体内抗氧化防御系统功能的减弱。见图10。

3 讨论

本次实验通过网络药理学预测BA改善由SD诱导的认知功能障碍的相关靶点及可能信号通路，并对预测所得通路机制进行动物实验研究。利用网络药理学GO富集分析得到凋亡的调节过程。神经元细胞维持正常的凋亡水平对神经元的正常代谢具有重要意义。网络药理学KEGG富集分析得到Caspase 3蛋白与SD密切相关，细胞凋亡可被视为Bax/Bak孔或caspase激活诱导的细胞死亡，神经元内生性凋亡的诱导完全依赖于Bax的表达和激活，在许多体外和体内神经退行性疾病模型中，Bax的缺失和抑制确实可以防止异常的神经元细胞死亡^［16］。仅含BH3结构的蛋白（BH3-only protein，BH3-only）蛋白是Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白组，通过引起Bax的去抑制诱导细胞凋亡。使Bax同质寡聚和线粒体外膜渗透的发生。Bax介导的线粒体外膜渗透可以引起神经元损失^［16］。在线粒体外膜渗透的诱导下，凋亡细胞中原caspase-9分子的募集允许自裂解产生成熟的caspase-9， caspase-9反过来裂解并激活原caspase-3。caspase-3和其他执行子caspase可切割大量靶蛋白，介导细胞凋亡的系统分解。

在《黄帝内经》中就有“不得卧”、“目不瞑”、“卧不安”的论述。睡眠对所有生物都至关重要，因为它占了我们生命的三分之一，当SD发生时，会对生活质量和白天的功能产生显著的负面影响。睡眠在促进学习和巩固记忆的恢复过程中发挥着重要作用，睡眠中断可以引起机体功能下降，比如情绪易激惹、注意力不集中、认知功能障碍以及学习记忆能力下降等。Huang等^［6］的研究表明，BA参与多种调节功能，包括细胞凋亡和抗氧化应激等调控。因此本实验探究BA通过调控凋亡蛋白和氧化应激基因改善SD诱导的认知功能障碍。水迷宫实验结果提示BA可以改善SD的空间记忆认知功能；旷场实验结果表明BA一定程度上可改善缓大鼠的焦虑行为，尼氏染色观察到BA可以明显改善海马CA1区神经元损伤；ELISA实验结果显示，由睡眠剥夺导致SD大鼠体内MT水平下降，这一结果可以说明本次实验成功构建睡眠剥夺模型，同时也表明睡眠剥夺一定程度地影响MT的分泌；BA组大鼠血清MT同模型组比较显示上升趋势；此外，BA组大鼠海马Caspase 3、Bax蛋白表达明显上调，Bcl-2则下调；BA组显著改善了细胞的凋亡状态，并上调了Bcl-2 mRNA的表达及下调Caspase 3 mRNA的表达；在生化实验中BA组改善了SD大鼠体内抗氧化防御系统功能。以上结果表明BA可以通过调控Bcl-2/Bax/Caspase 3信号通路的凋亡作用改善SD大鼠的认知功能障碍，同时，该实验还探讨了BA可能通过氧化应激作用改善了由SD诱导的认知功能障碍，这两者之间有着密切联系，但其具体发生、发展机制仍有待进一步验证。

作者贡献度说明：

向桂珍，网络药理学、组织学取材、起草论文；秦明凯：动物饲养、行为学实验；杨占君：研究思路、实验设计；孙毅红：组织学实验；闫旭升：实验指导、审校；贾建新：分子生物学实验。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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