结合网络药理学和体外实验探究半边旗抑制鼻咽癌的机制

Exploring the antitumor effects of Pteris semipinnata L on nasopharyngeal carcinoma based on network pharmacology and in vitro experiments

摘要

目的 本文拟通过网络药理学结合体外实验探究半边旗（Pteris semipinnata L，PsL） 的抗鼻咽癌作用及其机制，为后续研究提供依据。 方法 根据文献获得PsL主要活性成分，在PharmMapper数据库获取PsL主要成分相关基因，并从GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD和CTD数据库获取鼻咽癌疾病基因。将药物与疾病的交集基因导入至String平台构建蛋白互作（PPI）网络，通过PPI网络筛选出核心靶点。结合生物信息学对核心靶点进行分析，将筛选出的核心靶点与PsL成分进行分子对接并将结合能低的对接结果进行可视化。同时进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。利用PsL提取物作用于鼻咽癌Hone1细胞，采用CCK‑8方法检测细胞增殖；Calcein/PI荧光染色检测细胞活性；Annexin V‑FITC流式双染检测细胞凋亡，并使用Western blot检测蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（p‑AKT）、非受体型酪氨酸蛋白激酶（SRC）蛋白表达的变化。 结果 获得PsL与鼻咽癌交集基因共115个。其中，SRC、MAPK1以及RHOA 可能是鼻咽癌治疗的关键靶点。生物信息学分析结果显示SRC在鼻咽癌中异常高表达，分子对接结果显示β‑胡萝卜苷、芦丁和芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷与SRC的结合能较低。富集结果分析表明PsL可调节PI3K‑AKT信号通路。体外实验结果显示半边旗水提取物可抑制鼻咽癌Hone1细胞增殖及活性，并促进Hone1细胞凋亡。半边旗水提取物可明显下调SRC和p‑AKT蛋白的表达。 结论 PsL可通过负向调控SRC‑AKT信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖、促进其凋亡。

Abstract

Objective This paper intends to investigate the anti‑nasopharyngeal carcinoma effect of Pteris semipinnata L （PsL） and its mechanism through network pharmacology combined with in vitro experiments， which will provide a basis for subsequent studies. Methods The main active ingredients of PsL were obtained from literatures， and the genes related to the main ingredients of PsL were obtained from the PharmMapper database， and the genes of nasopharyngeal carcinoma diseases were obtained from GeneCard， OMIM， PharmGkb， TTD and CTD databases. The intersection genes of drugs and diseases were imported into the String platform to construct protein‑protein interactions （PPI） network， and the core targets were screened through the PPI network. The core targets were analyzed by bioinformatics， and the molecular docking of the screened core targets was performed and the docking results with low binding energy were visualized. Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyses were also performed. Nasopharyngeal carcinoma Hone1 cells were acted on using PsL extracts， and cell proliferation was detected by CCK‑8 method； cell activity was detected by fluorescent staining with Calcein/PI； apoptosis was detected by flow double staining with Annexin V‑FITC， and protein kinase B （AKT）， phosphorylated AKT （p‑AKT）， and non‑receptor‑type tyrosine protein kinase （SRC） protein expression were detected by using Western blot. Results A total of 115 genes intersecting with nasopharyngeal carcinoma at PsL were obtained. Among them， SRC， MAPK1， and RHOA may be the key targets for nasopharyngeal carcinoma treatment. Bioinformatics analysis showed that SRC was overexpressed in nasopharyngeal carcinoma tissues， and molecular docking results showed that β‑carotene， rutin and apigenin‑7‑O‑β‑D‑glucopyranoside glucoside had low binding energy to SRC. The analysis of enrichment results indicated that PsL could regulate PI3K‑AKT and other signaling pathways. In vitro experiments showed that the aqueous extract of PsL could inhibit the proliferation and activity of Hone1 nasopharyngeal carcinoma cells and promote the apoptosis of Hone1 cells. The aqueous extract of PsL significantly down‑regulated the expression of p‑AKT and SRC proteins. Conclusion PsL can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells by negatively regulating the SRC‑AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

半边旗 / 鼻咽癌 / 网络药理学 / SRC‑AKT信号通路

Key words

Pteris semipinnata L. / Nasopharyngeal carcinoma / Network pharmacology / SRC‑AKT signaling pathway

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种多发于东亚和东南亚的恶性肿瘤，在我国南方地方尤其高发。目前NPC的主要治疗方法是放疗 ^［1］，但NPC发现时多处于中晚期，该阶段部分患者对放疗不敏感，导致肿瘤复发和转移^［2］，因此需要辅助化学药物治疗。但部分患者也会对化学药物产生耐药性，从而导致疗效不佳，并且会产生不良反应^［3］。

半边旗（Pterissemipinnata L，PsL）属凤尾蕨科植物，是我国传统中药，一般以全草入药。在《岭南采药录》中有对半边旗的记载“凡毒蛇咬伤，可将叶捣烂和片糖敷：治疮疖，煎水洗”；在《南宁市药物志》中记载PsL有“止血，生肌，消肿，止痛。治跌打，痢疾，发背，蛇伤”等功能。PsL含有多种活性成分，其中在抗肿瘤方面研究最多的成分为二萜类化合物5F，其具有十分显著的抗肿瘤活性且无明显的毒性^［4］。研究发现PsL中的5F可抑制人结肠癌细胞的增殖、凋亡和自噬^［5］。此外，PsL还具有抗炎、抗瘢痕等多种作用 ^［6］。但目前对于PsL的研究大都是基于其特定成分及单体，对其整体药效的研究尚缺乏。

网络药理学主要通过相关数据库获得药物和疾病的相关靶点，通过相关软件进行分析，找到药物作用于疾病的关键靶点、作用途径等信息，从而可以阐明药物的整体靶点、对疾病的总体作用。网络药理学可更快找到药物作用的可能途径，并且通过实验验证可进一步明确药物作用的具体通路。如吴婉婉等人利用网络药理学对茯苓酸治疗心肌纤维化的作用进行预测，并结合体外实验进一步研究并验证其作用机制，为药物治疗心肌纤维化提供了依据 ^［7］。本研究拟通过网络药理学和体外实验的方式研究PsL对NPC细胞的作用，为半边旗的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人鼻咽癌Hone1细胞由广东医科大学肿瘤研究所提供。

1.1.2 实验药物

半边旗水提取物（西安明朗生物科技有限公司，批号：ML20221215‑1）经超纯水溶解制成浓度为24.6 mg/mL的母液，用0.22 μm的无菌滤膜除菌，放在4 ℃冰箱中保存，临用前用水稀释。

1.1.3 试剂

DMEM培养基、胎牛血清（Gibco，批号：8122340、2324371）；胰蛋白酶（Solarbio，批号：20220316）；PBS缓冲液、青霉素‑链霉素溶液（Procell，批号：WH0022U091、WH2622F081）；CCK‑8试剂盒、Annexin V‑FITC细胞凋亡检测试剂盒、Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、细胞蛋白裂解液（Beyotime，批号：071422230206、120722230309、062922230208、122822230209）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Elabscience，批号：PA048LTR7455）；β‑actin、pan‑AKT、p‑AKT、SRC抗体（Affinity，批号：54o2802、34d5382、20t9742、3b49457）。

1.1.4 仪器

细胞培养箱（Thermo）；Epoch全波长酶标仪（BioTek）；IX70荧光倒置显微镜（Olympus）；DxP Athena流式细胞仪（Cytek）；Tanon 5200全自动化学发光仪（上海天能公司）。

1.2 半边旗相关成分的收集与靶点整理

由于在中药相关数据库中找不到半边旗的相关成分和靶点，于是通过阅读文献获得半边旗的相关活性成分。随后通过PubChem数据库（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得文献中报道成分的2D结构的sdf文件，将其导入到PharmMapper^［8］数据库中（http：//www.swisstargetpre diction.ch/），设置参数，选择“Human Protein Targrts Only”从而获得Uniplot的基因ID。筛选相关性≥0.5的基因ID，输入到Uniplot（https：//www.uniprot.org/uploadlists/）中进行ID转换，通过相应R包去除重复项，从而得到半边旗活性成分的靶基因。

1.3 疾病相关基因的获取

为获得鼻咽癌（NPC）靶点，使用“nasopharyngeal carcinoma”作为关键词检索了以下5个数据库：GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD和CTD。通过合并搜索结果，删除重复项，获得NPC相关靶基因。

1.4 靶基因预测

将获得的PsL有效成分作用的靶点与NPC相关靶点取交集，利用R软件绘制两者交集的Venn图。从而获得PsL与NPC的共有基因，确定PsL治疗NPC的潜在靶点，为后续分析做准备。

1.5 药物‑疾病靶点网络的构建

将PsL的活性成分信息及其与NPC的交集基因结果导入Cytoscape中，构建活性化合物与NPC靶点网络。然后利用Cytoscape软件分析了网络的拓扑性质，包括度、介数中心性和接近中心性。

1.6 蛋白质相互作用网络（PPI）的构建及核心基因的筛选

将PsL和NPC的共同基因靶点导入STRING数据库，选择物种为人，置信水平为0.9，网络中隐藏断开的节点，进行了PPI网络分析，并以TSV格式下载结果。然后将文件导入Cytoscape进行拓扑分析，并采用CytoNCA计算用于评价相互作用网络内节点拓扑性质的6个参数。其中包括：“度中心性”（DC）、“中介中心性”（BC）、“接近中心性”（CC）、“特征向量中心性”（EC）、“网络中心性”（NC）和“局部平均连通性”（LAC）。这六个参数用于指示节点的性质并确定它们在网络中的重要性。具有高DC、BC、CC、EC、NC和LAC值的节点被认为在网络中起重要作用。根据PPI网络拓扑性质的结果，选取中位数以上的靶标作为核心靶标，进行了3次筛选试验。从而得到网络中的核心基因。

1.7 靶点的生物信息学分析及分子对接

从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取GSE53819（N18‑T18）共36个NPC样本的基本信息。采用Wilcoxon检验来确定筛选的核心基因在正常组（n=18）与肿瘤组（n=18）之间的表达量是否存在统计学差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

通过生物信息学分析得到异常高表达的基因，并与PsL的成分进行分子对接，将结合能最低的3种成分的分子对接结果进行可视化，具体操作为：将获取成分靶点中下载的2D结构的sdf文件通过Chem3D软件转换为.mol2格式。然后从UniPort数据库中找到protein并将Popular organisms设置为Human，搜索筛选出的核心靶点，找到核心靶点对应蛋白的PDB Entry，通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载蛋白的3D晶体结构，并且用PyMol软件对3D结构进行相应的处理，使用PDBFixer软件对3D结构进行修复。运用PyRx软件将药物成分与核心靶点进行分子对接，获得靶点与成分对接的结合能，根据结合能大小制作热图，热图中与靶点结合能最低的分子对接进行可视化。

1.8 GO和KEGG通路富集分析

使用R语言程序和 Bioconductor 数据库（https：//www. bioconductor.org/）中的“org. Hs. eg. db”人类数据库和“clusterProfiler”、“DOSE”、“enrichplot”和“stringi”包，对疾病和药物的交集靶点以“P=0.05，Q=0.05”进行GO 和KEGG功能富集分析。

1.9 实验验证

1.9.1 CCK‑8细胞增殖实验

将Hone1细胞以5×10⁴个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔加入100 μL的细胞悬液在孵箱中培养24 h后，分别加入终浓度为0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL的PsL处理Hone1细胞24 h和48 h，同时设立空白组和对照组。对于CCK‑8实验，每孔中加入10 μL的CCK‑8溶液，放入37 ℃孵箱中孵育3 h，使用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值（OD值）。

1.9.2 细胞活性实验

将Hone1细胞按上述方法接种于96孔板中，药物作用细胞48 h后进行检测。检测前先用PBS清洗细胞一次后，每孔加入100 μL Calcein AM/PI检测工作液，37 ℃避光孵育30 min，即可在荧光显微镜下检测。

1.9.3 细胞凋亡实验

将Hone1细胞以5×10⁵个/mL的浓度接种于6孔板中，并放入孵箱内孵育24 h后，选择48 h的IC₅₀以下的浓度0、0.4、0.8 mg/mL的PsL处理Hone1细胞。将细胞收集于离心管中，加入195 µL Annexin V‑FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 µL Annexin V‑FITC，轻轻混匀后加入10 µL碘化丙啶（PI）染色液，用流式细胞仪对结果进行检测。

1.9.4 SRC‑AKT通路相关蛋白的检测

将Hone1细胞按上述方法接种于6孔板中，分别用终浓度为0、0.4、0.8 mg/mL的PsL处理细胞。药物作用48 h后，用PBS清洗细胞3次，加入裂解液使细胞充分裂解。细胞裂解完成后收集并离心，获取上清液。通过煮沸使上清液中收集的蛋白变性，利用十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转移至PVDF膜后封闭10 min，孵育一抗过夜。洗膜3次后加入二抗，孵育1 h，洗膜，加入发光试剂并用仪器进行检测。

1.10 数据分析

使用统计学软件GraphPad Prism 8.0.2对数据进行分析处理，所有结果以平均数±标准误（\overline{x}\pm s）表示，各组间数据的比较采用单因素方差分析的方法，检验水平 α=0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PsL相关活性成分及靶点

通过阅读文献发现了目前研究获得的PsL相关成分，而能够在PubChem中找到2D结构的成分包括Zhan等^［9］发现的2R‑norpterosin B、周星宏等^［10］发现的paniculoside Ⅲ、ent‑ 11α‑ hydroxy‑ 15‑ oxokaur‑ 16‑ en‑ 19‑ oic acid（5F）、芹菜素以及李慧等^［11］获得的芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷、槲皮素‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷、芦丁、没食子酸、β‑谷甾醇、β‑胡萝卜苷、表没食子儿茶素、岩白菜素、原儿茶酸、反式咖啡酸，成分的基本信息如表1所示，后续研究基于以下14种成分进行。通过Uniplot进行ID转换，用R包进行去重后得到半边旗相关成分的基因一共313个。

2.2 NPC相关靶点及交集靶点的筛选

通过整理GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD和CTD 5个数据库收集到的NPC的信息，一共获得2 341个NPC的靶基因，如图1A所示。接着将半边旗有效成分相关的313个基因与NPC的2 341个基因取交集，共获得115个交集基因。见图1B。

2.3 药物‑疾病靶点网络的构建

通过Cytoscape构建了PsL相关成分与NPC靶点的网络，14种PsL成分和313个NPC靶点的对接结果，见图2。产生的网络图中一共有329个节点和1 711条边的网络，节点之间复杂的相互作用表明一种或多种PsL活性成分与NPC的单个靶基因相关，多个靶点也与相同的活性成分相对应，这表明PsL可能作用于多个NPC相关靶点。

2.4 PPI网络的构建及核心基因的筛选

通过STRING处理获得PsL成分的NPC靶点，从而构建PPI网络，根据置信水平0.9过滤得到90个节点和207条边的网络，见图3A。根据BC、CC、DC、EC、NC和LAC参数在Cytoscape中对网络进行评分，显示第1轮筛选的阈值为DC大于3、EC大于0.170、LAC大于1、BC大于15.139、CC大于0.210和NC大于2，结果显示25个节点和98条边；接着对以上节点进行第2次评分，第2轮筛选的阈值为DC大于7，EC大于0.148，LAC大于3.428，BC大于7.077，CC大于0.571，NC大于4.266，这些结果显示了10个节点和32条边；最后对以上节点进行第3次评分，第3轮筛选的阈值为DC大于11，EC大于0.247，LAC大于4.376，BC大于27.383，CC大于0.649，NC大于7.166，这些结果显示了3个节点和3条边，最后筛选得到的3个节点分别为非受体酪氨酸激酶（SRC）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A（RHOA）。这3个基因可能为PsL治疗NPC的主要靶点。见图3B。

2.5 GO和KEGG功能富集分析

使用Bioconductor R软件包对关键靶点进行GO富集分析，设定P<0.05进行筛选，结果显示PsL治疗NPC主要涉及激酶活性的正向调节、细胞增殖、伤口愈合等生物过程（biological process，BP），涉及的细胞组成（cellular component，CC）包括膜筏、膜微域、黏着斑等，影响的分子功能（molecular function，MF）主要集中在蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、内肽酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性等，BP、CC、MF前10个项目如图4A所示。

对PsL靶点进行KEGG富集分析，发现涉及PI3K‑Akt信号通路、MAPK信号通路、EGFR信号通路等，其中富集在PI3K-Akt信号通路的靶点数最多，这些通路在NPC的发生、发展过程中发挥重要作用，在图4B中显示了前30个KEGG富集结果。

2.6 生物信息学分析及分子对接验证

通过GEO数据库，利用生物信息学分析SRC、MAPK1和RHOA 在NPC和癌旁组织中的表达情况。结果发现，与癌旁组织相比，SRC在NPC中异常高表达，而MAPK1、RHOA在NPC中表达无升高（资料未显示）（图5A）。因此SRC可能是NPC的主要治疗靶点，所以将SRC与半边旗中14个成分进行分子对接，从而获得结合能的热图，见表2。从热图中可以看出与SRC结合能最低的化合物分别为：β‑胡萝卜苷（PsL8）、芦丁（PsL9）与芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷（PsL10），它们的结合能分别为-9.9 kcal/mol、-10.7 kcal/mol和-9.3 kcal/mol，因此对这3种成分与SRC的分子对接用pymol进行可视化，如图5C‑E所示，由于β‑胡萝卜苷与SRC的对接结果不存在氢键，因此根据Discovery Studio软件中的2D图绘制了β‑胡萝卜苷与SRC间的π‑σ （pi‑sigma）键即150（PHE）号位点，见图5B。

2.7 PsL对NPC细胞的抑制作用

CCK‑8实验结果显示，随着浓度的增加，PsL对NPC细胞Hone1增殖的抑制作用逐渐增强，并且作用时间越长其抑制作用越明显（图6）。其中24 h的IC₅₀值为1.49 mg/mL，48 h的IC₅₀值为0.93 mg/mL。结果表明，PsL对NPC细胞的生长具有一定的抑制作用，并呈浓度和时间依赖性。

PsL作用NPC Hone1细胞48 h后，对细胞活性的影响，见图7。从图中看出随着药物浓度的增加，死亡细胞的比例增加，结果表明PsL可抑制Hone1细胞活性。

2.7 PsL可促进NPC细胞凋亡

细胞凋亡实验结果显示，在PsL提取物作用于NPC Hone1细胞48 h后，对细胞的凋亡产生了一定的影响。随着药物浓度的增加，细胞的凋亡率逐渐增加，见图8。与对照组相比，浓度为0.8 mg/mL PsL提取物组Hone1细胞凋亡率明显提高（P<0.05）。

2.8 PsL 抑制Hone1 细胞SRC‑AKT 信号通路关键蛋白的表达

随着PsL浓度的增加，p‑AKT蛋白的表达量逐渐下降，与对照组相比，结果具有显著性（P<0.05）。并且SRC蛋白的表达量也随浓度的增加逐渐减少，与对照组相比，0.8 mg/mL的PsL结果具有显著性差异。据此推测，PsL可能通过抑制SRC‑AKT通路从而抑制NPC细胞生长，见图9。

3 讨论

NPC是一种浸润性高、转移性强的肿瘤，发现时往往已发生局部或远处转移^［12］。在NPC的治疗中局部放疗加化疗可提高NPC患者的生存率^［13］，但部分NPC患者对化疗不敏感，或不能承受高剂量化疗的副作用。研究显示，中医对NPC治疗有一定作用^［14］，鉴于PsL成分的广泛抗癌作用，PsL在NPC治疗中有较大应用潜力。

目前对于PsL二萜类化合物5F的研究较多，有研究发现，5F对NPC细胞有一定的作用，其能通过诱导NPC细胞凋亡从而发挥抗肿瘤活性。Wu等^［16］现已发现5F能够通过下调NF‑κB信号通路的传导从而促进NPC细胞CNE‑2Z的凋亡。但该研究中只是对PsL中的某一种成分进行研究，而没有体现各种成分之间的协同作用，并且也未明确其作用机制，因此本研究拟采用网络药理学方法分析其抗NPC的作用，并探讨其机制。

在本研究中，首先根据文献报道，并结合PubChem数据库中能够找到2D结构的PsL的相关成分，归纳总结了PsL的14种相关成分，通过网络药理学分析发现PsL靶向NPC的潜在靶点有115个。通过核心靶点的筛选获得了MAPK1、RHOA和SRC 3个核心基因。并进一步通过生物信息学分析发现SRC基因在NPC中表达上调，提示PsL很可能通过调控SRC基因发挥抗NPC的作用。SRC属于非受体蛋白络氨酸激酶的一种，在细胞信号转导过程中具有重要作用，对于肿瘤的发生和转移等过程有影响，并且癌症中SRC 的激活提示不良的临床预后^［17］。肿瘤转移是NPC治疗 的困难所在，其中SRC 会诱导上皮间质转化从而增强NPC细胞的转移能力，因此抑制SRC 能够一定程度上控制NPC 的进展^［18］。Zhang等^［19］发现，SRC过表达会促进NPC细胞的存活、集落形成和上皮间质的转化，使细胞迁移和侵袭的能力增加。Chuang等^［20］在研究丹参酸A对NPC的作用时发现，其可能通过阻碍SRC的激活抑制NPC细胞的侵袭和转移。结合生信和靶点筛选结果，PsL可能通过抑制SRC靶点发挥抗 NPC 的作用。

为了进一步探讨PsL抗NPC机制与SRC基因及相关信号通路，进行了功能富集分析。通过GO富集分析表明生物过程和细胞组成主要集中在激酶活性的正向调节、伤口愈合、膜筏、膜微域等方面。随后通过KEGG富集分析结果发现，PsL治疗NPC涉及多个信号通路，其中PI3K‑AKT信号通路富集的靶点最多，提示PsL抗NPC作用与PI3K-AKT通路相关。PI3K‑AKT信号通路的异常激活对于肿瘤的发展关系密切^［21］，该信号通路在癌细胞增殖、分化和凋亡中起着重要作用，会促进癌症的发展，其中AKT蛋白磷酸化是该信号通路活化的重要标志^［22］。PI3K‑AKT信号通路作为一条经典的通路，该通路的异常激活不仅对NPC细胞的迁移起到关键作用^［23］，并且会促进NPC的发展^［24］。研究发现，SRC为PI3K‑AKT信号通路的上游诱导剂^［25］。并且SRC‑PI3K‑AKT通路是调节和促进多种人类恶性肿瘤发展的重要通路，其通路的激活可以促进癌细胞的增殖、存活和侵袭等^［26］。结合核心靶点筛选以及富集分析结果，推测PsL可能通过抑制SRC靶点从而抑制PI3K‑AKT信号通路的激活发挥抗NPC的作用。

在体外实验中，先使用不同浓度的半边旗水提取物作用于NPC细胞，观察其对细胞增殖、凋亡的影响。通过细胞增殖、活性、细胞凋亡实验，发现半边旗水提取物对NPC Hone1细胞增殖和活性有一定抑制作用，并可促进细胞凋亡。同时，根据筛选出的核心基因和信号通路，进一步验证PsL是否通过SRC刺激AKT通路来发挥抗NPC的作用。蛋白印迹实验结果表明，PsL可抑制SRC‑AKT通路的关键蛋白SRC和p‑AKT的表达及其活化，并呈剂量依赖性，表明PsL可通过抑制SRC‑AKT信号通路抑制NPC细胞的增殖、促进其凋亡。结合网络药理学和分子对接分析及蛋白印迹实验结果推断，半边旗水提取物可通过抑制SRC‑AKT通路活化从而发挥抗NPC的作用。

本研究通过网络药理学结合实验验证的方式对PsL提取物抗NPC的作用进行了研究，为NPC 治疗提供了新思路。本研究表明PsL可以通过多成分、多靶点抑制NPC细胞的增殖、促进其凋亡，这些作用可能与PsL负向调控SRC‑AKT通路有关。本实验为PsL的抗肿瘤作用研究提供了新的视角。

作者贡献度说明：

谭靖怡：文章整体设计、撰写以及相关实验操作、数据整理；胡莹莹：提供部分实验指导；陈妹：实验结果图的制作；王燊：部分实验的数据分析；陈雅娟，马泽欣，翁逸珊：数据收集；叶晓霞：指导文章撰写；吴民华：文章修改，论文整体的把控。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

广东省自然科学基金项目(2019A1515012007)

广东省大学生攀登计划项目(pdjh2023b0233)

广东医科大学大学生创新创业项目(GDMU2023378)