葛花作用于Casp3调控细胞自噬干预肝癌的机制研究

Mechanism of Pueraria lobata in regulating liver cancer via Casp3‑mediated cellular autophagy

摘要

目的 基于网络药理学和实验验证探讨葛花通过调控细胞自噬干预肝癌的作用机制。 方法 通过细胞增殖、划痕实验探索葛花含药血清对HepG2细胞的影响。使用TCMSP数据库获取葛花靶点，从OMIM等数据库获得肝癌疾病靶点，从HADb数据库获得细胞自噬基因，三者取交集后进行蛋白互作（PPI）、GO、KEGG富集分析，并筛选出Degree前15靶点。对筛选出的15个靶点进行差异表达、ROC曲线、临床相关性、生存预后、分子对接和分子动力学模拟分析。对最终筛选出来的靶点进行Western Blot验证，并检测自噬标志物LC3B的表达变化。 结果 葛花含药血清可以显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移。葛花抗肝癌的最重要靶点是Casp3，Casp3可以和葛花活性成分槲皮素（quercetin）稳定结合。与HepG2对照组相比，葛花含药血清组可显著下调Casp3蛋白表达，上调自噬标志物LC3BⅡ/ LC3BⅠ。 结论 葛花可通过作用于Casp3调控细胞自噬而干预肝癌。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of intervention of Pueraria lobata in hepatocellular carcinoma by cellular autophagy based on network pharmacology and experimental validation. Methods The effects of medicated serum of Pueraria lobata on HepG2 cells were explored by cell proliferation and scratch experiments. The TCMSP database was used to obtain the target of Pueraria lobata， the target of liver cancer disease from OMIM and other databases， and the autophagy gene of cells from the HADb database， and the protein interaction， GO and KEGG enrichment analysis were carried out after the intersection of the three targets， and the top 15 targets of Degree were screened. The 15 screened targets were analyzed by differential expression， ROC curves， clinical relevance， survival prognosis， molecular docking and molecular dynamics simulation. The final screened targets were verified by Western blot， and the expression level of LC3B in different doses was detected. Results Pueraria lobata medicated serum could significantly inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells. The most important target of Pueraria lobata against liver cancer was Casp3， which can be stably bound to quercetin， the active ingredient of Pueraria lobata. Compared with the HepG2 control group， the expression of Casp3 protein in the Pueraria lobata sera group was significantly down‑regulated， and LC3BII/LC3BI was significantly increased. Conclusion Pueraria lobata can intervene in liver cancer via Casp3 mediated cellular autophagy.

Graphical abstract

关键词

肝癌 / 葛花 / 细胞自噬 / Casp3

Key words

Liver cancer / Pueraria lobata / Cellular autophagy / Casp3

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种高死亡率的原发性肝癌，据统计，HCC已成为全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，且在我国恶性疾病发病率排名第五，死亡率排名第二^［1］。临床报道，乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、吸烟、饮酒、肥胖、黄曲霉素和代谢异常等均为HCC的危险因素^［2］。自噬作为一种重要的细胞代谢途径在癌症的发生、发展中扮演着重要的角色^［3，4］。自噬通过维持细胞内环境稳定、清除异常蛋白和降低细胞代谢水平等方式，对肝癌细胞的生长和转移产生影响^［5］，通过调控细胞自噬抗肝癌治疗已成为新的研究热点^［6］。目前研究已证实自噬与癌前病变、癌细胞增殖及其抑制关系十分密切^［7］，而自噬在肿瘤的发生、发展中具有十分复杂的作用^［8］，自噬也在癌症治疗中具有双面性：即可抑制癌症的发生、发展，也可促进癌症的发生、发展^［9］。当细胞自噬发生时，胞浆型LC3（LC3Ⅰ）酶解掉一段多肽，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，转变为膜型的LC3Ⅱ。因此可以通过LC3BⅡ/ LC3BⅠ的比值大小估计细胞自噬水平的高低^［10］。一般认为，LC3BⅡ/ LC3BⅠ的比值大于1时即有自噬发生^［11］。

研究表明，中药能通过多靶点、多途径、多机制抑制HCC的发生、发展^［12］。葛花，豆科植物野葛、甘葛藤的花，性味甘平，善解酒毒，具有醒脾、胃解渴之效。现代药理研究发现，葛花可通过多条信号通路促进细胞自噬来抑制肝癌细胞增殖^{［13，14］}，其主要成分槲皮素（quercetin）也可调控肝癌细胞的自噬过程^{［15，16］}。葛花对于肝癌的作用机制仍有待全面阐释。基于此，本文拟利用网络药理学、生物信息学、分子对接和分子动力学模拟分析及体外细胞实验验证等手段探究葛花对HCC自噬的调控机制，为葛花治疗HCC提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物、试剂与仪器

葛花购自贵阳同仁堂药店（北京本草方源药业集团有限公司，规格：1 kg/袋，批号：20210518，质控标准：《北京市中药饮片炮制规范》2008年版），由贵州中医药大学肖承鸿高级实验师鉴定。按料液比1∶10水煎，先浸泡30 min，再武火煎煮30 min，文火1 h，浓缩制备成水煎液（生药浓度1 g/mL）备用。Caspase‑3（Bioswamp，PAB43959）、LC3A/B（Affinity Biosciences，AF5402）、二抗 （Bioswamp，SAB48168）、β‑actin（景杰生物，PTM‑5028）、SDS‑PAGE 凝胶制备试剂盒（Solarbio，P1200‑1）、显影剂（Millipore，WBKLS0100）、免疫蛋白印迹检测分析系统（美国Bio‑Rad公司，型号BIO‑RAD Chemidoc Touch）和倒置荧光显微镜（日本Olympus公司，型号Olympus IX71）。

1.2 实验动物与细胞

SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重180~200 g，20只，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK（湘）2019‑0014；人HepG2细胞株购自中科院上海细胞库，编号SCSP‑510。

1.3 葛花含药血清制备

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组和给药组，每组10只，分别给予生理盐水和不同剂量葛花水煎液灌胃，给药组按照临床常用剂量（15 g/d）的1倍、5倍、20倍，每天上午9点和下午4点各灌胃1次，连续5 d。末次给药2 h后，用1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，采用腹主动脉取血法取血，4 ℃冰箱静置2 h后离心，取上清液置于56 ℃水浴锅中灭活30 min，0.22 μm滤膜除菌，超净台分装，-80 ℃冰箱保存备用。动物实验经贵州中医药大学实验动物伦理审查委员会审查通过，伦理号：20210136。

1.4 MTS实验检测细胞增殖

将HepG2细胞按每孔1×10³ 个接种于96孔板，待细胞长到50%，换液为含10%的含药血清，将96孔板放入37 ℃恒温培养箱培养24 h，取出96孔板后加入10 μL MTS溶液培养2 h，用酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值（OD值）。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力

将干预后的各组HepG2细胞接种于6孔板（1×10⁵个/孔），用200 μL枪头在细胞层中作“十”字划痕处理，分别于0 h和24 h时在显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

1.6 获取葛花、HCC和自噬基因的靶点

使用TCMSP（https： //tcmspw. com/tcm-sp）数据库收集葛花成分，将获得的葛花成分在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）蛋白数据库中将成分作用靶点蛋白名称转化成基因靶点名称。在OMIM（https：//www.omim.org/）、TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库中以HCC为关键词，获得HCC靶点，汇总数据并删除重复项。HADb人类自噬数据库（http：//www.autophagy.lu/）中下载自噬靶点数据。

1.7 构建蛋白‑蛋白相互作用网络

为明确葛花、HCC、自噬基因之间靶点‑靶点之间的相互作用，使用在线Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）网站将葛花靶点、HCC靶点和自噬基因靶点进行交集处理，将交集靶点导入STRING（https：//string-db.org/）数据库，物种选择“Homo sapiens”，置信度0.4，构建蛋白相互作用（PPI）网络图，使用Cytoscape 3. 9. 1软件将PPI网络进行可视化，并使用cytoHubba插件的Degree算法挑选出网络中排名前15的靶点，作为初步筛选。

1.8 基因本体论（Gene Ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）是一个生物信息在线平台，可以进行基因本体论（GO）功能分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析^［17］。把交集靶点导入到数据库中进行分析，导出分析的结果并进行数据处理，使用微生信（https：//www.bioinformatics.com.cn/）平台进行可视化。

1.9 基因差异表达分析和接受者操作特性曲线（Receiver operating characteristic curve，ROC）分析

使用R 4.2.1语言进行基因差异表达分析，并用ggplot2包对数据进行可视化处理。从TCGA（https：//www.cancer.gov/ccg/research/genome -sequencing/tcga）数据库下载并整理TCGA‑LIHC（肝细胞肝癌）项目STAR流程的RNAseq数据并提取TPM格式的数据，数据处理方法使用 log2（value+1）。

为进一步筛选靶点，使用pROC包进行ROC诊断分析，结果用ggplot2进行可视化处理。可视化结果中AUC>0.5且接近1的，则证明该变量在预测结局上诊断效果越好，而AUC<0.5的则变量不起作用，无诊断价值，从而起到筛选靶点基因的目的。

1.10 临床相关性分析和生存分析

ROC诊断分析筛选后的靶点基因运用R 4.2.1语言的ggplot2进行临床相关性分析并进行可视化，数据来源于TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov）中TCGA‑LIHC（肝细胞肝癌）项目STAR流程的RNAseq数据并提取TPM格式的数据以及临床数据。

生存分析是研究响应时间数据和生存现象及其统计规律的一门学科，可对生存时间的分布特征进行描述、对影响生存时间的主要因素进行分析。将临床相关性筛选后的靶点基因使用R 4.2.1语言进行生存分析，使用survival包进行比例风险假设检验并进行拟合生存回归，结果用survminer包以及ggplot2绘图包进行可视化处理。

1.11 分子对接

采用分子对接评价葛花活性成分与靶蛋白之间的相互作用。将筛选后得到的关键基因对应的蛋白通过DS BIOVIA Discovery Studio 2019进行高精度对接模拟评估蛋白‑配体的亲和力。葛花成分的分子式以及结构从PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取。蛋白的结构文件从RCSB PDB数据库（http：//www.pdb.org/）中下载获取。

1.12 分子动力学模拟

使用Schordinger 2019软件“Desmond”模块进行操作。采用预定义的SPC水模型，利用OPLS2005力场模拟水分子。为了中和系统电荷，加入适量的氯离子/钠离子来平衡系统电荷，并随机放置在溶剂化系统中。在构建溶剂化系统后，使用与Desmond模块集成的默认协议（使用OPLS2005力场参数）对系统进行能量最小化。采用Nose‑Hoover温度耦合和各向同性标度，将温度和压力保持在300 K和1个大气压；操作之后，运行100 ns的NPT模拟，并以100 ps的间隔保存进行轨迹保存。

1.13 Western Blot实验

将HepG2分成空白组、1×低剂量组、5×中剂量组和20×高剂量组。空白组进行基础培养，给药组细胞汇合度达到约50%时，加入含药血清进行干预，继续培养至细胞浓度90%~95%后，收集细胞，弃去培养基，用预冷的PBS洗涤，加入含PMSF的细胞裂解液150 μL反复吹打，放置冰上裂解30 min，温度为4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，吸取上清液得到细胞总蛋白，BCA定量试剂盒定量后进行SDS‑PAGE电泳，转膜，用封闭液封闭PVDF膜，随后进行一抗孵育，Casp3（1∶1 000），LC3B（1∶1 000），β‑actin （1∶1 000），二抗（1∶8 000），洗涤膜，最后使用ECL显影，在化学发光成像分析仪曝光。

1.14 统计学分析

实验数据使用GraphPad Prism 10.0和SPSS 25.0软件进行分析，数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTS实验检测细胞增殖和划痕实验检测细胞迁移能力

划痕实验结果如图1A和B所示，随着给药量的增加，HepG2细胞迁移能力逐渐降低，低剂量组与对照组无显著性差异（tCON∶1×=0.1975），（P>0.05）（tCON∶5×=0.009 1，tCON∶20×<0.000 1），（P<0.01）。表明葛花含药血清对HepG2的迁移能力具有一定的抑制效果。

使用MTS实验检测不同剂量葛花含药血清对HepG2细胞增殖能力的影响。实验结果如图1C所示，与对照组相比，葛花含药血清低剂量组无显著性差异（tCON∶1×=0.230 8）（P>0.05），中剂量组、高剂量组均具有显著性差异（tCON∶5×<0.000 1，tCON∶20×<0.000 1）（P<0.000 1）。表明葛花含药血清中剂量和高剂量对HepG2细胞的增殖能力有显著的抑制效果。

2.2 获取药物、疾病和自噬的靶点

在TCMSP数据库中以“Herb‑name”为检索方式、“lobed kudzuvine flower”为关键词搜集葛花成分。筛选出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug‑Likeness，DL）≥0.18的葛花成分526个，使用Uniprot数据库将筛选后的葛花成分作用靶点蛋白名称转化成基因靶点名称。在OMIM、TTD和GeneCards数据库中以HCC进行检索，获得HCC疾病靶点。将检索到的靶点合并去重，获得5 859个HCC疾病基因。在HADb中获取自噬基因222个。

2.3 构建PPI网络图

取葛花、HCC和自噬靶点取交集，通过在线作图工具绘制韦恩图，三者交集基因共37个，如图2所示。将葛花、HCC和自噬的交集靶点上传至 String 11.0（https： / /string-db. Org）数据库构建PPI网络，将物种名设置为“Homo Sapiens”，最小互相作用阈值设定为highest confidence >0.9，其余设为默认值后进行相互作用分析。将得到的PPI使用Cytoscape 3. 9. 1软件打开并进行可视化。随后使用degree分数进行分析，筛选出degree前15个靶点，并导入CytoHubba中，使用MCC方法识别插件得到15个节点和58个边。见图3。

2.4 GO和 KEGG富集分析

取生物过程（BP），细胞成分（CC）和分子功能（MF）中排名前20的功能绘制GO富集分析图，见图4。

由结果可知，生物过程主要与细胞凋亡信号通路、信号传导、细胞内信号传导、蛋白质水解、细胞周期等相关；细胞组分主要与核因子‑κB（nuclear factor‑κB，NF‑κB）、CD95死亡诱导信号、Bcl‑2家族蛋白、核膜、内质网腔等有关；分子功能主要与ATP结合盒式蛋白（ATP‑binding cassette transporter，ABC）、染色质结合蛋白、DNA结合蛋白等有关。KEGG富集分析主要参与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、转化生长因子‑β（transforming growth factor‑β，TGF‑β）、雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）、磷脂酶D （Phospholipase D，PLD）、Ras相关蛋白1（Rap1）等信号通路。

2.5 基因差异表达分析和ROC曲线分析

使用R 4.2.1语言将15个核心基因进行基因差异表达分析。如图5所示，分析基因差异表达结果可知15个基因中都具有差异表达意义，其中BCL2、BCL2L1、CASP8、HIF1A、MAPK3、BIRC5、Casp3、MAPK1、TP53、RELA、NFKB1、MAPK8、RB1在肝癌中表达量高于正常组（图5A~J，L~N），FOS和MYC表达量低于正常组（图5K、O）。

使用R 4.2.1语言进行ROC曲线分析，并进行可视化处理。得到的ROC曲线分析的图像中，ROC曲线下的面积（Area Under Curve，AUC）常用于诊断试验的评估。筛选出AUC>0.7的靶点为MAPK3、RELA、TP53、CASP8、FOS、BCL2L1、MAPK1和Casp3。见图6。

2.6 临床相关性分析和生存分析

利用TCGA数据库中数据通过R 4.2.1语言的ggplot2进行临床相关性分析并进行可视化，分析丝裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）、V‑REL网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、TP53基因（TP53）、胱天蛋白酶8（CASP8）、原癌基因（FOS）、Bcl‑2样蛋白1（BCL2L1）、丝裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）和胱天蛋白酶3（Casp3）与肝癌肿瘤大小、淋巴转移和患者性别的相关性。见图7。筛选出具有意义靶点Casp3、TP53和MAPK1。

最后分析Casp3、TP53、MAPK1的预后价值，并进行可视化分析，P<0.05具有意义，其中Casp3 P值为0.02，TP53 P值为0.919，MAPK1 P值为0.061。最后得到核心基因Casp3。见图8。

2.7 分子对接验证

将Casp3基因编码的蛋白和对应的成分小分子化合物结构导入DS BIOVIA Discovery Studio 2019软件进行分子对接。结果显示，葛花化合物quercetin与Casp3对接成功，并有较好的亲和力，对接分数为84.6366，见图9。

2.8 分子动力学模拟

将分子动力学分析结果进行可视化，随后进行结果分析。均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）是测量特定坐标系中相对于参考坐标系的一组原子的位移的平均变化。它是由轨迹中的所有帧计算的，图10中A图所示。从图中可知模拟中结构变化在1‑3 Å 量级，而1‑3 Å量级的变化对于小的球状蛋白质是可以接受的。大于1‑3 Å量级这个范围的变化表明蛋白质在模拟过程中发生了较大的构象变化。配体RMSD可以稳定在一个固定值附近，说明配体可以稳定结合于该蛋白。均方根波动值（root mean square fluctuation，RMSF），蛋白RMSF峰值表示在模拟过程中波动最大的蛋白质区域，图10中B图可以观察到蛋白质首尾端（N端和C端）比蛋白质的任何其他部分波动更大，这是蛋白RMSF普遍现象。配体RMSF显示了按原子分解的配体波动（图10B）。在整个模拟过程中，可以监测蛋白质与配体的相互作用。在整个运动轨迹中蛋白质与配体特定接触的总数，见图10D。为了显示每个轨迹帧中哪些残基与配体相互作用，将图10D使用热图进行结果表示，见图10E。结果表示一些残基与配体有不止一次的特定接触，根据图右侧的刻度，颜色越深表示接触越多。其中ARG_164颜色最深，其次是ILE_160。最后按照蛋白‑配体相互作用数据绘制出蛋白分子相互作用图，见图10F。

2.9 体外细胞实验验证

Wesrern Blot实验结果如图11所示，与对照组相比，随着葛花含药血清剂量的增加，LC3BⅡ和LC3BⅠ的比值逐渐增加，提示自噬水平增加（LC3BⅡ/LC3BⅠ∶tCON∶1×=0.035 6，tCON∶5×=0.000 2，tCON∶20×<0.000 1）（P<0.05）。与对照组相比，随着葛花含药血清剂量的增加，Casp3的表达水平逐渐下降（Casp3∶tCON∶5×=0.000 6，tCON∶20×<0.000 1）（P<0.001）。

3 讨论

本研究基于网络药理学和生物信息学，初步确定了葛花通过调控肝癌细胞自噬治疗肝癌的作用机制。

通过网络药理学确定了葛花可能通过调控自噬从而影响HCC的潜在靶点15个。KEGG通路包含了VEGF、TGF‑β、mTOR、PLD、Rap1等信号通路。研究发现，mTOR信号通路可以调控细胞自噬，也可以通过影响细胞增殖和蛋白合成实现抗肿瘤的治疗^［18］。采用中药的有效成分或提取物同样可调节VEGF通路达到抑制肝癌血管生成的目的^［19］。随后在基因差异表达分析中BCL2、BCL2L1、CASP8、HIF1A、MAPK3、BIRC5、Casp3、MAPK1、TP53、RELA、NFKB1、MAPK8、RB1在肝癌中表达水平高于正常组，FOS和MYC表达水平低于正常组。ROC曲线分析筛选出P<0.05的有：MAPK3、RELA、TP53、CASP8、FOS、BCL2L1、MAPK1和Casp3。临床相关性分析表明Casp3和TP53与患者性别相关，MAPK1与患者的肿瘤大小相关。生存分析表明只有Casp3生存分析具有统计学意义，则说明Casp3的过表达与肝癌的预后不良相关。分子对接结果表明Casp3与quercetin成功对接，且有较好的亲和力，对接分数为84.636 6。分子动力学模拟分析结果表明，蛋白和配体具有良好的结合能力，并能形成稳定的配合物。MTS实验检测表明，与对照组相比，中、高剂量组细胞增殖能力均具有显著性差异（P<0.000 1），表明中高剂量葛花含药血清对HepG2细胞的细胞增殖能力具有一定的抑制作用。划痕实验检测表明，葛花含药血清对HepG2细胞的迁移能力具有一定的抑制效果。使用自噬过程中的标志性蛋白LC3B，为探明葛花含药血清干预后的HepG2细胞是否具有自噬进行，且在不同剂量中自噬发生的程度进行评估。Western Blot实验结果表明，葛花干预后的肝癌细胞中Casp3蛋白的表达量下调，且药物浓度5×和20×组下调效果好，说明在一定浓度下葛花浓度越高，蛋白表达量越低，此外，随着葛花含药血清剂量的增加，LC3BⅡ和LC3BⅠ的比值逐渐增加，提示自噬水平增加。

研究发现，中药活性成分可通过促进自噬发生而抑制肝癌发展^［20］。文献表明，葛花对人肝癌细胞的增殖具有一定的抑制作用^［21］，其有效成分quercetin是具有多种生物活性的黄酮类化合物，且药理学证实其对体内、外多种癌细胞有杀伤作用^{［22，23］}。研究发现，Casp3在促进遗传不稳定和致癌作用中发挥着积极作用^［24］，Casp3的表达与肿瘤的免疫侵袭具有正相关性^［25］，且Casp3的活化可有效促进肝癌细胞的凋亡从而抑制肿瘤的生长^［26］。

综上所述，本研究结合网络药理学、生物信息学和体外细胞实验证实，葛花可通过作用于Casp3调控细胞自噬而干预肝癌。

作者贡献度说明：

李军：撰写论文并修改；成果：负责网络药理学、分子对接等数据分析与整理；张楠楠：对文章提出修改意见及审核；楼迪栋：最终审定文章。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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