淫羊藿苷通过调控PI3K/AKT/mTOR通路影响自然衰老小鼠Treg细胞的表达

Icariin affects the expression of Treg cells in naturally aging mice by regulating the PI3K/AKT/mTOR pathway

摘要

目的 观察淫羊藿苷延缓自然衰老小鼠皮肤老化的作用和初步探讨其作用机制。 方法 将15月龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机分为衰老组、淫羊藿苷低剂量组（5 mg/kg）和淫羊藿高剂量组（20 mg/kg），每组10只。另取10只1月龄的雄性C57BL/6J小鼠作为青年对照组。饲养3个月后处死所有小鼠。H&E染色观察小鼠皮肤组织厚度；Masson染色观察胶原纤维的变化；免疫组化检测皮肤组织Ki67和p16表达；流式细胞术检测脾脏和淋巴结中CD4⁺FoxP3^＋Treg百分比以及免疫组化检测皮肤组织Foxp3表达；蛋白免疫印迹法检测皮肤组织PI3K、AKT、m-TOR、P70S6K的蛋白表达水平。 结果 与青年组比较，衰老组小鼠皮肤的厚度变薄（P<0.01）；胶原纤维含量减少（P<0.01）；表皮Ki67的表达减少（P<0.01）；皮肤组织p16的表达增加（P<0.01）；脾脏和淋巴结组织内CD4⁺Foxp3⁺Treg百分比增加（P<0.01）；皮肤组织Foxp3的表达增加（P<0.01）；皮肤组织PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达没有明显变化，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P70S6K的蛋白表达增加（P<0.01）。与衰老组小鼠比较，淫羊藿苷给药组小鼠皮肤变厚（P<0.01）；胶原纤维含量增加（P<0.01）；表皮Ki67表达增加（P<0.01）；皮肤组织p16的表达减少（P<0.01）；脾脏和淋巴结组织内CD4⁺Foxp3⁺Treg百分比减少（P<0.05，P<0.01）；皮肤组织Foxp3表达减少（P<0.01）。皮肤组织PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达没有明显变化，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P70S6K的蛋白表达减少（P<0.05，P<0.01）。 结论 淫羊藿苷可以通过调控PI3K/AKT/m-TOR信号通路影响自然衰老小鼠Treg的表达进而延缓皮肤的衰老。

Abstract

Objective To observe the effect of Icariin in delaying skin aging in naturally senescent mice and to preliminarily explore its mechanism of action. Methods Fifteen-month-old SPF-grade male C57BL/6J mice were randomly divided into the senescence group， Icariin low-dose group （5 mg/kg）， and Icariin high-dose group （20 mg/kg）， with 10 mice in each group. Another 10 one-month-old male C57BL/6J mice were taken as the young control group. After 3 months of feeding， all mice were executed. H&E staining was used to observe the thickness of mouse skin tissues； Masson staining was used to observe the changes of collagen fibers； immunohistochemistry was used to detect the expression of Ki67 and p16 in skin tissues； flow cytometry was used to detect the percentage of CD4⁺FoxP3⁺Treg in spleen and lymph nodes， as well as immunohistochemistry was used to detect the expression of Foxp3 in skin tissues； and protein Western blot was used to detect tissue protein expression levels of PI3K， AKT， m-TOR， and P70S6K. Results Compared to the youth group， the thickness of the skin in the aging group of mice was thinner （P<0.01）； the content of collagen fibers was reduced （P<0.01）； the expression of epidermal Ki67 was reduced （P<0.01）； the expression of p16 in skin tissues was increased （P<0.01）； the percentage of CD4⁺Foxp3⁺Treg in the tissues of spleen and lymph nodes was increased （P<0.01）； the expression of Foxp3 in skin tissue was increased （P<0.01）. There was no significant change in protein expression of PI3K， AKT and mTOR in skin tissue， and increased protein expression of p-PI3K， p-AKT， p-mTOR， and P70S6K （P<0.01）. Compared to the aging group， the skin of mice in the epimedium glycoside administration group was thickened （P<0.01）； collagen fiber content was increased （P<0.01）； epidermal Ki67 expression was increased （P<0.01）； the expression of p16 in skin tissues was decreased （P<0.01）； and the percentage of CD4⁺Foxp3⁺Treg in the splenic and lymph node tissues was decreased （P<0.05， P<0.01）； and Foxp3 expression in skin tissue was reduced （P<0.01）. There was no significant change in protein expression of PI3K， AKT， and mTOR in skin tissues， and the protein expression of p-PI3K， p-AKT， p-mTOR， and P70S6K was reduced （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Icariin regulates Foxp3 expression through PI3K/AKT/m-TOR signaling pathway to delay skin aging in naturally aging mice.

Graphical abstract

关键词

自然衰老 / 淫羊藿苷 / 调节性T细胞 / PI3K/AKT/mTOR

Key words

Natural aging / Icariin / Treg / PI3K/AKT/mTOR

皮肤衰老分为内源性衰老（自然衰老）和外源性衰老（光老化等），自然衰老导致皮肤结构完整性和生理功能逐渐丧失^［1，2］。此时，皮肤会出现变薄、弹性丧失、色素沉着和胶原纤维含量减少等症状。衰老与免疫功能具有密切关系^［3］。在人体老化过程中免疫系统最早受到影响，参与了人体老化的全过程，对皮肤的衰老具有重要影响^［4］。

调节性T细胞（Treg）是免疫系统调控疾病及机体状态的主要效应细胞，Treg失调是免疫衰老的重要特征之一^［5］。脾脏是人体最大的外周免疫器官，淋巴结作为免疫细胞的聚集地，当脾脏和淋巴结内Treg数量增加会引起免疫衰退^［6-8］。相对年轻人，老年人皮肤中CD4⁺Foxp3⁺Treg比例明显增加，而此类人群皮肤感染、过敏、自身免疫及皮肤肿瘤等发病率也显著上升^［9-12］。进一步的研究发现，Treg细胞的转录调节因子Foxp3的表达受到磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的调控^［13］。这一发现表明，通过调控这一信号通路进而影响Treg细胞的表达，可能对于延缓衰老具有重要作用^［4］。

淫羊藿苷（ICA）是从淫羊藿中提取的一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、免疫调节和抗衰老等药理作用^［14-17］。据报道，淫羊藿苷对于PI3K/AKT/mTOR信号通路的蛋白表达有调控作用^［18-20］。对于淫羊藿苷能否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响Treg的表达从而延缓皮肤自然衰老还有待研究，因此，本研究采用自然衰老模型从而探究淫羊藿苷是否通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路影响Treg的表达继而延缓皮肤自然衰老。

1 材料与方法

1.1 动物

从三峡大学实验动物中心购入40只SPF级的C57BL/6J的雄性小鼠：10只1月龄，30只15月龄。实验动物生产许可证号为SCXK（鄂）2022-0012。实验动物伦理号：2022020V。饲养于SPF级的实验动物中心，实验单位使用许可证号：SCXK（鄂）2022-0061。室温（23±3）℃，相对湿度（60±5）%，12 h明暗交替，自由进食和饮水。

1.2 试剂

淫羊藿苷购于四川成都植标化纯生物技术有限公司，批号：160920；Foxp3、p-mTOR、p-PI3K批号：CST，D608R、#5536、4228S；mTOR批号：Santa cruz，sc-8319；p-AKT、AKT、PI3K批号：万类生物，WLP001a、WL0003b、WL02240；β-Actin批号：ABclonal，AC026。

1.3 仪器

DYY6C型电泳仪购于北京六一仪器；Centrifuge5424R型高速冷冻离心机购买于德国Eppendorf公司；TP102自动脱水机、EG1150H石蜡包埋机、EG1150C超薄切片机购买于德国Leica公司；51118650酶标仪购买于美国Thermo公司；DS1000匀浆仪购买于上海力康生物医疗科技控股有限公司；移液器购买于德国Eppendorf公司。

1.4 造模、分组及给药

将30只15月龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠随机平均分为衰老组、淫羊藿苷低剂量组（ICAL，5 mg/kg）和淫羊藿高剂量组（ICAH，20 mg/kg）。取10只1月龄的雄性C57BL/6J小鼠作为青年对照组。青年组和衰老组给予5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。饲养3个月后处死所有小鼠。取其背部皮肤放入4%多聚甲醛中固定和-80 ℃保存备用。

1.5 H&E染色法观察小鼠皮肤的组织形态

小鼠皮肤组织经固定后，自动脱水机进行脱水处理，包埋，切片，H&E自动染色机染色，中性树胶封片。电子扫描显微镜下扫描取图。

1.6 Masson染色法检测小鼠皮肤的胶原纤维含量

石蜡切片进行常规的脱蜡水化后，根据Masson染色试剂盒的操作方法进行染色，中性树胶封片。电子扫描显微镜下扫描取图。

1.7 免疫组化法检测小鼠皮肤表皮Ki67、皮肤组织p16和Foxp3的表达

石蜡切片进行常规的脱蜡后EDTA微波修复。冷却后灭活过氧化物酶，封闭，孵一抗，抗体比例为Ki67（1∶2 000）、p16（1∶500）、FoxP3（1∶200），过夜后孵二抗。显色、染核、分化、返蓝和透化，中性树胶封片。普通显微镜下观察并取图。

1.8 流式检测小鼠脾脏和淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg

取小鼠的脾脏和淋巴结研磨，收集细胞悬液，不同方法进一步处理后，加入相应抗体孵育，重悬后流式上机分析。

1.9 蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测小鼠皮肤组织p‑PI3K、PI3K、p‑AKT、AKT、p‑mTOR、mTOR和p70S6K的蛋白表达

称取各组小鼠皮肤组织提取总蛋白，测定蛋白浓度，加热变性。将所得样品进行电泳、转膜、封闭。放入4 ℃冰箱的摇床上孵育一抗，过夜后二抗室温孵育，洗膜，超敏ECL显影液显影，采用Image J软件分析。

1.10 统计学分析

采用Graph Pad Prism 5 软件对数据进行分析。所有数据采用（\overline{x}\pm s）表示，采用单因素方差分析法进行组间比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 淫羊藿苷对衰老小鼠皮肤组织形态学的影响

与青年组比较，衰老组皮肤明显变薄（P<0.01），组织排列紊乱和松散。与衰老组比较，淫羊藿苷给药组皮肤变厚（P<0.01），组织排列整齐，见图1。

2.2 淫羊藿苷对衰老小鼠皮肤组织胶原纤维的影响

与青年组比较，模型组皮肤组织的胶原纤维含量明显减少（P<0.01）且胶原纤维部分断裂。与衰老组比较，淫羊藿给药组皮肤组织胶原纤维含量明显增加（P<0.01）且胶原纤维断裂的更少，见图2。

2.3 淫羊藿苷对衰老小鼠皮肤组织Ki67表达的影响

与青年组比较，衰老组皮肤表皮Ki67的表达显著减少（P<0.01）。与衰老组比较，淫羊藿苷给药组皮肤表皮Ki67的表达明显增加（P<0.01），见图3。

2.4 淫羊藿苷对衰老小鼠皮肤组织p16蛋白表达的影响

与青年组比较，衰老组皮肤组织中p16的表达显著增加（P<0.01）。与衰老组比较，淫羊藿苷给药组皮肤组织p16的表达明显减少（P<0.01），见图4。

2.5 淫羊藿苷对衰老小鼠脾脏和淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg的影响

与青年组比较，衰老组脾脏和淋巴结组织中CD4⁺Foxp3⁺Treg的表达显著增加（P<0.01）。与衰老组比较，淫羊藿苷给药组脾脏和淋巴结组织CD4⁺Foxp3⁺Treg的表达明显减少（P<0.05，P<0.01），见图5。

2.6 淫羊藿苷对衰老小鼠皮肤组织Foxp3表达的影响

与青年组比较，衰老组皮肤组织Foxp3的表达显著增加（P<0.01）。与衰老组比较，淫羊藿苷给药组皮肤组织Foxp3的表达明显减少（P<0.01），见图6。

2.7 淫羊藿苷对衰老小鼠皮肤组织中PI3K/AKT/m‑TOR通路相关蛋白表达的影响

与青年组比较，衰老组和淫羊藿苷组皮肤组织中PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达没有明显变化，衰老组皮肤组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P70S6K的蛋白表达增加（P<0.01）。与衰老组皮肤组织比较，淫羊藿苷给药组皮肤组织p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和P70S6K的蛋白表达减少（P<0.05，P<0.01），见图7。

3 讨论

皮肤是一个复杂的器官，执行许多屏障免疫功能，是抵御多种外部病原体的第一道防线。随着年龄的不断增长，皮肤免疫系统中各种细胞亚群数量和功能发生变化，进而改变皮肤组织的微环境，免疫系统除了具有对体内外环境的反应和适应能力，还在细胞与分子水平参与细胞的生长、分化和发育，从根本上参与机体老化的全过程，因此免疫系统对于延缓皮肤自然衰老具有重要作用^［21］。皮肤自然衰老伴随的免疫衰退可能增加皮肤感染和恶性肿瘤发生的风险^{［22，23］}。随着机体逐渐衰老，皮肤中Foxp3表达增加，Treg细胞数量增加^［24-26］。Treg在控制免疫应答方面处于核心地位，因此调节Treg对于延缓皮肤自然衰老具有重要作用^［27］。

淫羊藿苷具有免疫调节和抗衰老等药理作用，在衰老的过程中伴有免疫系统的改变继而会导致各种免疫疾病的发生。因此研究淫羊藿苷对衰老小鼠中Treg的影响，对于说明淫羊藿苷对衰老的保护作用具有重要的意义。皮肤变薄，胶原纤维的含量减少，表皮细胞的增殖减少和p16表达增加是皮肤自然衰老的典型特征。本研究采用自然衰老模型的小鼠并灌胃给予淫羊藿苷保护。结果显示，衰老组小鼠的皮肤厚度明显变薄，胶原纤维的含量减少和部分断裂，表皮细胞的增殖减少和p16的表达明显增加。淫羊藿苷干预后，小鼠皮肤明显变厚、胶原纤维的含量显著升高、胶原纤维的断裂减少、表皮细胞增殖增加且P16的表达降低，说明淫羊藿苷能够延缓小鼠皮肤的自然衰老。

Foxp3被认为是影响Treg细胞发育和功能的关键谱系转录因子^［28］。本研究检测了外周血和皮肤组织中Foxp3的表达。结果显示，衰老小鼠脾脏和淋巴结中CD4⁺Foxp3⁺Treg的表达水平明显增加，皮肤组织中Foxp3表达水平显著增加，而给予淫羊藿苷干预后，衰老小鼠脾脏和淋巴结的CD4⁺Foxp3⁺Treg的数量水平明显降低，皮肤组织中的Foxp3表达水平降低，说明淫羊藿苷可以降低自然衰老导致的外周血和皮肤组织中Treg的表达。

Treg的关键转录因子Foxp3受PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控^［29］。自然衰老皮肤组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p70S6K蛋白的表达水平显著增加 而给予淫羊藿苷干预后，皮肤组织中的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR和p70S6K蛋白表达水平均降低，说明淫羊藿苷可能是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路从而降低自然衰老小鼠外周血和皮肤组织中Treg的表达。

综上所述，淫羊藿苷能调控PI3K/AKT/mTOR信号通路影响Treg的表达从而延缓皮肤自然衰老。本研究为临床通过调控免疫系统延缓皮肤自然衰老提供新实验依据及参考。

作者贡献度说明：

邓锋参与实验研究、数据分析及论文撰写；侯利、王怡协助完成实验实施，采集及分析数据；温涛：对文章的知识性内容作批评性审阅；罗亚男、曾巧煌、刘翠华：研究设计构思、文章修改审阅、项目经费资助。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金青年项目(82104442)

国家自然科学基金青年项目(82371597)

湖北省教育厅科学研究计划项目(Q20221213)