木犀草素通过AKT/GSK3β/β‑catenin通路对人肝癌细胞Hep3B增殖侵袭转移的影响及机制

Effect and mechanism of luteolin on the proliferation, invasion and metastasis of human hepatoma cell Hep3B through the AKT/GSK3β/β‑catenin pathway

摘要

目的 探究木犀草素（luteolin）对人肝癌细胞株hep3B增殖、侵袭、转移及上皮间质转化的影响及机制。 方法 将肝癌细胞株hep3B分为对照组、木犀草素处理组（低中高浓度及高浓度+AKT激动剂），利用CCK8实验测定细胞增殖活力，划痕及transwell测定迁移和增殖能力，免疫荧光检测EMT相关蛋白，Westernblot实验测定AKT/GSK3β/β-catenin信号通路及EMT相关蛋白，裸鼠成瘤实验观察裸鼠成瘤情况及肿瘤重量大小，免疫组化检测Ki67及EMT相关蛋白。 结果 与对照组比较，肝癌细胞株hep3B的活性受木犀草素时间及浓度抑制，浓度越高，木犀草素对肝癌细胞的侵袭和转移抑制作用越明显，木犀草素pAKT、pGSK3β、β-catenin蛋白水平受抑制，N-cadherin、Vimentin、MMP-2表达受抑制，Ki67表达受抑制，但E-cadherin表达水平升高，AKT激动剂SC79能够拮抗高浓度木犀草素对肿瘤细胞的效应。 结论 木犀草素可能通过AKT/GSK3β/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞hep3B的增殖、侵袭、转移及上皮间质转化。

Abstract

Objective To investigate the impact and underlying mechanisms of luteolin on the proliferation， invasion， metastasis， and epithelial-mesenchymal transition （EMT） of human liver cancer cell line Hep3B. Methods The Hep3B liver cancer cell line was divided into control and luteolin treatment groups， including low， medium， and high concentrations of luteolin， as well as a high concentration combined with an AKT agonist. Cell proliferation activity was assessed using a CCK8 experiment， while migration and invasion abilities were measured through scratch and Transwell assays， respectively. Fluorescence and Western blot experiments were employed to detect EMT-related proteins and examine the AKT/GSK3β/β-catenin signaling pathway. Nude mouse tumorigenesis experiments were conducted to observe tumor formation and weight， with immunohistochemistry used to assess Ki67 and EMT related proteins. Results Luteolin inhibited the activity of Hep3B liver cancer cells in a dose-dependent manner， with higher concentrations demonstrating more pronounced effects on invasion and metastasis. Luteolin suppressed the levels of pAKT， pGSK3β， and β-catenin proteins， as well as the expression of N-cadherin， vimentin， and MMP-2， while increasing E-cadherin expression. The AKT agonist SC79 was found to counteract the impact of high luteolin concentrations on tumor cells. Conclusion Luteolin may impede the proliferation， invasion， metastasis， and EMT of Hep3B hepatocellular carcinoma cells via the AKT/GSK3β signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

木犀草素 / AKT/GSK3β/β‑catenin / 肝癌 / 增殖 / 迁移 / 转移 / EMT

Key words

Luteolin / AKT/GSK3β/β‑catenin / Hepatoma / Proliferation Migration / Metastasis / Epithelial‑mesenchymal transition

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，具有高发病率和高死亡率^［1］。尽管一些患者可以通过早期诊断得到有效治疗，但大多数患者在诊断时病灶已经无法完全切除。尽管介入治疗和靶向药物能够延缓生存时间^［2］，但肝癌仍然是一个亟待解决的医学难题。AKT/GSK3β/β-catenin信号通路在肿瘤的发生和发展中起着重要作用^［3］，在细胞增殖、代谢和凋亡等方面发挥重要作用。上皮间质转化（EMT）是一种重要的细胞转化过程，涉及细胞极性的消失和迁移能力的增强^［4］。AKT/GSK3β/β-catenin信号通路在EMT过程中发挥作用，可以抑制β-catenin降解进而导致EMT的发生^［5］，而SC79激动剂可以增强该信号通路的活性^［6］，其可以增强AKT的磷酸化进一步激活下游通路。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，可从多种植物中提取，具有抗炎、降血糖、抗肿瘤等多种作用^［7］。多篇文献证明木犀草素可以抑制AKT信号通路^{［6，8，9］}。虽然有文献证明木犀草素对乳腺癌、结肠癌及神经肿瘤表现出一定的抑制作用^{［7，10，11］}。但目前木犀草素对肝癌的作用机制尚不明确，本文旨在通过探究木犀草素对肝癌细胞增殖、侵袭、转移及上皮间质转化的影响进而探究其可能的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料

细胞株人肝癌细胞株hep3B购自海星生物有限公司。木犀草素购自上海皓元生物医药科技有限公司，PBS、0.25%胰酶消化液及DMEM高糖培养基购于赛默飞，胎牛血清（FSP500）购于ExCellBio。CCK8试剂盒、RIPA裂解液、4%多聚甲醛、超敏化学发光显色试剂盒购自碧云天。基质胶购于北京索莱宝科技有限公司。AKT激活剂SC79（HY-18749）购MedChemExpress公司。兔抗Vimentin（CY5134）、E-Cadherin（CY1155）、N-Cadherin（CY5015）、AKT（CY5561）、GSK3β（CY2434）、p-AKT（CY5885）、p-GSK3β（AY0504）、β-catenin（cy3523）、MMP2（CY7164）、MMP9（CY5205）均购自上海泊湾生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人肝癌细胞株hep3B置于含有1%青霉素-链霉素，10%灭活胎牛血清的高糖DMEM培养基中，常规培养，及时更换培养基，当细胞浓度达80%以上时传代。

1.2.2 CCK8实验检测细胞活力

取对数生长期的Hep3B细胞，接种至96孔板中，每孔5×10³个细胞。随后，向孔中加入含有0、10、20、40、80 μmol/L木犀草素的培养基。随后将板放入培养箱中进行培养。为了评估细胞增殖，设置5个重复孔，并在培养24 h和48 h后添加10 μL/孔的CCK8溶液。进一步培养2 h，充分摇匀后，通过酶标仪450 nm波长下检测各孔的OD值。细胞增殖抑制率计算公式：［（D对照组-D实验组）/（D对照组-D空白组）］×100%。

1.2.3 划痕实验检测细胞迁移

将对数生长期的hep3B细胞以浓度为5×10⁵个/孔接种至6孔细胞培养板中继续培养，待细胞密度达90%以上，用200 μL枪头在每个孔上划出3条等距平行直线，PBS清洗后加入含不同浓度木犀草素（及SC79）的完全培养基，常规条件培养。在光学显微镜下分别记录在0、48 h划痕情况。ImageJ软件计算出划线空白处0、48 h时的面积W0、W48，划痕愈合率（%）=（W0-W48）/W0×100%。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移侵袭

无血清培养基培养Hep3B细胞24 h后，以无血清培养基重悬细胞浓度为5×10⁵个/mL。Transwell上室铺匀基质胶做细胞侵袭实验，上室中加入200 μL含不同浓度木犀草素（及SC79）的无血清培养基，在24孔板中加入600 μL含10%血清的DMEM高糖培养液作为下室，培养24 h，随后，使用棉签轻轻擦拭小室底部的基质胶和未迁移的细胞，4%多聚甲醛溶液固定30 min，接着用结晶紫染色10 min。自然晾干，显微镜下观察，随机选取3个不重复的视野观察，结果采用ImageJ分析。迁移实验的步骤与侵袭实验相同，但是不加入基质胶。

1.2.5 免疫荧光实验检测EMT相关蛋白

取20 μmol/L木犀草素为实验组，取处于对数生长期的hep3B细胞，经消化、离心、重悬后计算1×10³个/mL接种于24孔板中，待细胞浓度达70%左右，继续加入木犀草素培养24 h，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，5%BSA室温封闭30 min，一抗4 ℃孵育过夜，室温避光孵育荧光二抗1 h，在避光情况下用DAPI染色10 min，使用荧光显微镜行图像采集。

1.2.6 Western blot检测蛋白水平

将收集处理组和对照组的hep3B细胞，提取蛋白，并使用BCA试剂盒来检测蛋白含量并配平。接着进行制胶、上样、电泳和转膜，然后使用5%脱脂奶粉来封闭。随后进行一抗过夜处理，二抗在室温下孵育90 min。洗涤3次后，加入ECL发光液进行曝光。最后，利用ImageJ软件分析研究目的蛋白的相对表达量。

1.2.7 裸鼠成瘤实验

取对数期生长的Hep3B细胞，经胰酶消化，PBS清洗，PBS稀释细胞为浓度为2.0×10⁷个/mL的悬液，取100 μL细胞悬液注射于小鼠右前腋下，待瘤体积达100 mm³时将小鼠随机分为对照组（PBS）及木犀草素组（20 mg·kg^-1·d^-1，预实验确定），每组5只，腹腔注射给药，每2 d记录老鼠体重及肿瘤长径及短径，14 d后处死裸鼠，拍照、收集肿瘤并称体重。本实验所有涉及动物实验均通过伦理审查［伦动科批字（2023）第90号］。

1.2.8 免疫组化检测Ki67及EMT蛋白

取裸鼠皮下瘤于4%多聚甲醛固定24 h，继续予高浓度乙醇脱水，石蜡包埋，切5 μm薄片。随后予烤片、乙醇脱蜡、修复抗原、灭活过氧化物酶，室温封闭30 min，4 ℃一抗孵育过夜；37 ℃恒温孵育二抗30 min；DAB显色后继续予无水乙醇脱水、二甲苯透明后进行封片处理。倒置显微镜下观察Vimentin、E-cadherin及Ki67阳性情况。

1.3 统计学处理

本研究中所有实验均独立重复3次。数据使用GraphPad Prism 9.5软件分析。独立样本t检验进行组间比较，多组比较利用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度木犀草素对Hep3B细胞活力的影响

CCK8实验显示，10、20、40、80 μmol/L木犀草素组处理的Hep3B细胞活力均呈时间浓度依赖下降，其中24 h IC₅₀为41.35，48 h IC₅₀为28.92（图1），故此选择0、10、20、40 μmol/L为实验的对照、低、中、高浓度，在此基础加入40 μmol/L木犀草素+SC79构成本实验分组体系。

2.2 木犀草素对各组Hep3B细胞划痕愈合率的影响

实验显示各组木犀草素相对于对照组48 h划痕愈合率呈浓度依赖下降，单纯高浓度木犀草素较高浓度木犀草素在SC79作用下愈合率明显下降。差异具有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 木犀草素及SC79对Hep3B细胞迁移、侵袭的影响

Transwell检测Hep3B细胞迁移、侵袭实验中，木犀草素各组较对照组穿模细胞数随木犀草素浓度升高而减少，AKT激动剂SC79对高浓度木犀草素具有拮抗作用。迁移及侵袭实验趋势相同，侵袭细胞数较迁移过膜细胞数明显减少。见图3。

2.4 木犀草素对Vimentin及E‑Cadherin荧光蛋白的影响

木犀草素对Hep3B细胞迁移、侵袭均抑制作用，Vimentin属于骨架中间丝蛋白之一，对肿瘤转移起重要作用。细胞间黏附分子1（E-Cadherin）在细胞连接中其重要作用，其下调与上皮特征性消失及间质化特性获得密不可分。我们检测结果显示木犀草素下调Vimentin水平而上调E-cadherin水平。见图4。

2.5 木犀草素对AKT/GSK3β信号通路蛋白在Hep3B细胞内的活化情况

与对照组比较，随着木犀草素浓度的提升，AKT及GSK3β蛋白水平无明显改变，AKT、GSK3β磷酸化产物p-AKT及p-GSK3β蛋白水平降低，β-catenin蛋白水平下降，加入AKT通路活化剂SC79后，明显缓解了高浓度木犀草素对AKT及GSK3β的磷酸化水平抑制作用，p-AKT、p-GSK3β、β-catenin蛋白水平均较高浓度木犀草素提高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图5。

2.6 犀草素对Hep3B细胞上皮间质转化相关蛋白水平的影响

与对照组相比，上皮间质转化相关蛋白vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP9受木犀草素抑制，随木犀草素浓度增高，相对蛋白表达量下降，高浓度木犀草素中加入AKT激动剂SC79后，缓解了木犀草素对Hep3B细胞的抑制作用，相应蛋白表达量有所上升。而相反的是E-cadherin，与对照组相比，其蛋白表达量随着木犀草浓度的提升其表达量上升，加入SC79后高浓度的木犀草素后E-cadherin的表达量较高浓度下降，差异有统计学意义（P<0.05），这与免疫荧光实验结果相符。见图6。

2.7 木犀草素对裸鼠成瘤实验的影响。

木犀草素组和对照组的裸鼠体重无明显差异。种瘤后在第6天肿瘤体积约在100 mm³，随后分组腹腔给药，1周后PBS组肿瘤体积开始明显大于木犀草素组，14 d后，处死裸鼠，PBS组裸鼠肿瘤平均大于木犀草素组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图7、8。

2.8 木犀草素对裸鼠肿瘤增殖标记物Ki67及上皮间质转化蛋白免疫组化的影响

Ki67蛋白表达水平和肿瘤细胞增殖密切相关，与对照组相比，木犀草素组的Ki67表达下降，维持细胞形态的Vimentin表达下降，而具有稳定组织结构的E-cadherin表达量上升。见图9。

3 讨论

肝癌目前仍是人类最常见的恶性肿瘤之一，目前针对肝癌的手段虽然有所进步，虽然能延长病人的生存时间，但全球肝癌总体死亡率占第3名，总体预后仍不佳^{［1，2，13］}。上皮间质转化是指上皮细胞获得间质细胞状态的过程，对肿瘤的侵袭、扩散及耐药性的获得至关重要，肝癌的增殖、扩散与转移离不开肝癌细胞的间质化的过程，抑制肝癌EMT的发生至关重要^［13］。EMT的过程受到严格的控制^［12］，参与调控EMT的信号通路有多条，包括TGF-β信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、NF-κB信号通路、PI3K/AKT信号通路等^［5］。

蛋白激酶B（AKT）在调节细胞代谢、存活和生长等过程中意义重大，肿瘤细胞中AKT往往过度激活^［14］，磷酸化后的AKT可以进一步磷酸化糖原合成酶3β（GSK3β），进而调控snail、slug及twist的磷酸化状态^［15］。磷酸化后的GSK3β失去对β-catenin磷酸化作用，β-catenin在细胞核内蓄积，介导肝癌细胞增殖及EMT相关基因的翻译^［16］，导致肿瘤细胞的侵袭及转移。

Ki67是肿瘤增殖的细胞标记物，其阳性程度代表肿瘤细胞增殖的活跃度^［17］，为了进一步验证木犀草素体内实验的影响，笔者采取了裸鼠种植瘤的方式，结果显示木犀草素组的肿瘤明显小于对照组，Ki67阳性率明显低于对照组，同时对能够稳定细胞骨架、形态的Vimentin表达与Ki67趋势相同，而能够为癌细胞提供转移表型的E-cadherin对照组却高于木犀草素组，这进一步说明木犀草素能够抑制Hep3B细胞的增殖和EMT过程，这和细胞实验结果相符^{［18，19］}。同时验证了木犀草素对基质金属蛋白酶（MMP）家族中的MMP2及MMP9的抑制作用，它们促进细胞外基质的破坏及重塑^［20］，进而促进癌细胞的侵袭及转移。

据报道，木犀草素具有抑制肿瘤增殖、凋亡及血管生成等多种抗肿瘤机制^{［21，22］}。但其在肝癌细胞侵袭迁移的作用机制尚不完全明确。本研究发现木犀草素以浓度-时间依赖抑制肝癌细胞Hep3B的增殖、迁移、侵袭及裸鼠成瘤能力。对AKT/GSK3β/β-catenin信号通路据有抑制作用，而当在高浓度木犀草素中加入AKT激动剂SC79后，较单纯高浓度木犀草素AKT的磷酸化水平明显提高，进一步说明木犀草素可以抑制AKT的磷酸化的表达，进而抑制GSK3β的磷酸化，促进β-catenin的降解。

故此，笔者得出木犀草素抑制肿瘤增殖、侵袭、转移及上皮间质转化的机制可能是通过抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路实现的，并为临床治疗肝癌提供潜在的靶点及药物。但尚未对其他可能的信号通路进行检测，仍需要更多的实验来验证。

作者贡献度说明：

骆泽潭，赵睿：设计实验方案、进行实验并撰写论文；张银亮、赵娜、奥迪负责分析数据；顾林、李大鹏负责论文格式进行修改；郑海伦：负责提供研究思路、负责指导论文撰写并对论文进行修改指正。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Han B， Zheng R， Zeng H， et al. Cancer incidence and mortality in China， 2022［J］. J Natl Cancer Cent， 2024，46（3）：221-231.

[2] 原发性肝癌诊疗指南（2024年版）［J/OL］.磁共振成像，1-18［2024-06-06］.

[3] Guidelines for the diagnosis and treatment of primary liver cancer （2024 edition） ［J/OL］. Chin J Magn Reson Imag， 1-18 ［2024-06-06］.

[4] Yang N， Zhou J， Li Q， et al. miR-96 exerts carcinogenic effect by activating AKT/GSK-3β/β-catenin signaling pathway through targeting inhibition of FOXO1 in hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Cell Int，2019，19：38.

[5] Marcucci F， Stassi G， De Maria R. Epithelial-mesenchymal transition： A new target in anticancer drug discovery［J］. Nat Rev Drug Discov，2016，5（5）：311-25.

[6] 解文浩，王飞，赵海平，等.恶性肿瘤中上皮—间质转化与多种信号通路关系的研究进展［J］.中国临床研究，2023，36（4）：633-637.

[7] Xie WH， Wang F， Zhao HP， et al. Research progress on the relationship between epithelial-mesenchymal transition and multiple signaling pathways in malignant tumors ［J］. Chin J Clin Res， 2023， 36（4）： 633-637.

[8] Liu W， Jing ZT， Wu SX， et al. A Novel AKT activator， SC79， prevents acute hepatic failure induced by fas-mediated apoptosis of hepatocytes［J］. Am J Pathol，2018，188（5）：1171-1182.

[9] Shrivastava N， Parikh A， Dewangan RP， et al. Solid self-nano emulsifying nanoplatform loaded with tamoxifen and resveratrol for treatment of breast cancer［J］. Pharmaceutics，2022，14 （7）.

[10] Yao X， Jiang W， Yu D， et al. Luteolin inhibits proliferation and induces apoptosis of human melanoma cells in vivo and in vitro by suppressing MMP-2 and MMP-9 through the PI3K/AKT pathway［J］. Food Funct， 2019， 10（2）： 703-712.

[11] Wu HT， Lin J， Liu YE， et al. Luteolin suppresses androgen receptor-positive triple-negative breast cancer cell proliferation and metastasis by epigenetic regulation of MMP9 expression via the AKT/mTOR signaling pathway［J］. Phytomedicine， 2021， 81： 153437.

[12] Kang KA， Piao MJ， Hyun YJ， et al. Luteolin promotes apoptotic cell death via upregulation of Nrf2 expression by DNA demethylase and the interaction of Nrf2 with p53 in human colon cancer cells［J］. Exp Mol Med，2019，51 （4）：1-14.

[13] 蒋航，犹秋香，陈波，等.木犀草素通过GSK-3β/β-catenin通路抑制胶质母细胞瘤细胞侵袭、迁移及上皮间质转化［J］.现代肿瘤医学， 2023， 31（22）： 4115-4122.

[14] Jiang H， You QX， Chen B， et al. Luteolin inhibits invasion，migration and epithelial-mesenchymal transition of glioblastoma cell through GSK-3β/β-catenin pathway ［J］. J Mod Oncol， 2023， 31（22）： 4115-4122.

[15] Lewis E， Seltun F， Razzaque MS， et al. Phosphate toxicity and epithelial to mesenchymal transition［J］.Adv Exp Med Biol， 2022： 73-84.

[16] Tang L， Wei R， Chen R， et al. Establishment and validation of a cholesterol metabolism-related prognostic signature for hepatocellular carcinoma［J］. Comput Struct Biotechnol J， 2022， 20： 4402-4414.

[17] Tang B， Tang F， Wang Z， et al. Upregulation of Akt/NF-κB-regulated inflammation and Akt/Bad-related apoptosis signaling pathway involved in hepatic carcinoma process： Suppression by carnosic acid nanoparticle［J］. Int J Nanomedicine， 2016： 6401-6420.

[18] Lander R， Nasr T， Ochoa SD， et al. Interactions between Twist and other core epithelial-mesenchymal transition factors are controlled by GSK3-mediated phosphorylation［J］. Nat Commun， 2013， 4（1）： 1542.

[19] Tian W, Li J, Wang Z, et al. HYD-PEP06 suppresses hepatocellular carcinoma metastasis, epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell-like properties by inhibiting PI3K/AKT and WNT/β-catenin signaling activation[J]. Acta Pharm Sin B, 2021, 11(6): 1592-1606.

[20] Luo Y, Ren F, Liu Y, et al. Clinicopathological and prognostic significance of high Ki-67 labeling index in hepatocellular carcinoma patients: A meta-analysis[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(7): 10235.

[21] Paulin D, Lilienbaum A, Kardjian S, et al. Vimentin: Regulation and pathogenesis[J]. Biochimie, 2022, 197: 96-112.

[22] Burandt E, Lübbersmeyer F, Gorbokon N, et al. E-Cadherin expression in human tumors: A tissue microarray study on 10,851 tumors[J]. Biomark Res, 2021, 9(1): 44.

[23] Winkler J, Abisoye-Ogunniyan A, Metcalf KJ, et al. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis[J]. Nat Commun,2020, 11(1): 5120.

[24] Prasher P, Sharma M, Singh SK, et al. Luteolin: A flavonoid with a multifaceted anticancer potential[J]. Cancer Cell Int, 2022, 22(1): 386.

[25] Imran M, Rauf A, Abu-Izneid T, et al. Luteolin, a flavonoid, as an anticancer agent: A review[J]. Biomed Pharmacother, 2019, 112: 108612.

基金资助

安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）(2022AH040216)

安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）(2022AH051489)

安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）(2023AH0519542)

蚌埠医科大学自然科学研究项目(2020byzd170)