血液代谢物与糖尿病肾脏疾病因果关系的孟德尔随机化研究

A Mendelian randomized study on the causal relationship between blood metabolites and diabetic kidney disease

摘要

目的 采用两样本孟德尔随机化方法探索血液代谢物与糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）发病风险之间的因果关系。 方法 一项涉及7 824名参与者的全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）提供了486种人类血液代谢物的数据。初步分析使用了芬兰数据库的DKD GWAS数据，包含4 111例欧洲病例和308 539例对照。复制分析的DKD结局数据从IEU OpenGWAS project网站获取，包含1 032例欧洲病例和452 280例对照。使用逆方差加权法作为主要分析方法，辅以MR-Egger、加权中位数法。采用错误发现率进行多重比较控制假设检验水准。进行敏感性分析评估结果的可靠性。此外，还进行了连锁不平衡评分回归、steiger检验、复制及荟萃分析、混杂分析以全面验证因果关系。 结果 γ-谷氨酰亮氨酸（OR=3.71，95%CI：1.23-11.18，P_IVW=0.0196，P_FDR=0.042）、羟色氨酸（OR=4.55， 95%CI：1.81-11.48， P_IVW＝0.0013，P_FDR=0.024）、辛酰基肉毒碱（OR=1.99，95%CI：1.11-3.58，P_IVW=0.0207，P_FDR=0.042）、1，7-二甲基尿酸（OR=1.74，95%CI：1.04-2.90，P_IVW=0.0351，P_FDR=0.045）、缓激肽（OR=1.19，95%CI：1.01-1.40，P_IVW=0.0428，P_FDR=0.047）及亚油酸二合物（OR=7.23，95%CI：1.07-48.59，P_IVW=0.042，P_FDR=0.047）与DKD发病风险呈正相关。敏感性分析结果稳健，结果不存在异质性和水平多效性。 结论 本研究阐明了与DKD因果相关的特定血液代谢物，为疾病干预提供了潜在的靶点，并有助于其早期筛查和预防。

Abstract

Objective To investigate the causal relationship between blood metabolites and the risk of diabetic kidney disease （DKD） by using two-sample Mendelian randomization analysis. Methods A genome-wide association study （GWAS） involving 7 824 participants provided information on 486 human blood metabolites.The preliminary analysis used DKD GWAS data from a Finnish database containing 4 111 European cases and 308 539 controls.DKD outcome data for replication analysis were obtained from the IEU OpenGWAS project website and included 1 032 European cases and 452 280 controls. Inverse variance weighting method was used as the main analysis method， supplemented by MR-Egger and weighted median method. Multiple comparisons were conducted using false discovery rate to control the level of hypothesis testing. Sensitivity analysis was performed to evaluate the reliability of the results. In addition， linkage disequilibrium score regression， steiger test， replication and meta-analysis， and confounding analysis were performed to fully verify causality. Results γ-Glutamyl-leucine （OR=3.71， 95%CI： 1.23-11.18， P_IVW=0.019 6，P_FDR=0.042）， hydroxytryptophan （OR=4.55， 95%CI：1.81-11.48， P_IVW＝0.001 3，P_FDR=0.024）， octanoylcarnitine （OR=1.99， 95%CI： 1.11-3.58， P_IVW=0.020 7，P_FDR=0.042）， 1， 7-dimethyluric acid （OR=1.74， 95%CI： 1.04-2.90， P_IVW=0.035 1，P_FDR=0.045）， bradykinin （OR=1.19， 95%CI： 1.01-1.40， P_IVW=0.042 8，P_FDR=0.047） and dihomo-linoleate （OR=7.23， 95%CI： 1.07-48.59， P_IVW=0.042，P_FDR=0.047） were positivelycorrelated with the risk of DKD.The results of sensitivity analysis were robust and there was no heterogeneity or horizontal pleiotropy. Conclusion This study elucidates specific blood metabolites causally associated with DKD， providing potential targets for intervention and contributing to its early screening and prevention.

Graphical abstract

关键词

血液代谢物 / 糖尿病肾脏疾病 / 因果推断 / 孟德尔随机化

Key words

Blood metabolites / Diabetic kidney disease / Causal inference / Mendelian randomization

糖尿病肾脏疾病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病严重的微血管并发症，流行病学调查结果显示糖尿病患者中约有20%~40%会发生DKD^［1］。DKD也是全球范围内导致终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）的主要原因，大大增加了糖尿病患者的心血管事件和死亡风险，给个人和社会带来了重大负担^［2］。因此，了解DKD的发病机制及寻找新型靶点对防治DKD具有重要意义。

代谢紊乱是DKD的显著特征和始动因素。血液代谢物，作为响应环境暴露的功能中间体，可以预测或影响疾病的发展，具有作为疾病早期生物标志物的潜力^［3］。在糖尿病患者中，血清代谢组的改变可能预示着DKD的发生^［4，5］。但现有两者关系的研究多为临床观察性研究，存在样本量小、易受到混杂因素影响、个体化差异大、缺少对差异代谢物进行有效验证等局限性。因此，有必要寻找新的方法对血液代谢物与DKD的因果关系进行全面系统的研究。

孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是流行病学研究中广泛使用的一种方法，它使用与暴露和结局相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为工具变量（instrumental variables，IVs）来评估两者的因果关系^［6］。由于SNP在受孕期间随机分配给后代，并发生在疾病之前，这在很大程度上避免了混杂因素和反向因果关系的影响^［7］。本研究采用两样本MR分析以评估血液代谢物与DKD之间的因果关系，以期为DKD的早期诊断和预防提供一定的参考。

1 资料和方法

1.1 研究设计

如图1所示，本研究以血液代谢物为暴露因素，以DKD为结局变量，利用全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）数据，筛选与暴露因素显著相关的SNPs作为IVs，使用两样本MR方法探讨血液代谢物与DKD的因果关系，并进行异质性检验、多效性检验等敏感性分析验证结果的可靠性。本MR分析满足以下三个主要假设：（1）相关性假设：IVs与暴露有强相关性；（2）独立性假设：IVs必须与暴露及结局相关的混杂因素无关；（3）排他性假设：IVs只能通过暴露影响结局^［8］。

1.2 数据来源

血液代谢物的遗传数据从代谢组学GWAS服务器（https：//metabolomics.helmholtz-muenchen.de/gwas/）访问。这是迄今为止关于血液代谢物遗传位点的最全面的报告，通过Shin等人^［9］进行的高通量代谢分析的全基因组关联扫描，确定了486种代谢物的210万个SNPs。该研究包括了欧洲7 824名成年人，其中1 768名参与者来自德国，6 056人来自英国。在486种代谢物中，有107种因其化学性质不明确而被定义为未知，已知的309种代谢物可分为8类：辅因子和维生素、能量产物、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷酸、肽和外源性代谢物。DKD初步分析的GWAS数据来自芬兰数据库，其中包含欧洲4 111例DKD患者和308 539例对照。复制分析的DKD数据集（GWAS ID：Gebi-a-GCST90018832）通过IEU Open GWAS project网站（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/）获取，包含1 032例欧洲病例和452 280例对照（图1）。由于研究数据来自公共数据库，并且只使用了摘要级数据，因此无需进行伦理审查。

1.3 IVs的筛选

本研究通过一系统步骤筛选符合假设的IVs：（1）考虑到血液代谢物的GWAS样本量较小，我们选择了一个较宽松的关联阈值（P<5×10^-6）来选择与暴露相关的工具变量，该标准已在以往的研究中被广泛应用^{［10，11］}；（2）去除连锁不平衡以保证IVs之间的独立性（r²<0.001，kb＝10 000）^［12］；（3）使用 F=\frac{N-k-\mathrm{1}}{k}\times \frac{R^{\mathrm{2}}}{\mathrm{1}-R^{\mathrm{2}}},R^{\mathrm{2}}=\frac{\mathrm{2}\times {\beta }^{\mathrm{2}}\times EAF\times (\mathrm{1}-EAF)}{[\mathrm{2}\times {\beta }^{\mathrm{2}}\times EAF\times (\mathrm{1}-EAF)+\mathrm{2}\times (se{(\beta ))}^{\mathrm{2}}\times N\times EAF\times (\mathrm{1}-EAF)]}公式计算F统计量来量化遗传变异的强度，剔除F<10的弱工具变量^［13］。公式中“N”代表暴露因素的样本量，“β”代表 SNP对暴露的效应量，“SE”是“β”的标准误，“EAF”是效应等位基因频率；④剔除回文SNP，防止等位基因对因果关系的影响；⑤排除与结局相关的工具变量（P<1×10^-5）。

1.4 数据分析

本研究主要采用逆方差加权法（inverse-variance-weighted，IVW）评估血液代谢物和DKD的因果关系。IVW法的估计值来自对所有遗传变异的Wald比率的汇总分析，在所有SNP均有效独立的假设下，IVW法提供了对因果效应最准确的评估^［14］。MR-Egger回归法、加权中位数法（weighted median，WM）作为补充分析^{［15，16］}。在宽松的条件下，这两种方法可以提供更稳健的估计值。不同方法效应量（β值）方向与IVW一致表明结果稳健。采用错误发现率（false discovery rate，FDR）校正来控制多次测试中的假阳性，P_FDR<0.05表明代谢物与DKD风险具有因果关系。

敏感性分析包括异质性检验、多效性检验和逐个剔除检验。使用Cochran-Q test评估SNP间的异质性^［17］，使用MR-Egger-intercept检验水平多效性，P<0.05被认为存在异质性和多效性^［18］。进行留一法（leave-one-out sensitivity test，LOO）分析，通过依次丢弃每个SNP，然后进行MR分析来评估结果是否受到单个SNP的严重影响^［19］。

当暴露与结局之间存在遗传相关性时，MR估计可能无法准确表示因果效应。为了评估已确定的因果关系是否受到常见遗传因素的影响，我们使用连锁不平衡评分（linkage disequilibrium score，LDSC）回归检查了已确定的代谢物与DKD之间的遗传关联。此外，我们对发现与DKD有因果关系的血液代谢物进行了MR Steiger测试，以验证暴露导致的结果的方向性^［20］，P<0.05被认为具有统计学意义。为了确保初步MR分析结果的可靠性和稳定性，我们按照上述步骤使用另一个DKD GWAS数据集进行了重复的 IVW分析，在复制研究后，我们进行了荟萃分析以确定对DKD有因果影响的血液代谢物。为了评估混杂变量的潜在影响，我们使用Phenoscanner V2网站研究了所有符合条件的SNP与DKD相关的混杂因素的潜在相关性，包括吸烟^［21］、高血压^［22］、高尿酸^［23］和高血脂^［24］。如果SNP与这些潜在混杂因素相关（P<1×10^–5），在去除SNP后重复IVW以验证结果的稳健性。数据处理和分析使用R 4.3.2 软件。

2 结果

2.1 遗传工具变量筛选

根据严格的质量控制程序对486个血液代谢物进行筛选，得到IVs的SNP数量从0到125不等，且IVs的F统计量均大于10（最小F统计量为20.25），表明所有的SNPs均可以进行MR分析。

2.2 MR分析结果

IVW方法最初鉴定出了37种与DKD相关的血液代谢物（P_IVW<0.05），包括21种未知代谢物和16种已知代谢物。由于本研究涉及多个暴露，为了减少Ⅰ型错误的概率，采用FDR法对检验P值进行校正，结果表明这37种代谢物的P_FDR均小于0.05，降低了假阳性风险。见表1。结合MR-Egger、WM法分析后，去除IVW、MR-Egger和WM结果方向不一致的代谢物，共筛选出17种已知的血液代谢物，包括3-甲基-2-氧代戊酸酯（OR=0.244，95%CI：0.092-0.649， P_IVW=0.004 7）、甘露醇（OR=0.697， 95%CI：0.502-0.969， P_IVW=0.031 9）、γ-生育酚（OR=0.455，95%CI：0.228-0.910，P_IVW=0.025 9）、月桂酸酯（OR=2.729，95%CI： 1.076-6.920，P_IVW=0.034 4）、亚油酸二合物（OR=7.226， 95%CI： 1.075-48.589， P_IVW=0.041 9），己酰基肉毒碱（OR=1.919， 95%CI： 1.115-3.303， P_IVW=0.018 6）、丁酰基肉毒碱（OR=1.465， 95%CI： 1.005-2.136， P_IVW=0.047）、辛酰基肉毒碱（OR=0.6， 95%CI： 0.401-0.897， P_IVW=0.012 9）、1-棕榈酰甘油磷酸乙醇胺（OR=0.439， 95%CI： 0.202-0.956， P_IVW=0.038）、顺式-4-癸烯酰基肉碱（OR=2.631， 95%CI： 1.232-5.620， P_IVW=0.012 4）、γ-谷氨酰亮氨酸（OR=3.666， 95%CI： 1.291-10.414，P_IVW=0.014 7）、缓激肽（OR=1.186， 95%CI： 1.006-1.399， P_IVW=0.042 8）、环（脯氨酸-亮氨酸）（OR=1.617， 95%CI： 1.045-2.499，P_IVW=0.030 7）、1，7-二甲基尿酸盐（OR=1.736， 95%CI： 1.039-2.899，P_IVW=0.035 1）、美托洛尔酸代谢产物（OR=0.948， 95%CI： 0.906-0.992，P_IVW=0.022 3）、羟色氨酸 （OR=4.55，95%CI：1.806-11.477， P_IVW=0.001 3）、甲基抗坏血酸盐（OR=0.448，95%CI：0.226-0.890， P_IVW=0.021 8）。见表1及图2。

2.3 质量控制分析

LOO分析没有发现可能影响扭曲总体效应估计的偏倚SNPs，见图3。Cochran Q检验和MR-Egger-intercept结果提示无需考虑异质性和基因多效性对结果的影响（P>0.05）。使用LDSC对暴露和结局进行分析，保留P>0.05的14个已知代谢物，提示不存在遗传关联。Steiger检验结果表明这14种代谢物到DKD的趋势一致（TRUE，Steiger P< 0.05），见表2。

2.4 复制和荟萃分析

为了增强研究结果的可靠性，我们对另一个DKD GWAS数据集进行了重复的MR分析。荟萃分析的结果进一步证实了7种已知代谢物与DKD存在因果关系，见图4。

2.5 混杂分析

虽然敏感性分析在本研究中已经排除了违反估计值的SNP，但为了满足独立性假设，我们逐一检查了这7种已知代谢物相关的所有SNP是否与Phenoscanner中DKD的常见危险因素（吸烟、高血压、高尿酸和高血脂）有关。在3种已知代谢物中，γ-谷氨酰亮氨酸的一个SNP rs715与高血压相关性状相关，我们手动消除该SNP并重复IVW分析，丢弃该SNP后结果仍然显著（OR=3.714，95%CI：1.234-11.176，P_IVW =0.0196）；辛酰基肉毒碱的一个SNP rs274567与高血压相关性状相关，丢弃该SNP后IVW分析的结果仍然显著（OR=1.993，95%CI：1.111-3.576，P_IVW =0.0207）；丁酰基肉毒碱的一个SNP rs1171617与高尿酸相关表型相关，一个SNP rs274567与高血压表型相关，一个SNP rs662138与高脂血症相关表型相关。在去除rs1171617、rs274567和rs662138后，丁酰基肉毒碱与DKD之间的因果关系不再显著（OR=1.399， 95%CI：0.936-2.092，P_IVW =0.1018）。其余4种已知代谢物的SNP均未与以上混杂因素相关。

3 讨论

为了揭示血液代谢物对DKD发生发展的潜在影响，本研究通过两样本MR分析，评估了486种血液代谢物对DKD的因果效应，结果表明，遗传决定的γ-谷氨酰亮氨酸、羟基色氨酸、辛酰基肉毒碱、1，7-二甲基尿酸盐、缓激肽、亚油酸二合物水平的增加与DKD的发生风险增加有关。

肾脏在氨基酸的合成、降解和转化过程中起着关键作用，以往的大量研究都强调了色氨酸代谢物及其中间产物在肾脏疾病发病机制中的重要意义^［25］。羟色氨酸作为色氨酸代谢的衍生物，研究发现其可以与芳基烃受体结合，从而启动氧化应激和炎症，从而介导肾纤维化^［26］。Zhang等^［27］报道了糖尿病性肾小球病患者中羟色氨酸水平的升高，这与我们的研究结果一致。γ-谷氨酰亮氨酸是由γ-谷氨酸和亮氨酸组成的二肽，先前的研究发现，亮氨酸和谷氨酰胺与T2DM患者的eGFR水平存在负相关，与较高的ESRD风险呈正相关^［28］。而本研究的结果亦表明升高的γ-谷氨酰亮氨酸水平与DKD风险的增加相关，其机制可能与γ-谷氨酰亮氨酸增加心脏代谢风险有关^［29］。

肾脏作为一种高代谢的器官，需要大量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）来维持其生理功能。肾小管上皮细胞属于线粒体富集细胞，利用线粒体脂肪酸β氧化（fatty acid β-oxidation，FAO）提供ATP，线粒体β氧化受损的脂质标志物在一定程度上可以反映DKD的疾病进展^［30］。一项来自5个荷兰独立队列的3 089名T2DM个体的血清代谢组学结果显示T2DM患者的eGFR水平与亚油酸水平呈负相关^［31］。本研究中发现高亚油酸水平与DKD发病风险增加相关，其可能通过调节能量和脂质代谢参与了DKD的发病。辛酰基肉毒碱是FAO的中间产物，线粒体损伤后，酰基肉碱在血浆中积累，为DKD进展过程中FAO速率提供了一个潜在的指标^［32］。因此，辛酰基肉毒碱有望成为预测DKD发生和进展的生物标志物。

缓激肽是血浆激肽释放酶-激肽系统的基本组成部分，既往观察性研究发现，在糖尿病患者中，较高的血浆激肽激酶水平与较高的白蛋白排泄率相关^［33］。足细胞损伤是DKD的标志之一，导致蛋白尿与肾脏损伤。Saoud等^［34］分析了缓激肽处理的大鼠足细胞的蛋白质组谱，并进行了通路富集分析。结果表明，缓激肽刺激COX-2和PGE₂蛋白的表达，从而促进足细胞凋亡，加速疾病进展。通路富集分析显示，缓激肽抑制细胞死亡通路和细胞骨架元件的结合，激活炎症通路。提示缓激肽可能通过促进炎症反应和足细胞损伤而增加DKD的风险。1，7-二甲基尿酸是咖啡因的代谢物之一，先前的研究表明，其水平的升高可能会损害内皮细胞和肾小管细胞，增加肾结石的风险，并加重肾脏恶化^［35］。我们的结果也提示1，7-二甲基尿酸对DKD的有害影响。

本研究使用严格的MR分析发现了6种与DKD患病风险呈正相关的血液代谢物，为DKD的早期筛查、预防和治疗提供了一定参考。然而，我们的研究也存在一定的局限性。首先，由于达到全基因组意义的SNPs数量有限，我们的MR分析设置了一个稍宽松的阈值，这也是其他研究的做法。然而，每个SNP的F统计量都大于10，表明没有较弱的工具变量。其次，我们的MR分析来自欧洲血统个体的GWAS数据。因此，将我们的发现外推到不同的人群中时，需要进行额外的探索和验证。第三，虽然MR分析为病因学提供了有价值的见解，但需要注意的是，我们的研究结果在应用于临床之前，应该通过进一步的基础研究来验证。此外，由于肾脏的生理特性，仅研究血液就会遗漏相关代谢物的一些关联。需要进一步的调查来阐明尿液代谢物和DKD之间的因果关系。

作者贡献度说明：

朱玲玲、钮杰宇：负责研究设计、数据提取、整理、分析及论文撰写；谭莹：文章撰写指导及润色；佘云：参与数据提取与分析；余江毅、严倩华：文章整体把控、文章修改与内容审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82004286)

江苏省中医药管理局项目(ZT202206)

江苏省研究生实践创新计划项目(SJCX23_0873)