基于Hippo/YAP通路探讨红花总黄酮对肝星状细胞活化增殖的作用机制研究

Exploring the effects of total flavonoids from Carthamus tinctorius L on hepatic stellate cells based on the Hippo/YAP pathway

摘要

目的 研究红花总黄酮（TFCTL）对肝星状细胞活化增殖的作用与机制。 方法 培养对数生长期的HSC‑T6细胞，用10 ng/mL的TGF‑β1刺激诱导其活化，分为空白组、TGF‑β组、TFCTL低浓度组（20 μg/mL）、TFCTL中浓度组（40 μg/mL）、TFCTL高浓度组（60 μg/mL）；用CCK‑8试剂盒和凋亡试剂盒检测红花总黄酮干预HSC‑T6细胞后的增殖活性和凋亡率；免疫荧光染色法观察各组细胞中α‑SMA 、YAP表达及位置情况；RT‑qPCR法检测α‑SMA、CollagenⅠ、MST1、LATS1、YAP mRNA表达水平，Western blot 检测α‑SMA、CollagenⅠ、MST1、LATS1、p‑YAP/YAP的蛋白表达量。 结果 红花总黄酮可显著抑制活化的HSC‑T6细胞的增殖，并促进其凋亡；RT‑qPCR和Western blot检测结果发现，与空白组相比，TGF‑β组中α‑SMA、Collagen Ⅰ 、YAP mRNA水平和蛋白表达量显著增加（P<0.01），MST1、LATS1 mRNA水平和蛋白表达量明显降低（P<0.05）；与TGF‑β组相比，TFCTL低、中、高浓度组中α‑SMA、CollagenⅠ、YAP mRNA水平和蛋白表达量显著降低（P<0.01），MST1、LATS1 mRNA水平和蛋白表达量显著增加（P<0.01）；免疫荧光定量实验表明，TFCTL干预后，HSC‑T6细胞中α‑SMA的荧光强度逐渐降低，并促进了YAP的核转移。 结论 TFCTL可能通过抑制Hippo/YAP通路各级激酶的表达，抑制肝星状细胞的活化增殖，进而减轻肝纤维化。

Abstract

Objective To study the effect and mechanism of total saffron flavonoids （TFCTL） on the activation and proliferation of hepatic stellate cells. Methods HSC‑T6 cells in logarithmic growth phase were cultured， and their activation was induced by stimulation with 10 ng/mL of TGF‑β1， which were divided into the blank group， TGF‑β group， TFCTL low‑concentration group （20 μg/mL）， TFCTL‑medium‑concentration group （40 μg/mL），and TFCTL‑high‑concentration group （60 μg/mL）； the CCK‑8 kit and apoptosis kit were applied to detect the proliferative activity and apoptosis rate of HSC‑T6 cells after the intervention of safflower total flavonoids； immunofluorescence staining method was used to observe the expression and position of α‑SMA and YAP in the cells of each group； RT‑qPCR was used to detect the expression levels of mRNA of α‑SMA， CollagenⅠ， MST1， LATS1 and YAP， and Western blot was used to detect the expression levels of α‑SMA， CollagenⅠ， MST1， LATS1，and p‑YAP/YAP protein expression. Results Total flavonoids of safflower significantly inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of activated HSC‑T6 cells. RT‑qPCR and Western blot assays revealed that α‑SMA， CollagenⅠ， and YAP mRNA levels and protein expression were significantly increased in the TGF‑β group compared with the blank group （P<0.01）， and the levels of MST1， LATS1 mRNA levels and protein expression were significantly reduced （P<0.05）； compared with the TGF‑β group， α‑SMA， CollagenⅠ， YAP mRNA levels and protein expression were significantly reduced （P<0.01）， and MST1， LATS1 mRNA levels and protein expression were significantly increased （P<0.01） in the TFCTL low‑， medium‑， and high‑concentration groups； quantitative immunofluorescence experiments showed that after TFCTL intervention，the fluorescence intensity of α‑SMA in HSC‑T6 cells was gradually reduced and the nuclear translocation of YAP was promoted. Conclusion TFCTL may inhibit the activation and proliferation of hepatic stellate cells by suppressing the expression of kinases at all levels of the Hippo/YAP pathway， and then attenuate liver fibrosis.

Graphical abstract

关键词

肝纤维化 / 肝星状细胞 / 红花总黄酮 / Hippo/YAP通路 / HSC‑T6细胞

Key words

Liver fibrosis / Hepatic stellate cells / Carthamus tinctorius L of total flavonoids / Hippo/YAP pathway / HSC‑T6 Cells

肝脏在面临各种原因导致的肝损伤时，常伴随着纤维化的发生，其发生的核心事件是肝星状细胞由静止状态转变为激活状态，失去了储备维生素A的能力，转化为肌成纤维细胞，导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的大量沉积，进而导致肝纤维化^［1‑3］，近年来，中医药以多靶点、多途径的特点在肝纤维化机制研究中优势显著^［4］。

已有文献表明，黄酮类成分具有抗肝纤维化的作用，其作用机制与抗炎、抗凋亡、抑制细胞外基质的异常堆积等有关，并通过多通路、多靶点减轻或逆转肝纤维化进程^［5‑7］；而红花在众多治疗肝病的蒙药方剂中作为一种君药，扮演着重要角色，其作为单味药也具有抗肝纤维化的作用^［8，9］，但红花总黄酮（total flavonoids from Carthamus tinctorius L，TFCTL）在肝纤维化中作用机制的研究鲜有报道。

研究表明Hippo/YAP通路作为一种与肝纤维化联系密切的信号途径^［10］，主要由激酶复合物哺乳动物不育系20样激酶 1（mammaliansterile20‑likekinase1/2，MST1/2） 、肿瘤抑制激酶1/2（Large tumor suppressor kinase1/2，LATS1/2 ） 、支架蛋白含WW结构域的人同源重组蛋白1（SAV1）、MOB激酶激活因子1A （MOB kinase activator 1A， MOB1）、下游转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）组成及转录因子TEA结构域1‑4（TEAD1‑4）组成^{［11，12］}。MST1、LATS1是Hippo信号通路激酶链中的核心蛋白，而支架衔接蛋白SAV1、MOB1A/B可增强MST1和LATS1的活化，进一步磷酸化YAP，磷酸化的YAP可与14‑3‑3蛋白进行结合，进一步发生泛素化降解，使YAP失去转录功能。

基于此，本研究通过建立HSC‑T6细胞活化模型，进行体外干预，研究红花总黄酮抗肝纤维化的作用，并初步探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞系及主要试剂

大鼠肝星状细胞（HSC‑T6）购自苏州海星生物科技有限公司。红花中药材购于安国市荣华本草中药材有限公司（C294220505）；CCK‑8试剂盒购于Biosharp生物科技公司；Annexin V‑FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；PAGE凝胶试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗鼠α‑SMA单克隆抗体、兔抗鼠Collagen Ⅰ抗体购于景杰生物科技股份有限公司；兔抗鼠YAP抗体、兔抗鼠LATS1抗体购于北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠MST1抗体、兔抗鼠GAPDH抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司，兔抗鼠p‑YAP抗体购于江苏亲科生物有限公司。

1.2 实验主要仪器

本研究所用主要仪器有1000B‑8W型药物粉碎机，CLx800酶标仪购自美国Biotek公司，CT15RE高速离心机购自日本Hitachi公司，DYY‑6C型电泳仪购自北京六一公司，荧光显微镜。

1.3 红花总黄酮的提取

将红花药材粉碎过筛后，采用乙醇回流提取法，按料液比1∶10的比例，用80%乙醇回流提取两次，第一次2 h，第2次1 h，合并两次滤液，浓缩获得浸膏。以水混悬红花浸膏，用AB‑8型大孔树脂进行吸附，50%乙醇洗脱并收集滤液，浓缩干燥获得红花总黄酮粉末。以芦丁为标准品，用紫外分光光度计在510 nm处测得吸光度并绘制标准曲线（回归方程：Y=32.45X-0.0034），用标准曲线法测得红花总黄酮含量为60%。

1.4 HSC‑T6细胞培养及给药干预

取出冻存的HSC‑T6细胞进行复苏，待其生长汇合度达到80%~90%时可进行细胞传代，当细胞处于对数生长期时可进行铺板操作，分为空白组、TGF‑β组、红花总黄酮低、中、高浓度组；待孔板里的细胞贴壁后给予TGF‑β1诱导其活化，24 h后进行药物干预，继续孵育24 h，随后进行提取总蛋白和总RNA的操作。

1.5 CCK‑8检测

常规培养上述细胞，消化离心对数生长期细胞，接种细胞至96孔板（每孔5 000个细胞），设置空白组（不含细胞）、对照组（有细胞无药物干预）、药物浓度梯度组（有细胞且药物干预），每组5个复孔，通过细胞计数后，稀释到一定浓度的细胞悬液，计算出所需细胞悬液，每孔200 μL细胞悬液，待细胞贴壁后，继续培养8 h后进行给药；设置药物浓度梯度为20、40、60、80 μg/mL弃上清，加入提前用DMEM配好的药物，继续培养24、48、72 h，每一时间节点需要加入CCK‑8试剂10 μL，继续孵育2~4 h，用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度值并记录，随后计算抑制率（%）=［（对照组‑处理组）/（对照组‑空白组）］×100%。

1.6 流式细胞术检测HSC‑T6细胞凋亡

细胞按上述操作步骤常规培养至对数生长期时，进行铺板，设置分组为无染组、单染FITC组、单染PI组、空白组、TGF‑β组、红花总黄酮低、中、高浓度组；待其贴壁后，除空白组外各组均加TGF‑β1，刺激HSC‑T6细胞活化，24 h后进行药物干预，然后继续培养24 h后，收集上清液，用PBS清洗2次，均收集到相应离心管中；每孔加250 μL的胰酶消化2 min，加等量完全培养基终止消化，再次收集液体至上述离心管内，1 400 r/min，离心5 min；弃掉上清，用1 mL PBS轻轻重悬，再次离心，弃上清，每管均加195 μL结合液，轻轻重悬，两个单染组分别加染色液FITC和PI，不染组两者都不加，其余组均加入染色液FITC和PI；轻轻用枪头混合，避光孵育15 min，过滤膜，转移细胞悬液至冰上的流式管内，最后上机检测即可。

1.7 实时荧光定量（RT‑qPCR）法检测纤维化标志因子及Hippo通路相关因子mRNA表达

常规培养细胞接种至孔板中，根据上述分组给予TFCTL药液干预，收集各组细胞，采用离心柱法提取总RNA，反转录成cDNA作为后续模板，然后根据RT‑PCR试剂盒配制体系检测模板中mRNA的水平，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，2^‑ΔΔCt法分析CT值，计算出mRNA相对表达量。

1.8 Western blot法检测纤维化标志因子及Hippo通路相关因子蛋白表达

收集孔板中上述各组细胞至离心管中，采用配制裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）的方法，置于冰上裂解30 min后，18 700 g离心10 min，吸取上清转移至新的EP管中，按4∶1的比例加入5×蛋白上样缓冲液，在金属浴100 ℃下蛋白变性10 min，室温冷却后在-20 ℃冰箱中保存备用。制备分离胶和浓缩胶，分离胶80 V恒压电泳，浓缩胶120 V恒压电泳，200 mA湿转膜，5%脱脂奶粉封闭3 h，4 ℃过夜孵育一抗，次日孵育荧光二抗1 h，TBST清洗3次，10 min/次，最后上机显影，采用ImageJ软件统计各组灰度值，并与内参GAPDH灰度值相比，进行统计分析。

1.9 细胞免疫荧光法检测α‑SMA和YAP的表达及位置情况

如上述步骤常规培养HSC‑T6细胞至生长对数期，在铺板操作前4 h，在12孔板中加入1x多聚赖氨酸适量，以覆盖孔板底部为宜，然后均匀接种细胞悬液至12孔板中，培养至贴壁，除空白组外均给予TGF‑β1刺激12 h，接着给予红花总黄酮药液干预，继续培养24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1% Triton x‑100通透6 min，5% BSA封闭30 min，上述每步操作后均用PBS清洗3 min/次，最后4 ℃过夜孵育一抗，次日37 ℃避光孵育二抗1 h，DAPI复染核并封片（含DAPI的防荧光淬灭剂），荧光显微镜进行观察染色情况，拍取需要的视野并保存。

1.10 统计学处理

利用SPSS 25.0和GraphPad Prism软件作为本实验所有数据的统计分析和作图工具，以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较时，数据符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析ANOVA进行统计学处理。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 红花总黄酮对HSC‑T6细胞增殖活性的影响

用CCK‑8试剂盒筛选药物最佳浓度，在相同时间不同浓度与对照组相比，TFCTL各浓度梯度组对HSC‑T6细胞的抑制率有明显增加趋势，在浓度为20、40、60 μg/mL时抑制率显著增加（P<0.01），且有统计学意义，因此后续细胞实验选择此3个浓度梯度作为低、中、高浓度组。见表1。

2.2 红花总黄酮对HSC‑T6细胞凋亡的影响

与空白组相比，TGF‑β组的凋亡率无显著变化，无统计学意义；与TGF‑β组相比，红花总黄酮各给药组的总凋亡率均增加，但更倾向于早期凋亡（P<0.05），F为4.2，见图1。

2.3 RT‑PCR法检测各组HSC‑T6细胞中α‑SMA、Collagen Ⅰ、MST1、LATS1、YAP的mRNA相对表达水平

如表2所示，与空白组相比，TGF‑β组中α‑SMA、Collagen Ⅰ、YAP mRNA水平明显增加（P<0.05），而MST1、LATS1 mRNA水平明显减少（P<0.05）；与TGF‑β组相比，红花总黄酮各干预组中α‑SMA、Collagen、YAP mRNA水平显著减少（P<0.01），而MST1、LATS1 mRNA水平显著增加（P<0.01）。见表2。

2.4 Western blot法检测各组HSC‑T6细胞中α‑SMA、Collagen Ⅰ、LATS1、YAP、p‑YAP/YAP的蛋白表达水平

与空白组比较，TGF‑β组中α‑SMA、Collagen Ⅰ蛋白表达量明显增加（P<0.05），而LATS1、p‑YAP/YAP蛋白表达量明显减少（P<0.05）；与TGF‑β组相比，红花总黄酮各干预组中α‑SMA、Collagen蛋白表达量显著减少（P<0.01），而MST1、LATS1、p‑YAP/YAP蛋白表达量明显增加（P<0.05）。见图2、表3。

2.5 免疫荧光法检测各组HSC‑T6细胞内α‑SMA、YAP的位置表达情况

结果表明，与空白组相比，TGF‑β中α‑SMA的荧光强度明显降低，与TGF‑β组相比，红花总黄酮干预后，HSC‑T6细胞中α‑SMA 的荧光强度明显降低。与空白组相比，TGF‑β中YAP的荧光强度明显降低且主要集中在核内。与TGF‑β组相比，红花总黄酮干预后，HSC‑T6细胞中YAP的荧光主要集中在细胞质，说明促进了YAP的核转移。见图3。

3 讨论

肝纤维化是由各种慢性肝损伤逐渐演变而来的肝脏病变，如不及时干预，极有可能发展为不可逆的肝硬化，甚至肝癌^{［13，14］}；因此逆转肝纤维化期是极其重要的。目前，HSC活化与肝纤维化的发生、发展联系密切，正常情况下，其在肝脏中处于静止状态，当肝脏损伤后会产生大量的炎性因子和趋化因子，使静止期的HSC活化转变为肌成纤维细胞， 继而产生大量胶原等ECM成分沉积于肝脏内，导致纤维性瘢痕形成^{［15，16］}；红花总黄酮作为中药红花的主要有效成分，可通过作用于肝脏中各种细胞，并从分子生物学角度探究其作用机制，已达到保护和治疗肝病的目的^［17］。研究表明总黄酮对抗纤维化具有显著的作用，但红花总黄酮抗肝纤维化的作用机制尚不明确，基于此，本实验将红花总黄酮对活化的HSC‑T6细胞进行体外药效评价并对可能作用机制开展初步探索。在本研究中，红花总黄酮低中高浓度组显著降低了纤维化标志物（α‑SMA、Collagen Ⅰ）的mRNA水平与蛋白表达量，同时也显著增加了Hippo通路中各级激酶MST1及LATS1的表达，抑制了YAP的核转录并促进其磷酸化水平，表明了红花总黄酮对肝纤维化的药效学作用显著，其作用机制与Hippo通路中关键蛋白MST1、LATS1、YAP及其磷酸化有关，进而发挥抗肝纤维化作用。

综上所述，发现红花总黄酮可通过体外抑制HSC‑T6细胞的活化增殖并促进其凋亡，初步证实了其具有抗肝纤维化的作用；通过增加MST1和LATS1的表达并促使YAP发生磷酸化， 进而抑制下游靶基因在Hippo信号转导途径的表达，表明其机制与Hippo/YAP通路相关，因此为肝纤维化药物的治疗及研发提供新的思路，但本研究只局限在体外实验，后续进一步进行体内动物模型的实验验证。

作者贡献度说明：

赵晓璐、李明奇、王映荷：实验操作、论文研究撰写、数据整理、统计学分析；马月宏：指导、论文修改、经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Pei Q， Yi Q， Tang L. Liver fibrosis resolution： From molecular mechanisms to therapeutic opportunities［J］. Int J Mol Sci， 2023，24（11）：9671.

[2] Gao CC， Bai J， Han H，et al. The versatility of macrophage heterogeneity in liver fibrosis［J］. Front Immunol， 2022，13：968879.

[3] Kamm DR， McCommis KS. Hepatic stellate cells in physiology and pathology［J］. J Physiol， 2022，600：1825‑1837.

[4] 谢玉宝，萧焕明，施梅姐，等.肝纤维化的中医药治疗进展［J］.时珍国医国药，2016，27（3）：703‑706.

[5] Xie YB， Xiao HM， Shi MJ， et al. Progress of traditional Chinese medicine treatment for liver fibrosis［J］. Shizhen Guomao Guomao，2016，27（3）：703‑706.

[6] Sahu R， Goswami S， Narahari Sastry G，et al. The preventive and therapeutic potential of the flavonoids in liver cirrhosis： Current and future perspectives［J］. Chem Biodivers，2023，20（2）： e202201029.

[7] 李明奇，赵晓璐，高晓阳，等.植物药总黄酮的药理作用机制及应用进展［J］.中华中医药学刊，2024，42（1）：200‑204.

[8] Li MQ， Zhao XL， Gao XY， et al. Pharmacological mechanism and application progress of total flavonoids in botanicals［J］. Chin J Tradit Chin Med，2024，42（1）：200‑204.

[9] Zhao J， Bai D， Qi L， et al. The flavonoid GL‑V9 alleviates liver fibrosis by triggering senescence by regulating the transcription factor GATA4 in activated hepatic stellate cells［J］. Br J Pharmacol， 2023，180（8）：1072‑1089.

[10] 申呼格吉勒图.红花的药理作用及在蒙药方剂中的应用探讨［J］.中国民族民间医药，2013，22（13）：5.

[11] Shen HGJLT. Discussion on the pharmacological effects of safflower and its application in Mongolian herbal formulas［J］. Chin Ethnic Folk Med，2013，22（13）：5.

[12] 苏日娜，牧丹，白文明，等.蒙药材红花的化学成分和药理作用研究［J］.内蒙古石油化工，2017，43（3）：19‑21.

[13] Su RN， Mu D， Bai WM， et al. Research on the chemical composition and pharmacological effects of the Mongolian medicinal herb saffron［J］. Inner Mongolia Petrochem，2017，43（3）：19‑21.

[14] Russell JO， Camargo FD. Hippo signalling in the liver： Role in development， regeneration and disease［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2022，19（5）：297‑312.

[15] Schiavoni G， Messina B， Scalera S， et al. Role of Hippo pathway dysregulation from gastrointestinal premalignant lesions to cancer［J］. J Transl Med， 2024，22（1）：213.

[16] Wei Y， Hui VLZ， Chen Y， et al. YAP/TAZ： Molecular pathway and disease therapy［J］. MedComm（2020），2023，4（4）： e340.

[17] Sgamato C， Rocco A， Compare D， et al. Autoimmune liver diseases and SARS‑CoV‑2［J］. World J Gastroenterol， 2023，29（12）：1838‑1851.

[18] Antar SA， Ashour NA， Marawan ME，et al. Fibrosis： Types， effects， markers， mechanisms for disease progression， and its relation with oxidative stress， immunity， and inflammation［J］. Int J Mol Sci， 2023，24（4）：4004.

[19] Tan Z， Sun H， Xue T， et al. Liver fibrosis： Therapeutic targets and advances in drug therapy［J］. Front Cell Dev Biol， 2021， 9：730176.

[20] Parola M， Pinzani M. Liver fibrosis in NAFLD/NASH： From pathophysiology towards diagnostic and therapeutic strategies［J］. Mol Aspects Med， 2024，95：101231.

[21] 徐都冷，宝乐尔，白梅荣，等.蒙药红花醇提物抗酒精性肝损伤的药理作用机理探讨［J］.中国民族医药杂志，2019，25（10）：33‑36.

[22] Xu DL， Bao LE， Bai MR， et al. Discussion on the pharmacological mechanism of anti‑alcoholic liver injury by alcoholic extract of mongolian safflower［J］. Chin J Ethnic Med，2019，25（10）：33‑36.