基于脂质组学探索LSD1抑制剂SP2509抗食管癌细胞增殖的分子机制

Lipidomics‑based exploration of the molecular mechanism of LSD1 inhibitors against esophageal cancer cells proliferation

摘要

目的 脂质代谢失调是肿瘤最显著的代谢特征之一。目前食管癌（esophageal cancers， ESCA）细胞脂质代谢的上游调控机制尚不清楚。研究表明表观遗传修饰异常是导致肿瘤脂质代谢失调的重要因素。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（Lysine-specific demethylase 1，LSD1），主要催化组蛋白H3第4位和第9位赖氨酸的去甲基化，ESCA细胞中脂质代谢失调是否与LSD1有关尚无研究报道。 方法 利用CCK8细胞增殖实验、siRNA干扰实验、Western Blot蛋白免疫印迹实验、脂质组学技术及TCGA数据库，探索LSD1促进ESCA细胞增殖、调控其脂质代谢的分子机制。 结果 ESCA细胞中存在明显的脂质代谢失调，表现在多种甘油磷脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺含量显著上调和相关代谢酶的异常表达；LSD1抑制剂或干扰LSD1表达均可有效抑制ESCA细胞增殖；LSD1与参与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的合成与分解代谢关键酶的表达具有显著的相关性，其抑制剂可降低细胞中的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺的含量、抑制mTOR通路的激活、下调固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding factor 1， SREBF1）的表达。 结论 LSD1是调控ESCA细胞甘油磷脂代谢的上游靶点，其机制可能与激活mTOR通路调控SREBF1的表达有关。本研究揭示了LSD1在肿瘤发生、发展中的新角色，为开发针对ESCA等恶性肿瘤的精准治疗策略提供了有力的理论依据和潜在的治疗靶点。

Abstract

Objective Dysregulation of lipid metabolism is one of the most prominent metabolic characteristics of tumors. At present， the upstream regulatory mechanism of lipid metabolism in esophageal cancers （ESCA） remains unknown. Studies have shown that abnormal epigenetic modifications are most important factors leading to the dysregulation of lipid metabolism in tumors. Lysine-specific demethylase 1 （LSD1）， which mainly removes the methyl group from mono- and demethylated histone H3 at lysine 4 or lysine 9. However， it is still unclear whether LSD1 is related to lipid metabolism disorder in ESCA cells. Methods We Used CCK8 cell proliferation assay， siRNA interference assay， Western blot assays， lipidomics technology and TCGA database to explore the mechanism by which LSD1 regulates the proliferation and lipid metabolism of ESCA cells. Results There was obvious lipid metabolism disorder in ESCA cells， which was manifested as significant upregulation of glycerophospholipids such as phosphatidylcholine （PC） and phosphatidylethanolamine （PE） and abnormal expression of related metabolic enzymes. LSD1 inhibitor or LSD1 knockdown inhibited the proliferation of ESCA cells. LSD1 had a significant correlation with the expression of key enzymes which were involved in the synthesis and catabolism of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. Further， SP2509 treatment reduced the contents of PC and PE in cells， which also inhibited the activation of mTOR signaling pathway and down-regulated the expression of sterol regulatory element-binding factor 1 （SREBF1）. Conclusion LSD1 is an upstream target involving in the regulation of glycerophospholipids metabolism in ESCA cells， and its mechanism may be related to the activation of mTOR pathway and the regulation of SREBF1 expression. This study reveals a novel role of LSD1 in the occurrence and development of tumors， and also provides a strong theoretical basis and potential therapeutic target for the development of precision treatment strategies for malignant tumors such as ESCA.

Graphical abstract

关键词

脂质代谢失调 / 组蛋白赖氨酸去甲基化酶 / 食管癌 / 肿瘤细胞增殖 / 表观遗传修饰

Key words

Dysregulation of lipid metabolism / Histone lysine demethylase / Esophageal carcinoma / Tumor cell proliferation / Epigenetic modification

食管癌（esophageal cancers，ESCA）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其整体生存率低，病人预后差^［1］。我国ESCA的发病率和死亡率居世界首位。因此，探索其发病机制，挖掘新的调控靶标，对于ESCA的治疗及其靶向药物的开发具有重要意义。

脂质代谢失调是肿瘤最显著的代谢特征之一，肿瘤细胞可通过利用脂质代谢获得能量和生物膜的成分，同时还能生成调节肿瘤细胞增殖、生存、侵袭及转移的信号分子^［2-4］。近年来，甘油磷脂代谢逐渐被认为与肿瘤的发生和进展密切相关^［5］。细胞内的甘油磷脂主要包括磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）和心磷脂（cardiolipin，CL） ^［6］。Kouznetsova等人应用脂质组学技术发现膀胱癌的甘油磷脂代谢与其晚期进展有关^［7］。Uchiyama等^［8］人发现利用质谱成像技术检测组织中PC含量，可清楚地区分口腔鳞癌组织和其间质区域，证明PC与口腔鳞癌恶性表型相关。有研究发现，在ESCA组织中同样存在甘油磷脂代谢紊乱，包括PC、PE、PS等含量的异常升高^［9］，因此，干预甘油磷脂代谢可能是ESCA的潜在治疗策略，然而，目前对于调控甘油磷脂代谢，尤其是在ESCA中的上游作用机制尚不清楚。

研究发现，表观遗传修饰的改变对于激活肿瘤细胞脂质代谢至关重要^{［10，11］}。表观遗传修饰主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化、泛素化和微小RNA的转录后调控等^［12］。LSD1是一种依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的组蛋白特异性去甲基化酶，属于单胺氧化酶家族成员，能去除组蛋白H3 第四个赖氨酸和组蛋白 H3 第九个赖氨酸的单、二甲基化^{［13，14］}，调节基因的转录，影响肿瘤发生、发展和转移^{［15，16］}。研究表明，LSD1在肿瘤的发生及发展过程中发挥着极为重要的作用。如利用LSD1抑制剂，可以重新恢复急性髓性白血病对全反式维甲酸A的敏感性，达到治疗AML的目的^［17］。在结直肠癌细胞中，LSD1可以抑制DNA错配修复基因的表达，促进细胞快速增殖^［18］。除此之外，多项研究证实，LSD1参与调控了肿瘤细胞的脂质代谢。在前列腺癌中，LSD1与PC的生成有关^［19］。LSD1还是脂质代谢转录因子‒胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding factor 1， SREBF1）的激活因子，可通过上调SREBF1的表达促进胶质瘤细胞的脂肪生成^［20］。我们前期研究发现LSD1参与调控宫颈癌和结直肠癌细胞的脂质代谢，采用LSD1抑制剂ZY0511作用48 h，可使宫颈癌细胞和结直肠癌细胞中鞘磷脂水解酶SMPD1和SMPD3的表达发生上调，神经酰胺的含量显著上升^［11］。目前，虽已有研究报道LSD1在上述肿瘤脂质代谢中的调控作用，但不同类型的肿瘤其脂质代谢特征和调控机制不同，对于LSD1在ESCA细胞脂质代谢中的调控作用及其分子机制，仍有待阐明。

基于此，本课题采用LSD1抑制剂及基因干扰等技术，检测干扰和抑制LSD1后，ESCA增殖能力的变化，并结合脂质组学技术探索LSD1对ESCA脂质代谢的调控作用，在此基础上利用TCGA数据库，分析LSD1抑制剂发挥抗ESCA细胞增殖作用的分子机制，为挖掘调控ESCA细胞甘油磷脂代谢的上游靶点及LSD1抑制剂在肿瘤治疗中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

食管癌细胞株KYSE150和KYSE180购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RPMI-1640培养基购自博士德生物（货号：PYG0006）；胎牛血清购自赛澳美细胞技术（北京）有限公司（货号：SA211.02）；青霉素/链霉素溶液（货号：PWL062）、胰蛋白酶（货号：MA0232）、PBS缓冲液（货号：MA0015）、细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）（货号：MA0218）购自大连美仑生物技术有限公司；LSD1抗体购自CST（货号：2139）；SREBP1c抗体购自爱博泰克公司（货号：A15586）；mTOR抗体（货号：AF1648）、p-mTOR抗体（货号：AF5869）和β-actin抗体（货号：AF0003）购自碧云天生物技术公司；增强型RIPA裂解液（货号：AR0102）、磷酸酶抑制剂（货号：AR1195）、蛋白酶抑制剂（货号：AR1178）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（2×）（货号：AR0131）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：AR0146）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（货号：AR0138）、羊抗兔IgG-HRB（货号：BA1054）、羊抗鼠IgG-HRB（货号：BA1050）、Western Blot专用一抗二抗稀释液（货号：AR1017）购自博士德生物；PVDF膜购自默克Millipore（货号：ISEQ00010）；极超敏ECL化学发光试剂盒BeyoECL Moon 购自碧云天生物（货号：P00185）；Colomixed Protein Marker 购自爱博泰克公司（货号：RM19001）；SP2509购自MCE（货号：HY-12635）；siRNA序列购自锐博生物，详细干扰序列见表1。

1.2 细胞培养

本实验所用的细胞株KYSE150和KYSE180，采用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），培养于37 ℃的细胞培养箱中（5% CO₂），稳定传代2~3次后使用。

1.3 siRNA干扰实验

将生长状态良好的ESCA细胞以特定的密度（1×10⁵个/mL）接种于6孔板中，每孔2 mL，摇匀，使细胞均匀分布在孔内。待细胞汇合度为30%~40%，用1×ribo FECT^TM CP Buffer将siRNA的浓度稀释成50 nmol/L，加入1×ribo FECT^TM CP Reagent混匀，室温孵育10 min，然后将混合液加入到细胞中。72 h后，采用Western Blot检测干扰效果。

1.4 Western Blot蛋白印迹实验

取细胞，弃去培养液，用置于4 ℃保存的PBS清洗细胞2~3次；随后，向细胞中加入RIPA裂解液（1%磷酸酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂），在冰上裂解5 min；收集细胞，低温超声；13 000 r/min，4℃离心15 min后，将上清收集于离心管中；采用BCA试剂盒检测各蛋白样品的浓度，将各样品浓度调成一致；SDS-PAGE电泳分离蛋白；湿法转膜；将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中，室温摇床封闭2 h；按相应比例加入LSD1、β-actin、SREBP1c、p-mTOR及mTOR等一抗，将PVDF膜置于4 ℃冰箱中孵育过夜；次日，加入二抗，于37 ℃恒温孵育1 h；在避光条件下配制ECL发光液（A液∶B液=1∶1），显影，采集信号。

1.5 细胞增殖活性检测

用0.25%胰酶消化实验细胞，以特定的密度（3 000个/孔）将细胞接种于96孔板；次日，用完全培养基将LSD1抑制剂SP2509稀释成多个浓度，每个浓度设置3个复孔，用含DMSO的空白培养基作为阴性对照；作用48 h后，将孔内培养基吸出，以培养基：CCK8为10∶1的比例配制CCK8混合液，每孔加入110 μL CCK8混合液，在37℃孵育1.5 h左右；用酶标仪在450 nm波长下检测各孔的吸光度值（OD）；用以下公式计算LSD1抑制剂对细胞的增殖抑制率：抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-基质对照OD值）/%。

1.6 脂质组学检测

取适量样本（ESCA病人组织样本和ESCA细胞样本），加200 μL 水和20 μL内标，充分涡旋混合；随后，向混合液中加入甲基叔丁基醚800 μL，涡旋混合；然后，向混合液中加入预冷甲醇240 μL，涡旋混合；在低温水浴中超声20 min，随后在室温下静置30 min后，于14 000 g，10 ℃的条件下离心15 min；吸取上层的有机相到干净的离心管中，采用氮气吹干样品，随后将样品保存于-80℃冰箱备用；在质谱分析时，向各样品中加入复溶液（90%异丙醇/乙腈）200 μL，充分涡旋混匀；随后，在14 000 g，10 ℃的条件下离心15 min，吸取上清液进样分析；采用 UHPLC Nexera LC-30A 超高效液相色谱系统对样品进行分离；C18 色谱柱，柱温为45 ℃，流速设定为300 μL/min；流动相A为：乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4， v/v），流动相B为：乙腈异丙醇溶液（乙腈：异丙醇=1∶9， v/v），洗脱条件如下：

分别采用电喷雾电离正离子和负离子模式对样品进行检测；随后，采用 Q Exactive 系列质谱仪（Thermo Scientific™）对样品进行质谱分析；ESI 源条件如下：Heater Temp 300 °C， Sheath Gas Flow rate 45 arb， Aux Gas Flow Rate15 arb， Sweep Gas Flow Rate 1arb， spray voltage 3.0 kV， Capillary Temp 350 °C， S-Lens RF Level 50%， MS1 scan ranges： 200~1 800；最后，采用 LipidSearch 数据库进行峰识别、峰提取、代谢物鉴定（二级鉴定）等操作。本实验采用了ESCA病人组织样本进行脂质组学检测，实验已获得山西医科大学医学伦理委员会的批准（2023GLL51），研究对象均已签署知情同意书。

1.7 TCGA数据库检索与分析

利用UCSC Xena网站（https：//xenabrowser.net/datapages/）对TCGA数据库中所收纳的ESCA样本信息进行可视化分析，分析并统计LSD1、SREBF1及甘油磷脂代谢相关基因在ESCA组织和正常组织中的表达情况，并采用Pearson检验对上述基因在ESCA组织中的表达情况进行相关性分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

1.8 统计学分析

采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析。数据以（\overline{x}\pm s）表示。数据采用 Shapiro–Wilk 进行正态分布检验。使用非配对t检验（Unpaired t test）对两组进行比较。单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey的多重比较检验用于进行三组或三组以上的差异分析。双因素方差分析（Two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验用于两个自变量的分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ESCA组织中存在脂质代谢异常

为了探究ESCA的脂质代谢情况，我们收集了4例ESCA组织样本，并采用脂质组学技术对ESCA组织及对应癌旁组织中的脂质代谢物进行了检测；正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal Projections to Latent Structures-Discriminant Analysis，OPLS-DA）得分图显示，ESCA组织和癌旁组织的脂质代谢物分群明显（图1A），证明二者的脂质代谢物在含量和种类方面存在着明显的差异；OPLS-DA置换检验证实（图1B）模型不存在过度拟合现象，且稳健性良好；OPLS-DA模型的评价参数Q² >0.5（表3），证明模型具有良好的预测能力，结果可靠；我们将VIP>1且P<0.05的脂质分子，视为差异脂质代谢物，并对差异代谢物进行聚类分析，结果显示ESCA组织和癌旁组织的脂质含量存在明显不同（图 1C），尤其是多种甘油磷脂的含量存在显著差异；接下来，我们对两种组织中甘油磷脂各亚类的总含量进行了分别统计，结果显示ESCA组织中的PC，PE，PG和PI的含量均显著高于癌旁组织（P<0.05），PS和PA的变化虽不具有统计学差异，但其含量也略高于癌旁组织（图1D）；以上结果证实，与癌旁组织相比，ESCA组织中存在脂质代谢异常，尤其是甘油磷脂含量的异常升高。

2.2 多种PC和PE合成及分解代谢关键酶在ESCA组织中表达异常

甘油磷脂中PC和PE的含量占真核生物细胞膜总磷脂的50%以上，对真核生物细胞膜的结构和功能起重要作用。因此，我们着重分析了PC和PE在ESCA和癌旁组织中的含量，结果显示多种PC的含量在ESCA组织中显著升高（图2A），如PC（34∶1）（P<0.01）、PC（32∶0）（P<0.01）、PC（38∶6）（P<0.01）和PC（34∶0）（P<0.001）等。同时，在ESCA组织中的PE含量也显著高于癌旁组织（图2B），如PE（36∶1）（P<0.001）、PE（36∶5）（P<0.05）和PE（34∶1）（P<0.01）等。

上述结果提示与正常食管组织相比，ESCA组织中PC和PE的合成代谢旺盛，而分解代谢被抑制。因此，我们采用TCGA数据库，对参与PC和PE合成及分解代谢关键基因的mRNA表达进行了检索分析，见图3。

在ESCA组织中参与PC和PE合成的代谢酶如：磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase，PEMT）（P<0.05）、乙醇胺磷酸转移酶1（ethanolamine phosphotransferase 1，EPT1）（P<0.000 1）、磷脂酰丝氨酸脱羧酶（phosphatidylserine decarboxylase，PISD）（P< 0.05）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（lysophosphatidylcholine acyltransferase 1，LPCAT1）（P<0.000 1）的mRNA含量显著升高，胆碱激酶β（choline kinase beta，CHKB）（P<0.05）和胆碱磷酸转移酶（choline phosphotransferase 1，CHPT1）（P<0.001）的含量显著下降（图4）；与PC和PE分解相关的磷脂酶A2 ⅫA组（phospholipase A2 group ⅫA，PLA2G12A）的mRNA含量显著下降（P<0.000 1），磷脂酶A2 XV组（phospholipase A2 group XV，PLA2G15）（P<0.01）和磷脂酰丝氨酸合酶（phosphatidylserine synthase 1，PTDSS1）的含量显著升高（P<0.000 1）（图5）。上述结果证明，ESCA细胞中甘油磷脂代谢失调。

2.3 LSD1可能通过调控PC和PE的合成与分解代谢促进ESCA细胞增殖

多项研究表明，LSD1参与调控了肿瘤细胞的脂质代谢^{［11，19］}。但LSD1在ESCA细胞脂质代谢中的作用如何尚不清楚。采用脂质组学技术，我们检测了LSD1抑制剂SP2509（1 μmol/L）处理ESCA细胞KYSE150和KYSE180 48 h后甘油磷脂各亚类的含量，结果显示，绝大多数在ESCA组织中含量较高的PC和PE，如PC（34∶1）、PC（32∶0）、PC（38∶6）、PC（34∶0）、PE（36∶1）、PE（36∶5）和PE（34∶1）等，在LSD1抑制剂作用后显著下降（图6、7），证实LSD1可能调控了ESCA细胞中甘油磷脂尤其是PC和PE的合成与分解代谢。

由于LSD1抑制剂能降低ESCA细胞中绝大多数PC和PE的含量，我们推测可能与LSD1被抑制进而影响了代谢酶的表达有关。因此，我们利用TCGA数据库，对LSD1和上述代谢酶在ESCA组织中的表达相关性进行了分析。结果发现，LSD1与参与PC和PE合成过程的代谢酶包括磷酸胞苷酰转移酶1B（phosphate cytidylyltransferase 1B，PCYT1B）（r=0.311 9，P<0.000 1）、PEMT（r= 0.224 7，P=0.002 1）、乙醇胺激酶2（ethanolamine kinase 2，ETNK2）（r=0.229 9，P=0.001 6）及EPT1（r=0.207 3，P=0.004 6）表达呈正相关（图8A）。LSD1与参与PC和PE分解过程的代谢酶包括磷脂酶A2 Ⅹ组（phospholipase A2 group Ⅹ，PLA2G10） （r=-0.347 3，P<0.000 1）、磷脂酶A2 ⅡA组（phospholipase A2 group ⅡA，PLA2G2A）（r=-0.266 1， P=0.000 3）、磷脂酶A2 XVI组（phospholipase A2 group XVI，PLA2G16）（r=-0.434 1，P<0.000 1）及磷脂酶D家族成员4（phospholipase D family member 4，PLD4）（r=-0.1636，P=0.026 1）呈负相关（图8B），以上结果证明LSD1可能参与调控了ESCA细胞中甘油磷脂PC和PE的合成与分解代谢。

由于PC和PE是细胞膜的主要磷脂成分，其含量的降低，必然会导致ESCA细胞增殖速度减慢。我们采用siRNA干扰LSD1的表达，结果显示siRNA作用ESCA细胞96 h，可显著降低其表达（图9A、D），且干扰LSD1表达后，ESCA细胞的增殖速度明显减慢（图9B、E）（P<0.001 siRNA 1# vs. NC，P<0.001 siRNA 2# vs. NC，^&&P<0.01，^&&&P<0.001 siRNA 3# vs. NC）。紧接着，我们对LSD1抑制剂SP2509是否同样可以抑制ESCA细胞增殖进行了探索，结果表明，0.5 μmol/L的SP2509作用48 h即可显著抑制细胞的增殖（图9C、F）（P<0.01，P<0.001）。以上结果证实，LSD1可能通过调控PC和PE的合成与分解代谢促进ESCA细胞增殖。

2.4 LSD1可能通过mTOR/SREBF1调控ESCA细胞甘油磷脂代谢

SREBF1是细胞中调控脂质合成的重要转录因子，研究表明LSD1是SREBF1的激活因子，可上调SREBF1的表达促进胶质瘤细胞的脂肪生成^［20］。因此，我们利用TCGA数据库对ESCA组织中LSD1和SREBF的表达进行了检索分析，结果发现LSD1和SREBF1在ESCA组织中高表达（图10A、B）（P<0.001，P<0.000 1，），且两者表达成明显正相关（图10C）（r=0.299 2，P=0.000 1）。进一步，我们发现LSD1抑制剂SP2509作用ESCA细胞72 h后，SREBF1的蛋白表达显著下降（图10D）。

由于mTOR信号通路已经被证实可以调控SREBF1表达及脂质合成，而前期又有研究发现在结肠癌细胞中LSD1是mTOR信号通路的上游调控因子^［15］。因此，我们推测LSD1可能通过mTOR信号通路调控SREBF1进而调节ESCA细胞甘油磷脂代谢。Western blot结果发现LSD1抑制剂降低了p-mTOR的蛋白表达，证明LSD1抑制剂抑制了mTOR信号通路的激活（图10D）。此外，我们发现在与LSD1的表达有显著相关性的8个代谢酶中，除PLD4外，其余代谢酶包括PCYT1B（r= 0.277 1，P<0.000 1），PEMT（r=0.450 2，P< 0.000 1），ETNK2（r=0.256 5，P=0.000 4），EPT1（r= 0.344 6，P<0.000 1），PLA2G10（r=-0.297 4，P<0.000 1），PLA2G2A（r=-0.273 5，P=0.000 2）及PLA2G16（r=-0.359 5，P<0.000 1）均同时与SREBF1的表达有显著的相关性（图8C， D）。因此，以上结果表明LSD1很可能通过mTOR信号通路调节SREBF1的表达，影响相关代谢酶如PCYT1B、PEMT、ETNK2、EPT1、PLA2G10、PLA2G2A及PLA2G16的表达进而调控ESCA细胞的甘油磷脂代谢（图11）。

3 讨论

脂质代谢活跃是肿瘤细胞的重要代谢特征之一^［21］，因而干预脂质合成可达到靶向肿瘤细胞进而治疗肿瘤的目的。目前已有相关药物处于临床试验阶段，如PF-05175157和C75等。但是，机体少数正常细胞如肝细胞等同样存在脂质合成，而上述药物直接作用于脂质合成相关酶，可能会在抑制肿瘤细胞脂质代谢的同时，干扰正常细胞的脂质代谢，从而导致严重的不良反应^［22］。因此，挖掘特异性调控肿瘤细胞脂质合成的上游靶标，对于肿瘤靶向药物的开发具有重要意义。

脂质代谢失调参与了肿瘤发生、发展的全过程^［3］。肿瘤细胞利用脂质代谢为自身获取能量、生物膜成分和信号分子，并满足其快速增殖、侵袭和转移的需要。已有研究报道卵巢癌^［23］和前列腺癌^［24］等多种肿瘤组织中存在脂质代谢异常，尤其是PC的含量在前列腺癌组织中显著升高^［24］。本研究采用基于 UPLC-Orbitrap 质谱系统的非靶向脂质组学分析平台对脂质含量进行了检测，结果发现ESCA组织中的脂质种类和含量与癌旁组织存在显著差异，其中PC和PE的变化最为显著，但促使其发生的分子机制，目前尚不清楚。有研究证实，表观遗传修饰调控对于激活肿瘤细胞脂质代谢至关重要^{［10，25］}。LSD1是第一个被证实的可对组蛋白进行去甲基化的酶^［26］。目前已发现LSD1与肿瘤的多种信号通路和生物学过程有关^{［15，27，28］}。有趣的是，LSD1被证实参与调控了细胞的脂质代谢^{［11，29，30］}，一项关于非酒精性脂肪肝的研究发现，LSD1可以和Slug相互作用，在胰岛素信号的刺激下，促进脂肪生成^［30］。在本研究中，我们发现LSD1抑制剂可显著降低ESCA细胞株KYSE150和KYSE180的甘油磷脂含量，包括绝大部分的PC、PE和PS等。因此，LSD1可能是调控ESCA脂质代谢的潜在靶点。

LSD1可以调控众多癌相关基因的表达，这一效应主要与其组蛋白去甲基化作用密切相关。H3K4me2和H3K9me2是LSD1最主要的两个催化位点，其中H3K4me2升高是基因的转录激活信号，而H3K9me2升高则是转录抑制信号。在前列腺癌细胞中，LSD1的缺失可使细胞周期相关基因SKP2和CDC25A的启动子H3K9me2水平升高，进而降低上述基因的表达，抑制细胞增殖^［31］。而在急性髓性白血病细胞中，抑制LSD1则可使靶基因的启动子H3K4me2水平升高而上调其表达^［32］，抑制急性髓性白血病的进展。SREBF1是调控细胞脂质合成的重要转录因子^［33］。研究表明，SREBF1是受mTOR信号通路调控的靶蛋白，其抑制剂雷帕霉素可通过抑制成熟的SREBF1在细胞核中的累积而抑制脂代谢和细胞增殖^［34］。基于此，在本研究中我们并没有探索LSD1对靶基因启动子组蛋白甲基化的调控作用，而是着重探索了LSD1抑制剂对mTOR信号通路及SREBF1表达情况的影响。有前期研究同样发现了LSD1在肿瘤中对mTOR信号通路的调控作用^{［15，35］}。因此，在本研究中，我们检测了ESCA细胞在LSD1抑制剂作用下，mTOR信号通路的激活情况，结果证实LSD1抑制剂可以显著抑制mTOR信号通路激活并降低SREBF1表达。此外，我们发现LSD1和SREBF1与参与PC、PE合成及分解代谢的相关酶表达具有明显的相关性。因此，LSD1很可能是通过mTOR信号通路，调控SREBF1表达而调节相关代谢酶，促进ESCA细胞脂质合成。但在ESCA细胞中，LSD1调控mTOR信号通路的具体分子机制还有待进一步阐明。

PC是真核细胞膜中最丰富的磷脂，具有双重作用，既可作为膜的结构成分，又可作为产生磷脂酸和二酰甘油等脂质第二信使的底物^［36］，与肿瘤的发生、发展密切相关^［37］。在肿瘤中，PC的从头合成代谢活跃，因此很多侵袭性癌症中都能检测到高水平的总胆碱和磷酸胆碱^［38］。胆碱激酶在多种癌症中高表达^{［39，40］}，可通过催化胆碱磷酸化而产生磷酸胆碱，最终参与PC的生物合成。有研究发现，siRNA干扰胆碱激酶的表达，可抑制乳腺癌细胞的增殖，机制与细胞中PC水平降低有关^［38］。同时，有研究证实肝癌细胞增殖与PC从头合成代谢增强有关，具体表现在含有单不饱和脂肪酸的PC如PC（36∶1）和CDP-choline的含量在二乙基亚硝胺诱导的肝癌模型中显著升高 ^［41］。自噬可以帮助肿瘤细胞应对不良刺激如抗癌药物的杀灭作用，有研究表明PC水平升高参与了自噬体膜的形成，靶向抑制PC合成可抑制自噬而降低肿瘤的耐药性 ^［42］。PE也是真核细胞膜中的主要脂质成分^［36］。Yu等 ^［43］发现，PE可作为喉癌诊断的潜在生物标志物。同时，Osawa等 ^［44］证实参与PE生物合成的中间代谢物——磷酸乙醇胺可刺激细胞生长和肿瘤进展，且磷酸乙醇胺在乳腺癌组织中含量较高 ^［45］。因此，在绝大多数恶性肿瘤中，PC和PE代谢呈活跃状态，其相关代谢酶可作为肿瘤的预后标志物，如CHKA和PEMT高表达的肺癌患者其预后往往不佳 ^［46］。在本研究中，我们发现相比癌旁组织，PC和PE在ESCA组织中含量较高，且参与PC和PE合成及分解代谢的酶的表达也有明显变化，提示靶向PC和PE代谢可能是ESCA的潜在治疗策略。

综上所述，本研究证实LSD1可能是调控ESCA细胞甘油磷脂代谢的上游靶点，其机制与激活mTOR信号通路进而促进SREBF1的表达有关。目前我们对于ESCA细胞如何激活脂质合成认知尚浅，本研究对于阐释ESCA发病机制、挖掘防治ESCA的新靶点及靶向肿瘤细胞脂质代谢药物的开发具有重要意义。

作者贡献度说明：

李妍、杜原鑫：实验操作、论文研究撰写、经费支持；张俊飞、杨彩红：数据整理；张雍偲：统计学分析；范彦英：指导、论文修改。

所有作者均声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82304560)

山西省自然科学基金资助项目(20210302124008)