HPLC法同时测定藏药夏萨德西丸中8种成分含量及化学模式识别研究

Simultaneous determination of 8 components in Tibetan medicine Xiasa Dexi Pills based on HPLC and its chemical pattern recognition

摘要

目的 建立夏萨德西丸的HPLC多成分含量测定方法，评价不同来源夏萨德西丸质量。 方法 通过HPLC同时测定8种成分的含量，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行评价，采用电子鼻进行气味分析。通过主成分分析、正交偏最小二乘法-判别式分析2种化学模式识别方法分析不同来源夏萨德西丸质量差异。 结果 样品中没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚含量分别为4.46~10.02、1.66~8.17、2.83~4.41、0.44~1.22、16.28~20.74、7.42~13.04、36.72~33.09、3.12~4.04 mg/g；6批不同来源夏萨德西丸的相似度在0.423~0.803之间；通过电子鼻分析可知，夏萨德西丸挥发性成分主要包括萜烯类、芳香类、有机硫化物、甲烷和氮氧化物；结合化学计量学与8种化学成分的含量分析得出S6样品质量较优，S2样品质量较差；同一产地不同批次以及不同产地样品之间质量差异较大，结合统计学分析筛选出鞣花酸、没食子酸、诃黎勒酸是影响夏萨德西丸质量的主要成分。 结论 建立的夏萨德西丸多成分含量测定方法精密度高，重复性好，结合多元统计学可用于夏萨德西丸的质量评价。

Abstract

Objective To establish an HPLC multi-component content determination method for Xiasa Dexi Pills and to evaluate the quality of Xiasa Dexi Pills from different sources. Methods The contents of 8 components were simultaneously determined by HPLC， the similarity evaluation software of chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine was used for evaluation， and the electronic nose was used for odor analysis. Two chemical pattern recognition methods， principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis， were used to analyze the quality differences of Xiasa Dexi Pills from different sources. Results The contents of gallic acid， swertiamarine， corilagin， ethyl gallate， chebulagic acid， ellagic acid， chebulinic acid， and eugenol in the samples were as follows： 4.46-10.02、1.66-8.17、2.83-4.41、0.44-1.22、16.28-20.74、7.42-13.04、36.72-33.09、3.12-4.04 mg/g. The similarity of 6 batches of Xiasa Dexi Pills from different sources was 0.423~0.803. Through electronic nose analysis， it was found that the volatile components of Xiasa Dexi Pills mainly include terpenes， aromatics， organic sulfides， methane， and nitrogen oxides； combined with chemometrics and content analysis of 8 chemical components， it was concluded that the quality of S6 sample was better and the quality of S2 sample was poor. The quality of samples from different batches in the same producing area and different producing areas was quite different. Combined with statistical analysis， ellagic acid， gallic acid， and chebulagic acid were the main components affecting the quality of Xiasa Dexi Pills. Conclusion The established multi-component content determination method of Xiasa Dexi Pills has high precision and good repeatability. Combined with multivariate statistics， it can be used for the quality evaluation of Xiasa Dexi Pills.

Graphical abstract

关键词

夏萨德西丸 / HPLC / 含量测定 / 化学模式分析 / 电子鼻

Key words

Xiasa Dexi Pills / HPLC / Content determination / Chemical mode analysis / Electronic nose

夏萨德西丸是知名藏医药专家旦科教授的经验配方，属胃病专科专病药，夏萨德西丸由诃子肉、藏木香、沉香、石榴子、红花、丁香等17味药材制成，临床上常用于清热解毒、疏肝健胃、利胆除湿、滋阴补阳，平衡体内环境及治疗各类肝脏疾病^［1］。

藏成药由于处方庞大，组分复杂，指标性成分的筛选和测定是其质量评价的重点与难点。现有的藏成药有效成分的含有量测定方法多集中在单一成分或者少数成分上，如七十味松石丸等仅有1种成分的含有量测定方法^［2-4］，二十五味鬼臼丸只测定了鬼臼毒素、胡椒碱的含有量^［5，6］，均反映出现阶段藏成药含测方法的单一性和局限性。

夏萨德西丸相关的研究报道较少^{［1，7，8］}，目前，该制剂执行标准为2006年四川省食品药品监督管理局发布的医疗机构制剂注册标准，而其质量标准仅包含没食子酸的薄层色谱定性鉴别与含量测定，难以有效控制方剂的质量^［1］。目前尚无文献报道夏萨德西丸多成分含有量测定的相关研究，缺乏综合质量评价，因此有必要对夏萨德西丸建立基于临床疗效的多维度综合评价方法。

本研究以6批不同来源夏萨德西丸样品为研究对象，建立同时测定8种有效成分的HPLC含量测定方法，同时结合共有峰及电子鼻数据进行化学计量学分析^［9］，评价夏萨德西丸样品的质量差异，并筛选影响夏萨德西丸质量的化学成分。采用HPLC结合多元统计学分析可对夏萨德西丸质量进行更系统、更全面的评价，为夏萨德西丸后期深入研究提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪；METTLER TOLEDO电子分析天平；Eppendorf Centrifuge 5424R超速离心机；KQ5200DB型数控超声波清洗器；QR8UV-R型纯水仪；AIT-N1200电子鼻。

1.2 试药

对照品没食子酸（批号：MUST-22112411，纯度≥99.96%），獐牙菜苦苷（批号：MUST17080302，纯度≥99.51%），柯里拉京（批号：MUST-23060211，纯度≥99.99%），没食子酸乙酯（批号：MUST-22102805，纯度≥99.92%），鞣花酸（批号：MUST-23022212，纯度≥99.84%），丁香酚（批号：MUST-23013110，纯度≥99.85%）购自成都曼思特生物科技有限公司；诃黎勒酸（批号：RP201005，纯度≥98.39%），诃子酸（批号：RP210628，纯度≥98.61%）购自成都麦德生科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，购自成都市科隆化学品有限公司，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。夏萨德西丸来源见表1。

2 方法与结果

2.1 HPLC含量测定方法及指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱为Welchrom C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：乙腈（A），0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~12 min，5% A，95% B；12~17 min，5%→9% A，95%→91% B；17~42 min，9%→15% A，91%→85% B；42~47 min，15%→20% A，85%→80% B；47~70 min，20%→25% A，80%→75% B；70~80 min，25%→40% A，75%→60% B；80~95 min，40%→55% A，60%→45% B）；检测波长为230 nm，进样量为5 μL，柱温为30 ℃，混合对照及样品见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备

取没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚对照品适量，精密称定，加纯甲醇制成质量浓度分别为0.67、0.53、0.70、0.53、0.76、0.61、1.27、0.21 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备

取夏萨德西丸粉末（S6）约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入纯甲醇30.0 mL，称定，超声（功率300 W，频率40 kHz）提取0.5 h，静置至室温后再次称定，补足重量，取上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.4 精密度实验

取S6样品粉末约0.5 g，精密称定，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，进样体积5 μL，分别计算没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚峰面积的RSD，测得8个成分峰面积的RSD分别为（n=6）0.27%、0.31%、0.51%、1.8%、0.36%、0.5%、0.99%、0.80%，表明仪器的精密度良好。

2.1.5 稳定性实验

取S6样品粉末约0.5 g，精密称定，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、24 h进行测定，记录色谱峰，分别计算没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚峰面积的RSD，测得8个成分峰面积的RSD分别为（n=6）2.5%、2.7%、3.3%、1.1%、2.9%、1.9%、2.1%、2.2%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.1.6 重复性实验

取6份S6样品粉末各约0.5 g，精密称定，按“2.1.3”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.1.1”项下的色谱条件进行分析，计算含有量，结果没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚的平均含有量分别为1.0%、0.79%、0.29%、0.17%、1.7%、1.3%、3.2%、0.32%，其RSD（n=6）分别为2.1%、2.4%、3.1%、2.7%、2.3%、3.4%、0.19%、1.8%，表明该方法的重复性良好。

2.1.7 线性关系

取各对照品适量，加纯甲醇制成没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚质量浓度为0.67、0.53、0.57、0.53、0.76、0.61、1.3、0.21 mg/mL的混合溶液，摇匀，稀释2、4、8、16、32、64倍，得系列混合对照品溶液，精密吸取上述系列混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，各组分线性关系良好（表2）。

2.1.8 加样回收率

取已知含量样品（S6）粉末6份，各约0. 25 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚对照品适量。按“2.1.3”项下的方法制成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，测定待测成分的含有量，计算平均加样回收率及RSD，见表3。

2.1.9 含量测定

取6批夏萨德西丸粉末适量，按“2.1.3”项下供试品溶液制备方法进行供试品溶液制备，按“2.1.1”项下色谱条件，进行测定，见表4。

测定结果表明含量水平较高的有效成分依次是诃子酸、诃黎勒酸、鞣花酸、没食子酸，6批不同来源夏萨德西丸大体上具有相同的化学成分，但是有效成分含量差异较大，这可能与全方中各药材的采样地、生长期、采收时间有关^［10］。

2.1.10 指纹图谱的建立及相似度评价

取6批夏萨德西丸粉末适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录95 min的HPLC图，将检测波长为230 nm处的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，将S1号样品的图谱设为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度设为0.1 min，进行多点校正和色谱峰全谱峰匹配，得到指纹图谱叠加图，见图2，确定了33个共有峰，再与对照品色谱峰的保留时间、紫外吸收光谱信息比对，共指认8个共有峰，见图1；将供试品色谱图与对照指纹图谱匹配，进行相似度评价，结果见表5，不同来源样品的相似度在0.422~0.803之间，没食子酸（S6）及獐芽菜苦苷（S5）峰面积较大，可能是导致其相似度差异较大原因。

2.1.11 化学模式分析

2.1.11.1 主成分分析（PCA）

将6批不同来源夏萨德西丸的8个共有峰面积导入SIMCA14.1软件，进行主成分分析，结果见图3，可将6批不同来源样品分为2类，S2、S3为一类，S1、S4、S5、S6为一类，说明不同来源夏萨德西丸在成分上有差异。

2.1.11.2 正交偏最小二乘法-判别式分析（OPLS‑DA）

为更好地分析夏萨德西丸不同来源的差异性，以指认的8个峰面积为变量，利用SIMCA 14.1软件针对不同来源的夏萨德西丸进行OPLS-DA，结果见图4。6批不同来源夏萨德西丸差异较为明显，进一步说明3个产地样品在化学成分上有一定差异。为了降低已建立的OPLS-DA模型的过拟合风险，随后进行了置换检验（n=200），见图5。置换检验参数R²和Q²的值分别为0.45和-0.637，说明建立的OPLS-DA模型没有出现过拟合现象，具有较好的预测能力。

变量重要性投影值（variable importance in projection scores，VIP）是筛选差异性化合物的重要指标。结合VIP法，以变量VIP值>1.0为显著影响，共找到3个产地夏萨德西丸的3个差异性标志物，见图6，分别为鞣花酸、没食子酸、诃黎勒酸，根据VIP值大小进行排序，为鞣花酸>没食子酸>诃黎勒酸，这3种化合物是导致夏萨德西丸不同批次之间差异的主要成分，在夏萨德西丸的质量控制中值得注意。

2.2 电子鼻气味分析

取5 g夏萨德西丸粉末准确称重，采样时间设置为60 s，采样间隔设置为1 s，传感器阵列清洗时间设置为120 s。电子鼻传感器性能描述见表6。

6批不同来源夏萨德西丸样品的气味在电子鼻8个传感器的响应程度基本一致，雷达图中重叠的部分较多结果见图7，然而在同一传感器上不同来源样品的响应值存在差异。差异主要体现在W1W、W1S、W5S传感器说明夏萨德西丸主要挥发性成分为萜烯类、芳香类、有机硫化物、甲烷和氮氧化物，上述成分在夏萨德西丸气味中占较大比重。

由于雷达图不足以对不同来源夏萨德西丸样品的香气特征进行分类，故采用PCA进行区分^［11］。主成分分析通过提取原始数据的主成分因子来降低其维数，可以用来区分样本之间的异同^［12］。

为了进一步对不同来源样品进行区分，通过PCA模型分析不同来源样品差异的总体视图，在PCA模型评分图中不同来源样品均呈现组间离散状态，说明6批不同来源夏萨德西丸的气味差异较大。见图8。

3 讨论

3.1 指标成分的筛选

夏萨德西丸具有清热化浊、行气和胃之效，可用于治疗慢性萎缩性胃炎。方中诃子为君药主要含有酚酸和鞣质类成分，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、保护肠黏膜等作用^［13］。在酚酸化合物中活性较强的代表性成分是没食子酸、诃子酸、鞣花酸、没食子酸乙酯；鞣质类代表成分是诃黎勒酸、柯里拉京。此外，方中獐芽菜的主要化合物为环烯醚萜类，代表成分是獐芽菜苦苷，具有清肝利胆、解痉镇痛、降低血脂、消炎抑菌等功效^［14］；丁香中主要含有挥发油成分，其中丁香酚具有抗炎、抗 氧化、改善消化系统功能等作用^［15］。基于此，本研究选择没食子酸、诃子酸、鞣花酸、没食子酸乙酯、丁香酚、诃黎勒酸、柯里拉京、獐芽菜苦苷作为夏萨德西丸含量测定的主要指标成分。

3.2 色谱条件及流动相的优化

研究发现，乙腈水流动相体系所获得的分离状况要好于甲醇水体系；因此对流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸水）进行考察，结果显示，以流动相为乙腈-0.1%磷酸水所得色谱图基线更加平稳，各有效成分色谱峰的分离度、对称因子和理论板数良好。

紫外吸收光谱全波长扫描发现检测波长在230 nm时，没食子酸、獐牙菜苦苷、柯里拉京、没食子酸乙酯、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚的紫外吸收较强而且杂峰少，灵敏度高，峰形清晰，因此选择230 nm作为最佳测定波长。

3.3 测定结果分析

本研究采用HPLC对6批不同来源夏萨德西丸中8种化学成分进行测定。结果表明，同一产地不同批次以及不同产地样品之间质量差异较大，其中以没食子酸、獐芽菜苦苷含有量差异明显，3个不同产地没食子酸平均含量分别为6.15、5.34、8.92 mg/g，獐芽菜苦苷平均含量分别为5.74、2.12、6.12 mg/g，如S4、S5、S6样品均来自于阿坝州藏医院，3批样品中没食子酸含有量分别为8.72、8.01、10.02 mg/g，獐芽菜苦苷含有量分别为2.24、8.17、7.94 mg/g，可能存在两方面原因：一是不同生长年限影响诃子肉中的酚酸类、獐芽菜中的环烯醚萜苷类等内含物的积累^［16］，其中环烯醚萜苷的含有量受温度、季节、气候、经度、纬度和海拔等因素共同影响，总体含有量可能浮动较大^［17］；二是药材储藏期间受不同微生物、温/湿度的影响，初期分泌物逐渐参与各类次生代谢，差异增加^［18］。

不同来源夏萨德西丸电子鼻如图7所示，S1~S5样品较S6而言，各传感器响应强度较高。不同采样地的地理环境和气候因子如海拔、降水量、气温等生态因子均可能会影响药材中的气味浓度^［16］，但主要风味物质的类别没有发生变化，气味物质均为萜烯类、芳香类、有机硫化物、甲烷和氮氧化物；因此本课题组拟在后期研究中采用电子鼻结合GC-MS深入研究夏萨德西丸可能含有的挥发性成分的含有量变化。

3.4 质量差异分析

本研究运用多元统计学分析，对6批不同来源夏萨德西丸进行分类，通过化学识别模式分析，筛选出3个对夏萨德西丸质量有影响的化学成分。同时，采用HPLC法、电子鼻分别分析夏萨德西丸中非挥发性及挥发性成分差异。研究表明，各产地间非挥发性化成分及挥发性化成分的PCA图均较为分散。其中，诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸为样品中含有较高的成分，而这3种成分主要来源于诃子肉。所以导致这种现象的潜在因素可能是药材来源、采用的加工技术以及处方制剂的储存条件不同^［19］。因此，在制定地方标准时建议对样品的采集范围或者产地进行限定，以保证样品的质量。

作者贡献度说明：

安菊红：进行实验并撰写、修改论文；钟世红：设计实验，并对论文进行修改指正；仲勒、让坚：提出研究框架和方向；才华加：分析数据；朱婷婷：对论文格式进行修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

四川省科学技术厅资助项目(R22ZYZF0005)