基于转录组学分析氟维司群治疗对单核‑巨噬细胞趋化因子表达及极化的影响

Effects of fulvestrant treatment on chemokine expression and polarization in macrophage cells.

摘要

目的 肿瘤细胞获得对内分泌治疗药物的耐受性是ER⁺乳腺癌治疗失败的关键因素。肿瘤相关巨噬细胞是乳腺癌微环境中的重要成分，然而内分泌治疗药物对巨噬细胞的调控作用尚不清楚，本研究旨在探讨内分泌治疗药物氟维司群对单核‑巨噬细胞极化的影响。 方法 借助PMA诱导获得THP‑1细胞来源的巨噬细胞，通过RT‑qPCR、Western blot、流式细胞术验证氟维司群刺激后的巨噬细胞表面marker变化；通过RNA‑Seq技术对氟维司群刺激后的巨噬细胞的转录组改变进行分析，筛选组间差异表达基因；结合GO功能与KEGG通路富集分析差异基因的功能；构建差异基因的蛋白相互作用网络并筛选Hub基因；最后通过RT‑qPCR和趋化因子阵列实验验证氟维司群对巨噬细胞Hub基因中5种趋化因子表达的影响。 结果 RT‑qPCR、Western blot、流式细胞术分析结果表明氟维司群刺激后的巨噬细胞M2相关标志分子表达升高而M1相关标志分子表达降低；RNA‑Seq结果显示，氟维司群刺激后的巨噬细胞出现118个差异表达基因；GO与KEGG富集分析结果显示差异基因富集于趋化因子相关功能和信号通路；蛋白互作网络和Hub基因筛选确定了CXCL8、CCL20、CCL22、CXCL10、CCL7 5个关键的趋化因子；对5个关键趋化因子进行RT‑qPCR验证表明其表达趋势与RNA‑Seq结果一致；趋化因子阵列实验证实氟维司群刺激后的巨噬细胞分泌的CXCL8、CCL20、CCL22增多，而CXCL10、CCL7减少。 结论 内分泌治疗药物氟维司群使巨噬细胞M2相关分子 CD206表达升高而M1相关分子 CD86表达降低，同时使巨噬细胞M2相关趋化因子分泌增多而M1相关趋化因子分泌减少，提示氟维司群促进巨噬细胞向M2极化，抑制其向M1极化，可能与临床内分泌治疗耐药形成有关。

Abstract

Objective In ER⁺ breast cancer. Tumour‑associated macrophages（TAMs） are important components of the breast cancer microenvironment. However， the effects of endocrine therapeutic agents on TAMs is unclear.To investigate the effect of fulvestrant on the polarization of macrophages. Methods Using THP‑1 cell‑derived macrophages， we observed changes in macrophage following fulvestrant stimulation through RT‑qPCR， Western blot， and flow cytometry. RNA‑Seq was employed to analyze the transcriptomic changes in macrophages induced by fulvestrant. Gene Ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analyses were conducted to assess the functional roles of these differentially expressed genes. A protein‑protein interaction network was constructed to identify hub genes. Finally， the effects of fulvestrant on the expression of five key chemokines among the hub genes were validated using RT‑qPCR and a chemokine array. Results RT‑qPCR， Western blot， and flow cytometry analyses revealed that fulvestrant stimulation increased the expression of M2‑related markers while decreasing the expression of M1‑related markers in macrophages. RNA‑Seq results revealed that 118 differentially expressed genes appeared in macrophages stimulated by fulvestrant. GO and KEGG enrichment analyses showed that the differentially expressed genes were enriched in the chemokine‑related functions and signalling pathways. Protein‑protein interaction network analysis and hub gene screening identified five key chemokines（CXCL8， CCL20， CCL22， CXCL10 and CCL7）. RT‑qPCR showed that the expression trends of these key chemokines were consistent with the RNA‑Seq results. Additionally， chemokine array experiments confirmed that the secretion of CXCL8， CCL20， and CCL22 by macrophages after fulvestrant stimulation was increased， while that of CXCL10 and CCL7 was decreased. Conclusions The endocrine therapeutic agent fulvestrant was found to promote the expression of the M2‑associated macrophage marker CD206 while inhibiting the expression of the M1‑associated marker CD86. Additionally， fulvestrant treatment enhanced the secretion of M2‑related chemokines and reduced the secretion of M1‑related chemokines by macrophages. These findings suggest that fulvestrant treatment promotes macrophage polarization towards the M2 phenotype and inhibits polarization towards the M1 phenotype. This shift in macrophage polarization may be associated with the development of resistance to endocrine therapy in clinical settings.

Graphical abstract

关键词

乳腺癌 / 内分泌治疗耐药 / 巨噬细胞 / 趋化因子

Key words

Breast cancer / Endocrine resistance / Macrophage / Chemokine

乳腺癌已成为女性发病率最高的癌症类型，其中约80%的病例以雌激素受体阳性（estrogen receptor‑positive，ER⁺）为特征^［1］。靶向ER信号途径的内分泌治疗是该类型乳腺癌的治疗方式之一^［2］。选择性ER降解剂氟维司群可直接靶向ER，通过蛋白酶体诱导 ER 的降解，适用于治疗绝经后的转移性晚期乳腺癌患者^［3］。尽管氟维司群的疗效已得到认可，但近一半的患者在治疗5年后出现耐药，导致不良预后，其潜在机制尚未阐明^［4］。

乳腺癌的进展与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的改变密切相关。肿瘤微环境包括多种免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞等）、成纤维细胞、内皮细胞、周细胞以及其他各种组织驻留细胞^［5］。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）是TME中的重要组成成分，可占TME的50%。作为对微环境信号的反应，TAM表现出高度的可塑性^［6］。巨噬细胞可经历不同的激活，包括通过经典途径激活的促炎表型M1型，以及替代途径激活的抗炎表型M2型， M1/M2型巨噬细胞模式的转换在肿瘤进展中起着关键作用^［7］。TAM通常被认为是M2型巨噬细胞，具有促进肿瘤恶性进展的功能^［8］。研究表明，TAM在乳腺癌对化疗药物产生耐药的过程中具有促进作用，并与内分泌治疗抵抗存在一定相关性^［9，10］。据报道，巨噬细胞的极化不仅受TME的影响，也受药物的影响^［11］。有研究发现表达ER的巨噬细胞在自身免疫性疾病中显示出调节免疫细胞活性的能力^［12］。然而，ER通路被阻断后巨噬细胞的反应，以及氟维司群是否直接调控巨噬细胞的极化及功能改变尚不明确。

基于以上，本研究首次对内分泌治疗药物氟维司群对巨噬细胞极化的影响进行观察，借助RNA‑Seq手段分析氟维司群刺激后巨噬细胞转录组表达的改变，筛选差异表达基因并分析其功能，进一步验证关键基因的表达，以期探明氟维司群对巨噬细胞功能的影响，为揭示内分泌治疗耐药的分子机制提供实验室基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

THP‑1单核细胞购自中国科学院细胞库（中国上海）。采用10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素、0.1%β‑巯基乙醇的RPMI‑1640培养基（Gibco， Thermo Fisher Scientific， United States）培养，所有细胞均在37 ℃、5% CO₂的湿润培养箱中培养，并在生长至85%的汇合度后进行实验。

1.2 巨噬细胞的诱导

将THP‑1细胞按500 000个/孔接种于6孔板中，用PMA（320 nmol/L）处理THP‑1细胞24 h，实验组（fulvestrant）加入氟维司群，对照组（vehicle）加入DMSO，两者浓度均为1 μmol/L，培养72 h后进行后续操作。

1.3 流式细胞术

胰酶消化并收集细胞，用汉克斯平衡盐溶液（HBSS）洗涤3次。用100 μL HBSS重悬细胞。加入抗体并在冰上孵育30 min。孵育后，将染色的细胞洗涤，去除多余的未结合抗体，重新悬于HBSS中，采用流式细胞术分析巨噬细胞表面marker变化。所有实验均重复3次。

1.4 免疫印迹实验（Western blot）

收集实验组（fulvestrant）和对照组（vehicle）蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度后，吸取一定量蛋白与5×SDA PAGE loading buffer按1∶4比例混合，将混合后的样品放入100 ℃的电热坩锅加热5~10 min。用十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后印到聚偏二氟乙烯膜上。将转移膜在脱脂乳中封闭1 h并且随后与一抗在4 ℃孵育过夜。将膜与一抗孵育后洗涤，与hrp标记的二抗孵育，使用标准的增强化学发光系统进行开发。该信号由Amersham Imager 680 （GE Healthcare， Madison， Wisconsin， USA）捕获。所有实验均重复3次。

1.5 RT‑qPCR

采用RNAiso Plus 试剂盒（日本TaKaRa公司）提取fulvestant组和vehicle组总RNA。采用 NanoDrop系统（美国ThermoFisher Scientific公 司）测定RNA浓度。采用含gDNA Eraser（日本 TaKaRa公司）的PrimeScript RT Reagent试剂盒 （日本TaKaRa公司）逆转录1 μg mRNA。采用 荧光定量PCR检测SRC‑1、ETS‑2和c‑JUN基因。 SYBR试剂盒购自日本TaKaRa公司，检测仪器 为QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR仪（美 国ThermoFisher Scientific公司）。引物由上海 擎科公司合成，引物序列见表1。反应条件： 95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，40个循环； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以β‑actin为内参，采用2^‑ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。

1.6 转录组测序

用氟维司群处理THP‑1衍生巨噬细胞3 d，诱导方法同前。采用 TRIzol 试剂依照说明书提取总 RNA。使用 NanoDrop 2000 分光光度计（ThermoScientific， USA）鉴定 RNA 纯度和定量，使用 Agilent 2100 Bioanalyzer （Agilent Technologies， Santa Clara， CA， USA）评估RNA 完整性。使用 VAHTS Universal V5 RNA‑seq Library Prep 试剂盒依照说明书构建转录组文库，具体如下：经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接、PCR，将总RNA样品转化为illumina^® 平台适用的测序文库。转录组测序和分析由上海欧易生物技术有限公司（Shanghai， China）进行。

1.7 差异基因的筛选

利用 "DESeq "R软件包比较fulvestant组和vehicle组细胞的基因表达水平。此外，使用以下标准选择差异表达基因（DEGs）：（a）|logFold Change|>0；（b）P_value<0.05，其中logFold Change<0的定义为下调基因，logFold Change>0的定义为上调基因

1.8 差异基因的GO和KEGG分析

使用clusterProfiler包对差异基因对所选差异基因进行基因本体（ Gene ontology，GO） 和京都基因及基因组百科全书 （ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 分析。其中GO功能富集结果包含3个类别，即生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。设置P<0.05，将分析结果用ggplot2包进行可视化，展示确定的前10个条目。

1.9 差异基因的蛋白互作网络构建及枢纽基因筛选

利用在线分析工具 STRING（https：//cn.string-db.org）构建蛋白互作网络并使用Cytoscape软件进行可视化。将所筛选 出来的差异基因输入至 List Of Names 框，在 Organism选择 Homo sapiens（人类），对差异基因编码的蛋白质相互作用进行分析，获取蛋白质相互作用数据。利用 Cytoscape软件将蛋白互作数据可视化，并使用该软件中的CytoHubba 插件筛选关键基因，选取Degree排名前15的基因作为潜在的枢纽基因，进行下一步验证与分析。

1.10 人趋化因子阵列实验

收集fulvestant组和vehicle组的细胞培养上清，离心去除细胞碎片后取上清2 mL用于检测。使用Proteome profiler array人趋化因子试剂盒分析趋化因子谱，按照生产商的说明使用。使用显影仪对膜进行显影，显影时间约为10~20 s。最后使用ImageJ 6.0软件（美国 Media Cybernetics 公司）对图像灰度进行分析。

1.11 统计学处理

所有实验均至少独立重复3 次。采用Graphpad Prism 9.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据2个组之间比较采用t检验，3组及以上比较采用ANOVA进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氟维司群对巨噬细胞极化的调控作用

为了研究氟维司群对M0极化的影响，选择THP‑1来源的M0作为观察对象。为确定诱导THP‑1细胞向M0型巨噬细胞分化最佳PMA浓度及作用时间，根据文献报道，设置2个浓度（160、320 nmol/L）及3个时间点（24、48、72 h）^{［13，14］}。通过观察细胞形态变化，发现160 nmol/L和320 nmol/L PMA处理的THP‑1细胞在诱导24 h后均由悬浮式生长变成贴壁生长，体积增大，48 h和72 h细胞形态与24 h相比无明显变化（图1A），提示THP‑1细胞被诱导分化为巨噬细胞。为确定PMA是否成功诱导THP‑1向M0型巨噬细胞分化，采用RT‑qPCR检测M0标志物CD68的表达，发现在不同诱导条件下，320 nmol/L PMA诱导后CD68基因表达量普遍高于160 nmol/L。同时在320 nmol/L PMA诱导处理24 h后CD68明显升高，并且延长诱导时间CD68表达变化不大（图1B）。对此本研究选择320 nmol/L PMA诱导THP‑1细胞24 h，采用Western blot和流式细胞术检测CD68的表达，发现其明显升高（图1C、D），因此后续实验均采用此条件获取THP‑1来源巨噬细胞。

为了进一步研究氟维司群对巨噬细胞的影响，对诱导成功的巨噬细胞进行了加药处理，发现巨噬细胞形态发生显著变化，由圆形变为细长形（图1E），提示氟维司群处理后细胞发生明显极化。本研究进一步采用RT‑qPCR和Western blot检测药物处理后巨噬细胞表面标志分子的表达变化，发现M2相关分子 CD206表达升高，M1相关分子 CD86表达显著降低（图1F~G）。同时流式细胞术也显示CD206⁺CD204⁺双阳细胞比例明显降低，CD86⁺细胞比例升高（图1H）。以上结果提示氟维司群可调控巨噬细胞的极化状态。

2.2 差异基因的筛选

为了进一步研究氟维司群对巨噬细胞功能状态的影响，借助RNA‑Seq手段和生物信息学技术分析了氟维司群刺激后巨噬细胞的基因表达差异。差异基因的热图显示，两组共有118个差异基因（P<0.05）。其中，与vehicle组相比，fulvestant组中有44个基因表达下调，74个基因表达上调（图2A）。差异基因的火山图显示，与vehicle组相比，fulvestant组中CCL8、CCL7、OAS1、MX2等基因表达明显下调，log₂FC值大于2.5，而CCL20、GPC1、CCL22、CXCL8等基因表达明显上调，log₂FC值大于1（图2B）。

2.3 差异基因的GO功能和KEGG通路富集分析

为了确定差异基因的主要功能，本研究利用 R 软件“clusterProfiler”包和“ggplot2”包对筛选出的差异基因进行 GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集结果显示，差异基因主要富集在GTP酶活性的正调控、趋化因子信号、趋化因子反应等生物学过程中（图3A）；在细胞组分上，差异基因主要富集于高尔基体、细胞接触及分离等处（图3B）；在分子功能上，差异基因主要富集在激酶结合、信号受体激活及调节活性、趋化因子及细胞因子活性等方面（图3C）。KEGG通路富集结果显示，差异基因主要富集于病毒反应、细胞因子与细胞因子受体反应、趋化因子信号等通路（图3D），提示差异基因的功能多与趋化因子有关。

2.4 差异基因的PPI网络构建及Hub基因筛选

为了确定差异基因中的关键基因，本研究利用STRING数据库构建所筛选出的差异基因的蛋白互作网络（PPI），并通过cytoHubba软件进行可视化。在STRING数据库中将未参与到相互作用关系的蛋白质过滤掉后，最终得到一个包含52个节点、148条边的 PPI 网络（图4A）。通过cytoHubba中的Degree算法计算PPI中前15个重要节点即Hub基因，其中包含7个氟维司群诱导表达上调的基因和8个表达下调的基因（图4B及表2）。这些Hub基因多属于趋化因子家族，提示氟维司群对巨噬细胞分泌趋化因子的功能有重要调控作用。

2.5 氟维司群对巨噬细胞中趋化因子表达的调控作用

为了验证氟维司群对巨噬细胞中趋化因子表达的影响，采用RT‑qPCR方法验证fulvestrant组相较于vehicle组巨噬细胞中趋化因子基因水平的表达差异。结果显示，与vehicle组相比，fulvestant组中M2相关趋化因子CXCL8、CCL20、CCL22在基因水平表达显著增加（图5A~C），而M1相关趋化因子CXCL10和CCL7在基因水平表达显著下降（图5C、D），与RNA‑Seq的结果一致，提示氟维司群可能影响巨噬细胞的极化转变。

2.6 趋化因子阵列分析氟维司群对巨噬细胞中趋化因子分泌的影响

为了探究氟维司群对巨噬细胞中趋化因子分泌的影响，收集vehicle组及fulvestant组的巨噬细胞的培养上清液，检测趋化因子蛋白水平的差异。结果表明，与vehicle组相比，fulvestant组分泌的M2相关趋化因子（CXCL8、CCL20、CCL22）均显著升高（图6A~D），而M1相关趋化因子（CXCL10、CCL7）则显著下降（图6A、E、F），验证了RNA‑Seq及RT‑qPCR实验的结果，提示氟维司群可能诱导巨噬细胞向M2极化，抑制其向M1极化。

3 讨论

内分泌治疗耐药是ER⁺乳腺癌患者的主要临床挑战之一，目前临床对这类患者尚无有效的治疗方案。近期的研究表明，TME中的巨噬细胞为ER⁺乳腺癌中主要的浸润免疫细胞，通常以M2型即TAM的形式存在^{［15，16］}。然而，内分泌治疗药物对巨噬细胞的直接调控作用尚不清楚。本研究选择THP‑1来源的巨噬细胞，观察氟维司群对其直接调控作用，借助RT‑qPCR、Western blot、流式细胞术、RNA‑Seq方法及细胞因子阵列等手段，发现内分泌治疗药物氟维司群可调控巨噬细胞极化相关标志分子并影响分泌趋化因子的表达，其中，与促肿瘤的M2表型相关的趋化因子CXCL8、CCL20、CCL22的分泌增加，与抗肿瘤的M1表型相关的趋化因子CXCL10、CCL7的分泌减少，提示内分泌治疗药物氟维司群可诱导巨噬细胞发生M2样极化，可能是乳腺癌获得内分泌治疗耐药的分子机制之一。

肿瘤通过多种机制对治疗药物产生耐药性，其中，TME是这一过程的重要因素。许多研究表明，靶向TME成分（如TAM）与肿瘤靶向治疗相结合可显著降低肿瘤生长、转移和耐药性^［17］。长期以来，单核细胞‑巨噬细胞谱系被认为是异质性的，这种异质性反映了这些细胞在暴露于微环境信号时的可塑性和多功能性^［18］。通过检测巨噬细胞M1、M2相关分子，初步发现内分泌治疗药物氟维司群可诱导M1 标志分子CD86的表达降低且使M2标志分子CD206的表达增加。此外，细胞因子产生的差异是极化巨噬细胞的一个关键特征，表达不同的趋化因子和趋化因子受体的巨噬细胞具有不同的生物学功能^［19］。本研究通过RNA‑Seq分析氟维司群刺激后巨噬细胞的转录组表达情况，发现共有118个差异表达基因，主要涉及激酶结合、信号受体激活及调节活性、趋化因子及细胞因子活性等功能的改变；以及病毒反应、细胞因子与细胞因子受体反应、趋化因子信号等通路的改变。由此可见，氟维司群对巨噬细胞的影响可能主要集中于趋化因子的改变，Hub基因的分析也证实了该结论。由于趋化因子的差异是极化巨噬细胞的一个重要特征，因此对氟维司群刺激后的巨噬细胞分泌的趋化因子做了验证。

趋化因子是TAMs产生的重要分泌物，可调节肿瘤的生长和转移^［20］。此前，已有研究发现对他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞可诱导TAM发生M2样极化，极化的M2样巨噬细胞通过分泌CCL2激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，加剧乳腺癌细胞的内分泌抵抗^［21］。然而，作为治疗绝经后妇女转移性晚期乳腺癌的首选药物，氟维司群治疗微环境中巨噬细胞的反应尚不明确。本研究发现，在氟维司群作用下，巨噬细胞分泌的CXCL8、CCL20、CCL22增加，而CXCL10、CCL7减少。CXCL8主要由TAM分泌，对于肿瘤的进展和转移至关重要^［22］。据报道，CXCL8在乳腺癌患者的肿瘤组织中的表达量较高，且CXCL8表达量较高的患者的总生存率明显缩短^［23］。研究发现，肿瘤组织中TAM的CCL20 表达显著高于肿瘤细胞和其他基质细胞，是一个不良预后因素^［24］。在三阴性乳腺癌中，CCL20激活NF‑κB通路可增加多药耐药基因的表达并促进化疗药物紫杉醇的细胞外排导致TNBC的化疗耐药^［25］。CCL22通常与Th2反应和组织修复相关，M2型巨噬细胞已被证明可产生大量CCL22^［26］。在乳腺癌中，肿瘤细胞和TAM均可释放CCL22，从而增强肿瘤部位的Treg细胞浸润，破坏化疗及免疫治疗的疗效^［27］。本研究结果显示，以上3种趋化因子均在氟维司群作用后巨噬细胞中分泌增加，而根据前人研究，上述3种趋化因子主要由M2样极化的TAM分泌，并与乳腺癌患者的不良预后及治疗反应性降低有关，提示氟维司群可能通过诱导巨噬细胞向M2型分化从而促进乳腺癌患者耐药的发生。

此外，本研究还发现2种促炎细胞因子CXCL10和CCL7在氟维司群作用后的巨噬细胞中分泌减少。在许多肿瘤中，如乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等，CXCL10通常由M1型巨噬细胞产生，以发挥促炎和抗肿瘤作用^［28］。近期的研究结果显示，CXCL10与表达检查点分子（如LAG‑3和PD‑1）的CD8⁺T细胞共定位，且CXCL10可以招募CD8⁺T细胞到肿瘤部位，使“冷肿瘤”向“热肿瘤”转变，从而增强免疫治疗效果^［29］。CCL7被认为是炎性细胞因子，它能上调巨噬细胞JAK2/STAT1蛋白水平，促进M1型巨噬细胞的激活导致炎症性疾病^［30］。本研究发现氟维司群作用后的巨噬细胞的炎性因子CXCL10和CCL7分泌减少，提示氟维司群可能抑制巨噬细胞向M1型转变，但明确表型还需进一步验证相关标志物。此外，趋化因子及其受体通常具有复杂的网络，同种趋化因子可与多种受体结合，同种受体也可识别和结合不同的趋化因子，不同类型的细胞对于趋化因子的响应也是多样化的，因此内分泌药物作用下巨噬细胞分泌的趋化因子对肿瘤细胞的影响及具体机制有待深入研究。

综上所述，本研究对氟维司群作用下巨噬细胞极化相关分子的改变及分泌趋化因子的功能变化进行了初步研究，发现该药物可诱导M2相关巨噬细胞表面标志分子CD206的表达升高同时使M1相关标志分子CD86的表达下降。此外，巨噬细胞分泌的M2极化相关趋化因子CXCL8、CCL20、CCL22增加，而M1极化相关的趋化因子CXCL10、CCL7的分泌减少，提示氟维司群可促进巨噬细胞向M2极化，为进一步研究肿瘤微环境与内分泌治疗抵抗的具体机制提供了新思路。

作者贡献度说明：

刘宇婷：提出主要研究目标，负责研究的构思与设计，研究的实施，撰写论文；叶敬文、刘泊含：研究思路并负责部分研究的实施；刘鷖雯、何怡青、杜艳、张国良、高锋：指导论文的撰写及修改；杨翠霞：负责文章的质量控制与审查，同时对实验设计进行指导，对文章整体负责。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(81974445)

国家自然科学基金资助项目(82273462)