俞募配穴对少弱精子症大鼠睾丸TGF‑β/smads信号通路的影响

Effects of Shumu acupoints on TGF‑β/smads signaling pathway in testis of oligoasthenospermia rats

摘要

目的 通过观察俞募脑肾配穴电针疗法对少弱精子症模型大鼠的影响，探究俞募脑肾配穴电针疗法对少弱精子症大鼠生殖功能的改善作用及对睾丸TGF-β/smads信号通路的影响。 方法 40只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、左卡尼汀组，每组10只。除空白组外，其余组采用腺嘌呤灌胃法制备少弱精子症大鼠模型，灌胃连续28 d，造模成功后，分别对电针组（电针额旁3线、肾俞、京门、太溪，30 min/次/d，连续28 d）、左卡尼汀组（以10 mL/kg左卡尼汀口服液灌胃，连续28 d）进行干预。治疗后取各组大鼠附睾精子检测其密度和活力率；H&E染色观察睾丸病理形态学变化；ELISA检测血清性激素睾酮、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇的变化；Western blot检测TGF-β、P-smad2、P-smad3在睾丸组织中的表达水平。 结果 与空白组比较，模型组大鼠睾丸组织中生精细胞变性，数量减少，排列紊乱；精子密度、精子活力率、血清睾酮水平显著降低（P<0.05），黄体生成素水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，左卡尼汀组、电针组大鼠睾丸病理损伤显著减轻，精子密度和活力率、血清睾酮水平显著增高（P<0.05），黄体生成素水平显著降低（P<0.05）。 结论 俞募脑肾配穴电针疗法可提高少弱精子症大鼠精子密度和活率，调节性激素产生，改善大鼠的生精环境，其机制可能与血清性激素水平的调控和通过TGF-β/smads信号通路，影响睾丸生精过程有关。

Abstract

Objective To observe the effects of Shumu Naoshen combined with acupoint electroacupuncture on oligoasthenospermia model rats， and to explore the effects of Shumu Naoshen combined with acupoint electroacupuncture on the reproductive function of oligoasthenospermia rats as well as the influence of TGF-β/smads signaling pathway on testis. Methods A total of 40 male SD rats were randomly divided into the blank group， the model group， the electroacupuncture group， and the L-carnitine group， with 10 rats in each group. Except for the blank group， the oligoasthenospermia rat model was prepared by adenine instillation for 28 d. After a successful modeling， the electroacupuncture group （3 lines of frontal injection， Shenshu， Jingmen， and Taixi injection， 30 min∙time^-1∙d^-1， for 28 d） and the L-carnitine group （10 mL/kg L-carnitine oral infusion， for 28 d） were respectively administered. After the treatment， the sperm density and motility rate of epididymis were tested. The morphological changes of testis were observed by H&E staining. Serum sex hormones testosterone， follicle-stimulating hormone， luteinizing hormone， and estradiol were detected by ELISA. The expression levels of TGF-β， P-smad2， and P-smad3 in testicular tissues were detected by Western blot. Results Compared to the blank group， spermatogenic cells in testis tissue of model group were degenerated， the number was decreased and the arrangement was disordered. Sperm density， sperm motility rate， and serum testosterone level were significantly decreased （P<0.05）， luteinizing hormone level was significantly increased （P<0.05）. Compared to the model group， the pathological damage of testicle in L-carnitine group and electroacupuncture group was significantly reduced； sperm density， motility rate， and serum testosterone level were significantly increased （P<0.05）， and luteinizing hormone level was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Shumu Naoshen combined with acupoint electroacupuncture can increase sperm density and viability， regulate sex hormone production， and improve spermatogenesis environment of rats with oligoasthenospermia. The mechanism may be related to the regulation of serum sex hormone levels and the influence of TGF-β/smads signaling pathway on testis spermatogenesis.

Graphical abstract

关键词

少弱精子症 / 俞募配穴 / 性激素 / TGF-β/smads信号通路

Key words

Oligoasthenospermia / Shumu acupoints / Sex hormone / TGF-β/smads signaling pathway

少弱精子症是男性不育的主要原因之一，且近年来发病率不断上升，目前约占不孕夫妇的40%~50%，精液质量下降是主要原因，尤其是少精子症和弱精子症，占据了58%~64%的不育病例^［1，2］。因此，寻求有效的治疗方法和应对策略变得尤为重要。目前，针对少弱精子症的治疗方法多种多样，主要依赖于激素、抗氧化剂、锌制剂等，导致结局不佳^［3］。而针灸作为一种传统中医疗法，广泛用于治疗生殖疾病^［4］。研究表明，治疗少弱精症主要以任脉、足太阳膀胱经、足阳明胃经、足太阴脾经、足少阴肾经上的穴位为主，大多为俞募配穴^［5］，而电针疗法对改善精子活力具有较好疗效^［6］。

TGF-β/smads信号通路是一种在胚胎生长发育、组织稳态维持以及细胞增殖、分化和迁移中不可或缺的信号传导途径^［7］。其中TGF-β1作为TGF-β超家族的肽生长因子，在调节受精、胚胎发育和组织/器官方面具有广泛的生物学效应^［8，9］。该信号通路通过调控细胞的增殖、分化和迁移等过程，参与睾丸组织的形成和发育，以及精子的形成和成熟^［10］。因此，当TGF-β/smads信号通路受到干扰或异常活化时，可能会导致睾丸功能的异常，进而影响精子的产生和质量。基于此，笔者提出了一个重要问题：俞募脑肾配穴是否能够影响睾丸TGF-β/smads信号通路，从而改善少弱精子症的症状。通过对这一问题的探究，笔者希望能够揭示俞募脑肾配穴对TGF-β/smads信号通路的影响机制，为少弱精子症的治疗提供新的方向和方法。

1 材料与方法

1.1 动物

40 只SPF级SD雄性大鼠，8 周龄，体质量在180~220 g之间。所有实验动物在宁夏医科大学动物实验中心的标准条件下饲养。所有实验动物由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（宁）2020-0001。温度为22~24 ℃，湿度为52~56 RH%，12 h光照和12 h黑暗交替。实验动物自由进食和饮水，隔日更换一次垫料，以保持笼内的清洁和干燥。所有实验操作都严格遵循宁夏医科大学动物伦理审查委员会的规定（伦理编号：IACUC-NYLAC-2021-130）。

1.2 试验药物和试剂

左卡尼汀口服液（H19990372，东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：211159）；腺嘌呤（A8330，北京索莱宝生物科技有限公司）；阿拉伯树胶粉（G8130，北京索莱宝生物科技有限公司）；无水乙醇（100092683，国药集团化学试剂有限公司）；分化液（C0163M，上海碧云天生物技术有限公司）；二甲苯（10023418，国药集团化学试剂有限公司）；苏木精-伊红（H&E）染色液（BA-4041，珠海贝索生物技术有限公司）；中性树胶（ZLI-9555，北京中杉金桥生物技术有限公司）；EDTA（PH8.0）抗原修复液（G1206，武汉赛维尔生物科技有限公司）；EDTA（pH9.0）抗原修复液（G1203，武汉赛维尔生物科技有限公司）；大鼠促卵泡素ELISA试剂盒（JL13251，上海江莱生物科技有限公司）；大鼠雌二醇ELISA试剂盒（JL11525，上海江莱生物科技有限公司）；大鼠促黄体激素ELISA试剂盒（JL13251，上海江莱生物科技有限公司）；大鼠睾酮ELISA试剂盒（JL11473，上海江莱生物科技有限公司）；TGFβ（Yt4632，Immunoway）；SMAD3（YT4334，Immunoway）；SMAD2（Gb11511，武汉塞维尔）；p-smad2（AF3449，Affinity）；p-smad3（Af3362，Affinity）。

1.3 主要仪器与设备

CASA计算机辅助精液分析（VICOS-SPERM，南宁松景天伦生物科技有限公司）；包埋机（JB-P5，武汉俊杰电子有限公司）；石蜡切片机（LEICARM22445，德国徕卡仪器有限公司）；离心机（LDZ5-2，北京离心机厂）；精子计数板（ML-CASA，浙江迈朗电子科技有限公司）；切片扫描仪（SCANNER，德国徕卡仪器有限公司）；水平摇床（ZD-9556，太仓市科技仪器厂）；电子天平（ME203E/02，梅特勒-托利多仪器有限公司）；超级恒温水浴（HH-601A，江苏金仪仪器科技有限公司）；实验室纯水系统（RS-10B，山东新瑞分析仪器有限公司）；-80 ℃低温冰箱（V512746，青岛海尔）；垂直电泳槽（DYCZ-21，北京六一仪器厂）。

1.4 分组及模型制备

选用雄性SD大鼠（SPF级）40只，鼠龄8周，体重180~220 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。适应性饲养1周后，随机分为4组：空白组、模型组、电针组、左卡尼汀组，每组各10只，使用大鼠耳标进行标号。空白组每日予以生理盐水灌胃，其余大鼠根据大鼠的体重，把称量好的腺嘌呤放入烧杯内，加入适量的阿拉伯树胶粉，用提前温育的生理盐水调至乳白色，以20 mg/mL灌胃，按1 mL/100 g体重进行灌胃，灌胃过程中需要不停地搅拌，减少腺嘌呤沉淀，防止堵塞灌胃针，每日定时灌胃，连续28 d。各组大鼠均在宁夏医科大学实验动物中心饲养，喂养辐照灭菌实验鼠维持饲料。

1.5 各组干预方法

电针组根据《实验针灸学》附录二《常用实验动物针灸穴位》^［11］和中国针灸协会发布的《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》^［12］，结合比较取穴法，确定了大鼠的针灸穴位。其中，额旁3线（CV4）位于额部，额旁2线外侧，额角发际内约2 mm处，上下各1.5 mm连线；肾俞（BL23）位于第二腰椎下两侧，背正中线旁开6 mm；京门（GB25）位于侧腰部，当第13肋骨游离缘端的下际处；太溪（KI3）位于内踝高点与跟腱后缘连线的中点凹陷处。在造模结束后次日行电针治疗，使用汉医牌一次性使用无菌针灸针0.25 mm×13 mm进行针刺。在固定大鼠后，暴露针刺部位，左手固定针刺部位皮肤，右手持一次性针灸针迅速刺入穴位，连接SDZ-Ⅱ型华佗牌电刺激仪。采用疏密波，频率为2 Hz/100 Hz，刺激强度为1.5 mA，以大鼠针刺局部肌肉微微颤抖为度，每次30 min，1 次/d，共治疗28 d。左卡尼汀组给予左卡尼汀口服液（东维力，沈阳制药，H19990372），剂量为10 mL/kg，连续灌胃28 d。空白组和模型组不做任何处理。

1.6 标本采集

在大鼠治疗结束后，禁食24 h，然后根据体重使用7%水合氯醛溶液（0.7 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉。待麻醉成功后，剃去腹部毛发，进行局部清洁消毒。将大鼠置于仰卧位，固定四肢于解剖台上。用一次性静脉采血针于心尖部采血4 mL于离心管中，编号后室温静置1 h，以3 000 r/min离心 10 min，吸取上清用EP管分装，-80 ℃冰箱保存，进行血清性激素水平检测。并断头处死大鼠，随后摘取大鼠睾丸，仔细清除表面血管、脂肪及结缔组织，生理盐水漂洗，滤纸拭干，将一侧睾丸称重后立即放入4%中性多聚甲醛常温固定48 h，之后进行石蜡切片，以便进行组织病理形态学观察。另一侧睾丸放入已标号的冻存管中，并立即投入液氮急冻，之后保存至-80 ℃超低温冰箱备用，以进行Western blot法检测相关指标。

1.7 检测指标及方法

1.7.1 大鼠精液质量检测

取大鼠一侧附睾，去除多余脂肪组织，放入预热的生理盐水中孵育5 min。孵育结束后，用眼科剪子剪碎附睾，经过200目筛过滤，轻轻吹打混匀。取10 μL稀释后的精子悬液，滴于预热的计数板盖玻片的边缘，使精子悬液自动渗入计数池。使用计算机辅助精液分析系统检测精子的密度和活力率。

1.7.2 睾丸组织形态学观察

大鼠的一侧睾丸以4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋、切片，置于37 ℃烤箱过夜，常规脱蜡、脱水，H&E染色，再经梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，封片，光镜下观察睾丸组织结构变化。

1.7.3 ELISA法观察各组大鼠激素水平的变化

血清样本按孔数计算后，将抗体稀释至每毫升含有10 μg的蛋白，并在每个孔中加入100 μL，过夜孵育。次日，将包被板从4 ℃冰箱取出后，室温静置1 h，随后清洗孔内溶液，用洗涤缓冲液重复清洗孔内3次。接着，每个孔中加入200 μL封闭液，封板膜封闭后室温孵育2 h。再次用洗涤缓冲液清洗3次，然后在每个包被的反应孔中加入稀释后的样品，每孔100 μL，孵育2 h。随后，每个孔中加入100 μL生物素化抗体液，封板膜封板后室温孵育1 h。再次用洗涤缓冲液清洗3次，并在每个孔中加入100 μL酶结合物工作液，封板后室温避光孵育30 min。最后，在每个孔中加入100 μL TMB底物溶液，室温避光孵育30 min，直到出现明显的颜色梯度。终止反应时，在各反应孔中加入2 mol/L硫酸100 μL，颜色由蓝色变为黄色。在10 min内，以空白对照孔调零后，在450 nm处测各孔的OD值，并根据OD值计算样本浓度。

1.7.4 Western blot法观察各组大鼠睾丸中的TGF‑β/smad信号通路相关蛋白表达

取出大鼠睾丸组织后，用冷1×PBST洗涤2、3次，去除血污，随后将其剪成小块置于2 mL的研磨管中，并加入裂解液进行充分研磨后静置10 min。在4 ℃条件下，以13 000 r/min离心20 min后，取上清液，使用BCA法进行蛋白定量。接下来进行蛋白上样、电泳、转膜、封闭，并在封闭后加入一抗，室温摇床孵育过夜。次日取出PVDF膜，摇床上漂洗后加入二抗，将二抗稀释3 000倍，置于二抗工作液中90 min，然后使用1PBST洗去游离二抗，按1∶1（v/v）混合AB溶液，进行显色成像。显色后根据条带亮度选择合适的曝光时间，随后通过胶片扫描，使用ImageJ软件测定条带灰度值，并以β-actin作为内参进行蛋白表达量的计算。

1.8 统计学处理

使用GraphPad Prism 8.0对实验所得数据进行处理，首先检验数据的正态性，各组多重比较使用单因素方差分析法、两两比较使用LSD检验的方法做统计学分析，计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠精液质量分析

4组大鼠治疗后精子密度比较，经方差分析，4组间差异有统计学意义（F=238.15，P<0.001）；4组大鼠治疗后精子活力率比较，经方差分析，4组间差异有统计学意义（F=107.00，P<0.001）。见表1、图1。与空白组比较，模型组精子密度和精子活力率均显著降低（P<0.05），说明模型成功；与模型组比较，电针组和左卡尼汀组精子密度及精子活力率均显著升高（P<0.05）；电针组精子密度较左卡尼汀组升高显著（P<0.05）；电针组与左卡尼汀组精子活力率无显著差异（P>0.05）。

2.2 睾丸组织形态学变化

空白组大鼠的生精小管呈圆形或椭圆形，管壁厚实，基膜轮廓完整，厚度适中，排列紧密，管腔结构明显，其中各级生精细胞有序排列，结构完整，间隙紧密，间质结构清晰完整；模型组大鼠生精小管出现了明显的萎缩退化现象，管腔扩大，管壁变薄，层次减少，结构紊乱，甚至出现核空泡化，生精上皮细胞出现变形和变薄，间质水肿，轮廓不清，生精细胞破坏，排列紊乱，数量明显减少，支持细胞部分缺失；与模型组相比，电针组大鼠的睾丸生精小管结构相对完整，生精上皮细胞有所恢复，虽然排列略显松散，但基膜逐渐完整，管腔结构逐渐清晰，支持细胞和间质细胞增多，各级生精细胞数量明显恢复；左卡尼汀组大鼠的睾丸组织相对于模型组有所修复，生精小管相对饱满，结构趋于完整，各级生精细胞有序排列，管腔内可见较多的精子细胞。见图2。

2.3 大鼠血清激素水平变化

4组大鼠治疗后性激素水平比较，经方差分析，4组间素睾酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）差异有统计学意义（F=164.41，P<0.001；F=95.51，P<0.001；F=78.33，P<0.001；F=22.98，P<0.001）。与空白组比较，模型组血清T水平降低（P<0.05），FSH、LH、E2水平均升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组和左卡尼汀组血清T水平升高（P<0.05），FSH、LH、E2水平均降低（P<0.05）；电针组血清FSH水平较左卡尼汀组升高显著（P<0.05）；电针组与左卡尼汀组血清T、LH、E2水平无显著差异（P>0.05）。见表2、图3。

2.4 TGF‑β/smads信号通路相关蛋白在大鼠睾丸中的表达

4组大鼠治疗后 TGF-β/smads信号通路相关蛋白比较，经方差分析，4组间TGF-β、P-smad2、P-smad3差异有统计学意义（F=88.45，P<0.001；F=59.74，P<0.001；F=273.87，P<0.001）。与空白组比较，模型组TGF-β、P-smad2、P-smad3 均升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组和左卡尼汀组精子TGF-β、P-smad2、P-smad3均降低（P<0.05）；电针组与左卡尼汀组TGF-β、P-smad2、P-smad3无显著差异（P>0.05）。见表3、图4。

3 讨论

少弱精子症是男性不育症的常见类型之一，其特征为精子数量少、活力差等，降低了精卵结合的概率，是男性不育的主要原因^［13］。左卡尼汀又称肉碱或肉毒碱，在附睾中以游离状态存在。它能够将长链脂肪酸及磷脂等物质转运到线粒体内进行氧化供能，从而提高Sertoli细胞的能量供应^［14］，改善精子的营养状况。这一过程有效提高男性不育患者的精子活力和前向运动百分率^［15］。同时，研究表明左卡尼汀具有清除过多的活性氧物质（ROS）的作用，减少ROS对各级生殖细胞的损害，防止生精细胞凋亡，从而增加精子数量，提高男性生殖功能^［16］。左卡尼汀的临床安全性较高，人体对其不良反应较少，具有良好的耐受性，因此在临床上得到广泛应用^［17］。

中医认为“肾”是一个功能系统，肾藏精，肾精可化生肾气，肾气充则天癸至，天癸可使肾精转化为生殖之精，而肾精的盛衰直接影响男性生育能力，决定着是否能成功受孕^［18］。因此，治疗少弱精子症应以补肾益精为核心治则^［19］。中医传统针灸疗法在治疗少弱精子症方面具有迅速有效、简便绿色等优势^［20］。俞穴与募穴均为针灸临床上常用之要穴，常配伍使用，加强腧穴之间的协同作用，称为“俞募配穴法”^［21］。京门是肾经的募穴，主要用于治疗水道不畅，促进水液代谢^［22］。肾俞是肾脏精气输注的地方，有助于补肾益气、促进阳气通畅、利水排毒，适用于治疗肾脏相关疾病^［23］。肾俞和京门配合使用，可以温补肾阳，促进尿液排出，治疗肾虚引起的症状^［24］，如遗精、白浊、腰痛等。根据国际头针标准，额旁三线位于足阳明胃经头维穴内侧0.5寸^［25］。焦氏头针认为，额旁三线属生殖区，与足运感区配伍可治阳痿、早泄、遗精等生殖病证^［26］。太溪穴是脏腑原气输注的重要位置，具有滋阴生髓、降火的功效，是滋阴的关键穴位^［27］，取之以调补肝肾。《循经考学编》指出，太溪穴主要用于治疗肾气虚弱、阴痿不起等症状^［28］。因此，选择太溪穴可以补益肾脏、滋养肝脏，促进精血的生成，从而改善男性生殖功能。另外，头部额旁的三线与足少阴肾经的太溪穴相对应，通过这种配伍可以滋补肾气、强身健体，达到阴阳平衡、身心健康的治疗效果。

精子的生成和成熟是一个受下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴调控的复杂过程^［29］。在这一轴中，促性腺激素释放激素由下丘脑释放，刺激垂体释放FSH和LH，后者作用于睾丸，促进睾丸间质细胞产生T和E2，维持精子发生所需的正常环境^{［30，31］}。FSH增强LH的作用，促进Sertoli细胞中次级精母细胞的发育，并维持睾酮水平^［32］。睾酮在精子生成过程中扮演关键角色，其缺乏会影响精子的产生和活力^［33］。因此，HPG轴的失调可能导致生殖激素水平异常，进而影响精子发生。除了生殖激素的调节外，精子发生还受到各种细胞因子的调节，如转化生长因子（TGF-β）家族。TGF-β信号通路通过SMAD蛋白家族参与调节精子的生成和成熟，影响睾丸功能^［34］。在睾丸疾病中，TGF-β通路和SMADs参与了调节睾丸细胞增殖和细胞周期的过程^{［35，36］}。正常生理情况下，TGF-β在各级精子细胞发育中表达，激活信号传导使SMAD接头区域磷酸化，参与精子细胞分化^［37］。若其蛋白表达异常升高，磷酸化底物SMAD，TGF-β/smad信号通路异常激活致生殖功能障碍。经俞募脑肾配穴法电针治疗后，TGF-β蛋白表达降低，smad2/3磷酸化水平降低，TGF-β/smads 信号通路正常传导，生精功能逐渐恢复。

本研究通过俞募脑肾配穴电针疗法干预少弱精子症大鼠，发现其在一定程度上能够改善大鼠睾丸形态、精液质量和性激素水平并且优于左卡尼汀组。此外，研究还观察到俞募脑肾配穴电针疗法对TGF-β/smads信号通路相关蛋白在睾丸组织中的表达产生影响，从而改善少弱精子症的症状。可能的机制是通过TGF-β/smads信号通路，影响睾丸生精过程，从而达到改善少弱精子症的目的。然而，由于该机制的复杂性以及信号通路与相关调节因子之间的联系尚不完全明确，这一领域仍需进行更深入的研究。

作者贡献度说明：

王菲：实验设计，试验实施，论文撰写；孟纯雪：试验实施，数据整理；孙文静、杨楠、赵海龙、张生富、张千、唐旭红：试验实施，数据收集；马惠昇、郭斌：试验设计，提供经费支持，论文审校。

所有作者声明不存在任何利益冲突关系。

参考文献

[1] Ma L， Li B， Ma J， et al. Novel discovery of schisandrin A regulating the interplay of autophagy and apoptosis in oligoasthenospermia by targeting SCF/c-kit and TRPV1 via biosensors［J］. Acta Pharm Sin B， 2023， 13（6）： 2765-2777.

[2] Ding J， Lu B， Liu L， et al. Guilu-Erxian-Glue alleviates Tripterygium wilfordii polyglycoside-induced oligoasthenospermia in rats by resisting ferroptosis via the Keap1/Nrf2/GPX4 signaling pathway［J］. Pharm Biol， 2023， 61（1）： 213-227.

[3] Yang H， Wan Z， Jin Y， et al. SMAD2 regulates testicular development and testosterone synthesis in Hu sheep［J］. Theriogenology， 2021， 174： 139-148.

[4] 杨滨， 孟庆宇， 陈昊， 等. 针药结合治疗少弱精症有效性的Meta分析［J］. 针刺研究， 2020， 45（3）： 243-250.

[5] Yang B， Meng QY， Chen H， et al. Clinical effect of acupuncture combined with traditional Chinese medicine in treatment of oligozoospermia/asthenozoospermia： A meta-analysis［J］. Acupunct Res， 2020， 45（3）： 243-250.

[6] 梁尚杰， 李红晓， 陈霞， 等. 基于文献数据挖掘针药结合治疗少弱精症临床规律［J］. 时珍国医国药， 2020， 31（11）： 2797-2800.

[7] Liang SJ， Li HX， Chen X， et al. Clinical analysis of oligoasthenozoospermia by acupuncture and medicine combination based on data mining［J］. Lishizhen Med Mater Med， 2020， 31（11）： 2797-2800.

[8] Wang Z， Zhou Z， Zhang L， et al. Efficacy and safety of nonpharmacological strategies for the treatment of oligoasthenospermia： A systematic review and Bayesian network meta-analysis［J］. Eur J Med Res， 2023， 28（1）： 6.

[9] Liu H， Sun M， Wu N， et al. TGF-β/Smads signaling pathway， Hippo-YAP/TAZ signaling pathway， and VEGF： Their mechanisms and roles in vascular remodeling related diseases［J］. Immun Inflamm Dis， 2023， 11（11）： e1060.

[10] Zhou W， Yan K， Xi Q. BMP signaling in cancer stemness and differentiation［J］. Cell Regen， 2023， 12（1）： 37.

[11] Ten Dijke P， Goumans MJ， Itoh F， et al. Regulation of cell proliferation by Smad proteins［J］. J Cell Physiol， 2002， 191（1）： 1-16.

[12] Lu M， Qin Q， Yao J， et al. Induction of LOX by TGF-β1/Smad/AP-1 signaling aggravates rat myocardial fibrosis and heart failure［J］. IUBMB Life， 2019， 71（11）： 1729-1739.

[13] 郭义. 实验针灸学实验指导［M］. 北京： 中国中医药出版社， 2012： 47-48.

[14] Guo Y. Experimental guidance of experimental acupuncture［M］. Beijing： China Traditional Chinese Medicine Press， 2012： 47-48.

[15] 中国针灸学会. 实验动物常用穴位名称与定位第2部分： 大鼠［J］. 针刺研究， 2021， 46（4）： 351-352.

[16] China Association of Acupuncutre-Moibustion. Common acupuncture point names and positioning in experimental animals part 2： Rats［J］. Acupunct Res， 2021， 46（4）： 351-352.

[17] 崔良浩， 徐新宇， 戴宁. 戴宁基于“肾虚精浊”辨治男性不育少弱精子症经验［J］. 浙江中医药大学学报， 2024， 48（4）： 479-482.

[18] Cui LH， Xu XY， Dai N. Professor Dai Ning’s experience in differentiating and treating male infertility oligoasthenospermia with “kidney deficiency and sperm turbid”［J］. J Zhejiang Chin Med Univ， 2024， 48（4）： 479-482.

[19] Mateus FG， Moreira S， Martins AD， et al. L-carnitine and male fertility： Is supplementation beneficial？［J］. J Clin Med， 2023， 12（18）： 5796.

[20] Shang X， Wang L， Mo D， et al. Effect and safety of L-carnitine in the treatment of idiopathic oligoasthenozoospermia： A systemic review［J］. Chin J Androl， 2015， 21（1）： 65-73.

[21] 李富东， 王养民， 常德辉. 左卡尼汀在泌尿男科中的应用［J］. 西北国防医学杂志， 2019， 40（9）： 584-591.

[22] Li FD， Wang YM， Chang DH. Application of L-carnitine in urology［J］. Med J Nation Defend Forces North Chin， 2019， 40（9）： 584-591.

[23] 王先进， 王涛， 王彬， 等. 左卡尼汀在男科疾病中临床应用中国专家共识 （附录：精浆或血清肉碱检测方法）［J］. 中国男科学杂志， 2024， 1： 3-14.

[24] Wang XJ， Wang T， Wang B， et al. Chinese expert consensus on the clinical use of L-carnitine in androgenic diseases （Appendix： Seminal plasma or serum carnitine detection methods）［J］. Chin J Androl， 2024， 1： 3-14.

[25] 黄念文， 李海松， 王彬， 等. 基于“肾主生殖”理论探讨少弱精子症的病机及龟鹿育麟汤组方思路［J］. 天津中医药大学学报， 2024， 43（3）： 285-288.

[26] Huang NW， Li HS， Wang B， et al. Exploring the pathogenesis of oligoasthenozoospermia based on the theory of “kidney governing reproduction” and the formulation of Guilu Yulin Tang［J］. J Tianjin Univ Tradit Chin Med， 2024， 43（3）： 285-288.

[27] 韩亮， 厉将斌， 李海松. 基于“阳化气， 阴成形”理论探讨精液异常男性不育症辨治思路［J］. 环球中医药， 2022， 15（1）： 46-48.

[28] Han L， Li JB， Li HS. Discussion on differentiation and treatment of male infertility with abnormal semen based on the theory of “Yang transforming Qi and Yin forming”［J］. Global Chin Med， 2022， 15（1）： 46-48.

[29] 张芳， 孙自学， 陈建设， 等. 中医药治疗特发性少弱精子症的思路与方法［J］. 辽宁中医杂志， 2024， 51（1）： 38-42.

[30] Zhang F， Sun ZX， Chen JS， et al. Thoughts and methods of treating idiopathic oligoasthenospermia with traditional Chinese medicine［J］. Liaoning J Tradit Chin Med， 2024， 51（1）： 38-42.

[31] 胡志飞， 郑州， 沙静涛. “俞募配穴法”针刺预防混合痔术后尿潴留的临床观察［J］. 实用中医内科志， 2025， 39（3）： 137-139.

[32] Hu ZF， Zheng Z， Sha JT. Clinical observation of preventing urinary retention after mixed hemorrhoids［J］. J Pract Tradit Chin Inter Med， 2025， 39（3）： 137-139.

[33] 隋宇航， 茅若兰， 薛雅若， 等. 洞鉴古今探源“肠神同调”腧穴内涵及规律［J］. 辽宁中医杂志， 2024， 51（5）： 6-10.

[34] Sui YH， Mao RL， Xue YR， et al. On the origin of connotation and law of acupoints for “simultaneous adjustment of intestine and spirit” from the ancient to the modern times［J］. Liaoning J Tradit Chin Med， 2024， 51（5）： 6-10.

[35] 黄桃， 黄鸿鹏， 石建爽， 等.肾俞穴穴性及用法新探［J］. 广州中医药大学学报， 2024， 41（3）： 659-663.

[36] Huang T， Huang HP， Shi JS， et al. A new exploration on the property and usage of Shenshu points［J］. J Guangzhou Univ Tradit Chin Med， 2024， 41（3）： 659-663.

[37] 邹敏. 基于线粒体自噬途径探讨育子方治疗男性弱精子症的临床疗效观察与效应机制［D］. 昆明： 云南中医药大学， 2023.

[38] Zou M. Study on the clinical efficacy and mechanism of Yuzi prescription in the treatment of male asthenospermia based on mitochondrial autophagy pathway［D］. Kunming： Yunnan University of Chinese Medicine， 2023.

[39] 王相云， 仲崇副， 张超， 等. 中医外治法治疗男性不育症的研究进展［J］. 中国性科学， 2021， 30（11）： 116-119.

[40] Wang XY， Zhong CF， Zhang C， et al. Research progress of TCM external treatment on male infertility［J］. Chin J Human Sex， 2021， 30（11）： 116-119.

[41] 杨雪圆， 林雅思， 何欢， 等. 针灸治疗男性不育症腧穴配伍规律的复杂网络分析［J］. 中国男科学杂志， 2022， 36（6）： 48-53.

[42] Yang XY， Lin YS， He H， et al. Complex network analysis of compatibility law of acupoints on acupuncture and moxibustion for male infertility［J］. Chin J Androl， 2022， 36（6）： 48-53.

[43] 周婷， 白昕予， 孙甜， 等. 滋水涵木针法联合头穴透刺治疗卒中后上肢运动功能障碍的临床研究［J］. 辽宁中医杂志， 2024， 51（6）： 167-170.

[44] Zhou T， Bai XY， Sun T， et al. Clinical study on treatment of upper limb motor dysfunction after stroke by nourishing water to moisten wood acupuncture combined with head point penetrating acupuncture［J］. Liaoning J Tradit Chin Med， 2024， 51（6）： 167-170.

[45] 杨光照， 庄天衢. 美子桂甘龙牡汤联合经皮穴位电刺激治疗特发性少精症临床观察［J］. 实用中医药杂志， 2016， 32（10）： 962-963.

[46] Yang GZ， Zhuang TH. Clinical observation of Meizi Guigan Longmu Decoction combined with percutaneous acupoint electrical stimulation in treatment of idiopathic oligospermia［J］. J Pract Tradit Chin Med， 2016， 32（10）： 962-963.

[47] Crowder CM， Lassiter CS， Gorelick DA. Nuclear androgen receptor regulates testes organization and oocyte maturation in zebrafish［J］. Endocrinology， 2018， 159（2）： 980-993.

[48] Wiciński M， Fajkiel-Madajczyk A， Kurant Z， et al. Can Ashwagandha benefit the endocrine system？-A review［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（22）： 16513.

[49] Kazmi SR， Can AS. Luteinizing hormone deficiency［M］. In： StatPearls. Treasure Island （FL）： StatPearls Publishing， 2023.

[50] Spaziani M， Carlomagno F， Tenuta M， et al. Extra-gonadal and non-canonical effects of FSH in males［J］. Pharmaceuticals （Basel）， 2023， 16（6）： 813.

[51] 马秉哲， 焦丹丽， 崔梦凡， 等. 麦粒灸足三里穴调控氧化应激对自然衰老小鼠睾酮水平影响［J］. 辽宁中医药大学学报， 2024， 26（9）： 168-172.

[52] Ma BZ， Jiao DL， Cui MF， et al. Effects of grain-sized moxibustion at Zusanli （ST36） on testosterone level in naturally aging mice by regulating oxidative stress［J］. J Liaoning Univ Tradit Chin Med， 2024， 26（9）： 168-172.

[53] Yang Z， Zhang X， Chen Z， et al. Effect of Wuzi Yanzong on reproductive hormones and TGF-β1/Smads signal pathway in rats with oligoasthenozoospermia［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2019， 2019： 7628125.

[54] Xiao Z， Liang J， Huang R， et al. Inhibition of miR-143-3p restores blood-testis barrier function and ameliorates sertoli cell senescence［J］. Cells， 2024， 13（4）： 313.

[55] 常征辉. 益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究［D］. 北京： 北京中医药大学， 2021.

[56] Chang ZH. Study on the therapeutic effect and mechanism of Yishenxingyang capsule on oligoasthenospermia model［D］. Beijing： Beijing University of Chinese Medicine， 2021.

[57] Kamato D， Burch ML， Piva TJ， et al. Transforming growth factor-β signalling： Role and consequences of Smad linker region phosphorylation［J］. Cell Signal， 2013， 25（10）： 2017-2024.