槲皮素通过SLC7A11/GPX4/ACSL4通路调控铁死亡改善卵巢早衰的机制研究

Study on the mechanism of quercetin regulating iron death through SLC7A11/GPX4/ACSL4 pathway to improve premature ovarian failure

摘要

目的 基于POF小鼠模型评价槲皮素对POF的保护作用及对铁死亡的调控机制。 方法 于2024年7~8月，将30只5周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠随机分为正常组，模型组及槲皮素组；除正常组外，其余2组腹腔注射环磷酰胺建立POF模型。槲皮素组给予槲皮素灌胃干预21 d，其余2组给予同量生理盐水。干预结束后取小鼠血清进行AMH、FSH、E₂、T-SOD及CAT测定，取卵巢组织进行H&E染色、免疫组化分析、qRT-PCR检测。 结果 与正常组比较，模型组闭锁卵泡明显增多，AMH和E₂水平明显降低（P<0.01），FSH水平明显升高（P<0.01），T-SOD活力和CAT活力明显降低（P<0.01），SLC7A11和GPX4基因及蛋白表达水平明显降低（P<0.05），ACSL4基因及蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与模型组相比，槲皮素组闭锁卵泡减少，卵巢病理组织可见成熟卵泡，AMH和E₂水平显著升高（P<0.01），FSH水平显著降低（P<0.01）。与模型组相比，槲皮素组T-SOD活力和CAT活力明显升高（P<0.05）；SLC7A11表达升高，GPX4表达明显升高，ACSL4表达明显降低（P<0.05）。 结论 槲皮素通过激活SLC7A11/GPX4/ACSL4通路，有效抑制铁死亡过程，进而显著改善POF小鼠的卵巢功能和性激素水平。

Abstract

Objective To evaluate the protective effect of quercetin on premature ovarian failure （POF） and the regulatory mechanism of iron death based on POF mouse model. Methods During July and August， 2024， a total of 30 five-week-old female SPF C57BL/6 mice were randomly assigned to the normal， model， and quercetin group. Besides the normal group， the POF model was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide in the other two groups. Quercetin group was given quercetin gavage for 21 d， and the other two groups were given the same dose of normal saline. After the intervention， mouse serum was taken for AMH， FSH， E₂， T-SOD， and CAT determination， and ovarian tissue was taken for H&E staining， immunohistochemical analysis and qRT-PCR detection. Results Compared to the normal group， the atretic follicles in the model group were significantly increased， AMH and E₂ levels were significantly decreased （P<0.01）， FSH levels were significantly increased （P<0.01）， T-SOD activity and CAT activity were decreased significantly （P<0.01）， SLC7A11 and GPX4 expressions were significantly decreased （P<0.05）， and the expression of ACSL4 was significantly increased （P<0.01）. Compared to the model group， atretic follicles were reduced in the quercetin group， mature follicles were observed in ovarian pathological tissue， AMH and E₂ levels were significantly increased （P<0.01）， and FSH level decreased significantly （P<0.01）. Compared to the model group， T-SOD activity and CAT activity in quercetin group were significantly increased （P<0.05）； SLC7A11 expression was increased， GPX4 expression was increased， and ACSL4 expression was decreased （P<0.05）. Conclusion Quercetin can inhibit iron death by activating SLC7A11/GPX4/ACSL4 pathway， thereby improving ovarian function and sex hormone level in POF mice.

Graphical abstract

关键词

卵巢早衰 / 小鼠 / 槲皮素 / 铁死亡

Key words

Premature ovarian failure / Mice / Quercetin / Iron death

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），指女性在40岁前发生卵巢功能衰竭，全球发病率约3.5%^［1］。POF除导致闭经、生育能力下降外，还会伴有不同程度的低雌激素症状，如潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，为女性带来诸多困扰^［2］。目前临床治疗主要采用雌孕激素序贯疗法，但此类疗法需要患者长期服用药物以维持疗效，增加了患者面临诸多不良反应的风险^［3，4］。因此，寻找安全且有效的治疗策略对于治疗POF具有极其重要的价值。

POF的发病机制复杂，涉及遗传、免疫、环境等多种因素。卵泡颗粒细胞在卵泡的生长发育过程中起着重要作用，颗粒细胞能够调节卵泡的静止、启动及活化等过程。研究发现，颗粒细胞铁死亡能够调控卵巢发生氧化应激反应，导致卵泡提前闭锁，进而使血清卵泡刺激素（FSH）水平升高和雌激素水平下降，是引发POF的主要因素之一^［5］。此外，赵敏等^［6］研究发现闭锁卵泡存在明显的铁死亡特征，激活与铁死亡相关通路SLC7A11/GPX4能够有效抑制卵泡闭锁，调节性激素水平，改善POF大鼠的卵巢功能，提示铁死亡与POF发病密切相关。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有显著的抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫调节等作用^［7］。研究表明，槲皮素可以明显改善POF小鼠的卵巢病理形态和功能^［8］。然而，关于槲皮素是否通过调控铁死亡治疗POF以及相关的机制尚不清楚，仍需进一步研究。本研究通过环磷酰胺法诱导POF小鼠模型，聚焦SLC7A11/GPX4/ACSL4通路，旨在观察槲皮素对POF的保护作用及对铁死亡的影响，为槲皮素治疗POF提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究时间

2024年7月~2024年8月。

1.1.2 实验动物

30只5周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠，体质量（20±5）g，购自广州锐格生物科技有限公司，合格证号SCXK（粤）2023-0059；于广州医科大学动物房饲养，饲养温度为（25±1） ℃，相对湿度60%±10%，并设置12 h光照与12 h黑暗循环，饲养期间小鼠自由摄取水和食物。所有动物实验均按照广州医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会的指导原则进行，实验动物伦理批号：20240617。

1.1.3 药物和试剂

槲皮素（麦克林，Q817162）；环磷酰胺（Sigma，C0768）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，A001-1）；过氧化氢酶（CAT）活性、FSH、雌二醇（E₂）、抗缪勒管激素（AMH）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（常州灏天启生物医药有限公司，HTQ-SH-0002、HTQ-ES-03317、HTQ-ES-03495、HTQ-ES-03327）；RNA提取试剂盒（Yeasen，19221ES50）；反转录试剂盒（Yeasen，HB20716），RT-PCR试剂盒（Yeasen，HB22019）；一抗：SLC7A11（ABclonal，A2413），GPX4（ABclonal，A11243），ACSL4（江苏亲科生物研究中心有限公司，DF12141）；苏木素伊红（H&E）染色试剂盒（索莱宝，G1120）。

1.1.4 仪器

生物显微镜（广州市明美光电技术有限公司，ML31-M）；石蜡切片机（金华克拉泰仪器有限公司，CR-603）；多功能酶标仪（Molecular Devices，LLC，SpectraMax iD3）；多功能样本均质器（宁波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-24）；普通PCR仪（新加坡Life Technologies Holdings，MiniAmp Plus），实时荧光定量PCR仪（赛默飞，7500）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及造模

小鼠经7 d适应性喂养后，连续观察动情周期10 d，动情周期正常则纳入下一步实验。30只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、槲皮素组，每组10只。模型组及槲皮素组小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺100 μL（90 mg/kg）建立POF模型^［9］，正常组同时腹腔注射生理盐水。结合文献研究中槲皮素在小鼠中的使用量及对环磷酰胺诱导卵巢功能不全小鼠的干预疗效，选择50 mg^-1kg^-1d的剂量对槲皮素组小鼠进行灌胃，连续21 d^{［10，11］}；正常组及模型组每日用等量0.9%生理盐水灌胃。实验期间每日上午9：00进行阴道涂片观察小鼠动情周期，判断动情周期是否紊乱及是否恢复。药物干预结束次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，眼球采血，并分离双侧卵巢。

1.2.2 苏木素‑伊红（H&E）染色观察小鼠卵巢组织病理学

小鼠卵巢组织置于0.9%生理盐水中进行剥离和清洗，用4%多聚甲醛固定过夜，依次进行石蜡包埋、切片（4 μm）、脱腊、脱水、染色及封片，在光学显微镜下观察并采集图像。

1.2.3 ELISA及生化法检测血清性激素、T‑SOD和CAT水平

眼球采血后，血样于3 500 r/min，30 min，4 ℃条件下离心取血清。采用ELISA及生化试剂盒分别对小鼠血清中的FSH、E₂、AMH、T-SOD和CAT水平进行检测，实验步骤严格遵循相应试剂盒的使用说明书。

1.2.4 qRT‑PCR法检测相关基因表达

小鼠卵巢组织按照RNA提取试剂盒说明书进行操作提取RNA，使用反转录试剂盒进行逆转录获取cDNA，qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR，以GAPDH为参照，数据分析采用2^‐△△CT法，引物序列见表1。

1.2.5 免疫组织化学法（IHC）检测相关蛋白表达

石蜡包埋切片（4 μm），65 ℃烤片1 h，二甲苯脱腊3次，10 min/次，梯度乙醇（100%、95%、75%）脱水，每梯度5 min，蒸馏水冲洗1 min。3% H₂O₂避光封闭内源性过氧化物酶10 min，蒸馏水洗2次，1 min/次。枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）微波修复5 min，1×PBS清洗2次，3 min/次。10%山羊血清37 ℃孵育15 min，甩去血清，每个组织滴加100 μL一抗（1∶100），37 ℃孵育2 h，1×PBS清洗2次，3 min/次。滴加100 μL二抗，37 ℃孵育40 min，1×PBS清洗2次，3 min/次。滴加DAB显色并在显微镜下监控反应时间，随后用蒸馏水冲洗以停止反应。使用苏木素复染30 s，盐酸分化液分化处理，返蓝液返蓝，梯度乙醇（100%、95%、75%）脱水，每梯度5 min，二甲苯透明2次，5 min/次，干燥后用中性树胶进行封片。

1.2.6 统计学方法

使用Graph Pad Prism 10.1软件进行数据统计分析，符合正态分布的计量数据表达为（\overline{x}\pm s），多组间比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用Dunnett-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对POF小鼠卵巢组织病理学的影响

H&E染色结果显示，正常组小鼠卵巢组织中可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡等。与正常组比较，模型组小鼠卵巢组织中观察到多数卵泡出现退化现象，表现为形态不规则，透明带区域出现塌陷，为闭锁卵泡的特征；表明环磷酰胺诱导POF小鼠模型成功。槲皮素组小鼠卵巢中虽然仍可观察到闭锁卵泡，但也可见窦卵泡的出现，卵泡体积较大，且有多层颗粒细胞紧密排列的特点，细胞间形成不规则腔隙，腔隙内充满卵泡液；表明槲皮素能够有效改善POF小鼠的卵泡生长发育。

2.2 对POF小鼠相关激素的影响

与正常组相比，模型组小鼠血清中的FSH水平显著升高（P<0.01），而AMH和E₂水平则显著下降（P<0.01）；与POF的激素水平特征相符。与模型组相比，槲皮素组FSH水平显著下降（P<0.01），同时AMH及E₂水平显著升高（P<0.01），如图2所示；这一结果表明槲皮素能够有效调节POF小鼠的性激素水平。

2.3 对POF小鼠生化指标的影响

与正常组相比，模型组小鼠CAT和T-SOD活性明显降低（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，槲皮素组CAT和T-SOD活性明显升高（P<0.01，P<0.01），见图3；以上结果表明槲皮素能够有效改善POF小鼠体内脂质过氧化情况。

2.4 对POF小鼠卵巢相关基因的影响

与正常组相比，模型组小鼠SLC7A11和GPX4基因的相对表达量明显降低（P<0.05，P<0.05），ACSL4基因的相对表达量明显升高（P<0.01）；与模型组相比，槲皮素组小鼠SLC7A11基因的相对表达量升高，统计学无差异（P=0.060 2），GPX4表达量明显升高（P<0.05），ACSL4基因的相对表达量明显降低（P<0.05），见图4。

2.5 对POF小鼠卵巢相关蛋白的影响

IHC结果如图5，IHC染色组织中SLC7A11、GPX4、ACSL4阳性信号呈现为黄棕色。对比正常组，模型组小鼠卵巢组织SLC7A11、GPX4蛋白的表达量显著减少（P<0.05），而ACSL4蛋白的表达显著增多；相对于模型组，槲皮素组小鼠的卵巢组织SLC7A11、GPX4蛋白的表达明显增强（P<0.05），ACSL4蛋白表达则明显减弱（P<0.05）。

3 讨论

POF是一种伴随FSH水平升高和E₂水平下降的生殖内分泌疾病，影响至少1%的育龄期妇女罹患不孕症，且逐渐向年轻化发展。除不孕问题外，POF还会对女性的生理及心理健康产生诸多影响，包括月经紊乱、性欲减退、阴道干涩、潮热多汗、骨质疏松及焦虑、抑郁等，从而显著降低患者的生活质量^{［12，13］}。可见，POF带来的一系列问题不容忽视。

槲皮素作为一种天然黄酮类物质，存在于如苹果、西红柿、银杏叶、山楂叶等多种食物及药物中，具有良好的抗炎、抗氧化及免疫调节等多种药理作用^［14］。AMH是由窦前卵泡及小卵泡分泌的一类激素，有助于卵泡的发育成熟及排卵，临床上用于预测卵巢储备功能，评估女性的生育潜力^{［15，16］}。FSH是由垂体前叶分泌的促性腺激素，能够促进卵泡成熟及E₂的产生，而E₂的负反馈调节也会影响FSH的分泌^［17］。在POF中，以上激素通常作为卵巢功能的判断指标。当FSH水平降低且E₂水平升高时，能够有效改善患者的围绝经期症状，是POF改善的标志之一^{［18，19］}。黄长盛^［20］等研究显示，槲皮素能够有效提高POF大鼠的E₂水平，降低FSH水平。本研究通过环磷酰胺诱导POF小鼠模型，同时给予槲皮素进行干预，证实槲皮素可以显著改善POF小鼠的性激素水平，改善卵巢病理形态，减少卵泡的提前闭锁，与之前的研究结果一致。

铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式，其核心机制在于谷胱甘肽的耗竭及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）活性下降，导致脂质过氧化产物如丙二醛（MDA）等代谢障碍逐步积累，导致细胞死亡^［21］。超氧化物歧化酶（SOD）是一种有效的抗氧化酶，可以将有毒的超氧化物转化为毒性较小的H₂O₂，随后过氧化氢酶（CAT）再将其还原成水^［22］。在本研究中，模型组小鼠SOD和CAT活力下降，经槲皮素干预后，SOD和CAT活力显著升高，证实了槲皮素能够减轻脂质过氧化并提升抗氧化能力。SLC7A11/GPX4是铁死亡的核心信号通路，主要通过抗氧化作用发挥作用，SLC7A11负责编码铁转运蛋白，能够增强还原型谷胱甘肽合成，它与GPX4共同作用，催化脂质过氧化物的分解过程，有效防止过氧化物的过量积累，进而抑制铁死亡的发生^［23］。ACSL4是一种长链脂肪酰基辅酶A合成酶，通过促进不饱和脂肪酸向脂酰辅酶A转化，增进体内脂质过氧化物的生成促进铁死亡，是铁死亡活动的重要标志^［24］。在本研究中，观察到模型组小鼠卵巢SLC7A11和GPX4表达水平显著下降，ACSL4表达水平显著上升，提示模型组小鼠的铁死亡活动增加；槲皮素干预后，小鼠卵巢中的SLC7A11和GPX4表达有所增加，而ACSL4表达水平下降；这表明槲皮素具备通过抑制铁死亡过程促进POF小鼠的卵巢功能恢复及调节性激素水平的潜力。

由此可见，槲皮素改善POF小鼠的卵巢功能和性激素水平可能是通过激活SLC7A11/GPX4/ACSL4通路，抑制铁死亡的发生来实现的。这一发现表明槲皮素可能是改善卵巢功能的有效治疗选择，具有广阔的应用前景。

作者贡献度说明：

麦哲芬设计研究方案，进行分子实验，对数据进行整理、统计及分析，并撰写文章稿件；张伊参与分子实验及数据的收集工作；刘杨萍负责文章质量控制；韩霞提出研究思路，全面负责文章整体规划并进行项目的监督与管理。

所有作者声明不存在任何利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学青年基金资助项目(82205159)

广东省中医药局面上项目(20212203)

深圳市自然科学基金面上项目(JCYJ20230807120506014)

深圳市自然科学基金面上项目(JCYJ20210319124337003)

深圳市福田区卫生公益科研项目(FTWS2021008)