基于PI3K/Akt、NF‑κB 信号通路探究黄精多糖对前列腺癌PC‑3细胞裸鼠模型作用的研究

Study on the effect of polygonatum Sibiricum polysaccharides on nude mice model of prostate cancer PC‑3 cells based on PI3K/Akt and NF‑κB signaling pathways

摘要

目的 探讨黄精多糖（polygonatum sibiricum polysaccharides，PSP）对裸鼠前列腺癌PC‑3细胞移植瘤生长及磷脂酰肌醇‑3‑羟激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和核因子κB（NF‑κB）信号通路中关键蛋白的影响。 方法 选择雄激素非依赖型前列腺癌PC‑3细胞株接种于BALB/c裸鼠皮下组织，构建模型，并分为5组，每组6只，然后根据人与裸鼠体表面积换算给药量。对照组予生理盐水，环磷酰胺组（CTX）予30 mg·kg^-1·d^-1，PSP组分为低剂量组100 mg·kg^-1·d^-1、中剂量组200 mg·kg^-1·d^-1、高剂量组400 mg·kg^-1·d^-1，0.2 mL灌胃/次/只，隔天1次，持续30 d。每3 d测量记录一次裸鼠体重和瘤体积，分析PSP对移植瘤的生长情况、大小及裸鼠生长状态的影响。以末次给药4 h后的瘤体积计算抑瘤率，使用原位末端标记法（TUNEL）和流式细胞术观测瘤细胞凋亡情况，细胞增殖试剂盒‑8（CCK8）检测脾细胞增殖活力，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测自然杀伤（NK）细胞活性，酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清肿瘤坏死因子α和白细胞介素‑2、‑6（TNF‑α、IL‑2 、IL‑6）的水平，免疫组织化学（IHC）法分析裸鼠移植瘤组织中PI3K、Akt、NF‑κB P65蛋白及磷酸化（p‑PI3K、p‑Akt、NF‑κB p‑P65）蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶‑3（Caspase‑3）的表达。 结果 模型建立初期，各组裸鼠精神状态良好，活动自如且频繁，进食稳定，对外界刺激反应灵敏，但随着瘤体生长均出现活动度、进食、反应减少等改变。与对照组相比，CTX组和PSP组裸鼠抑瘤率，流式细胞术中瘤细胞凋亡率，IHC中Caspase‑3水平均升高（P<0.05或P<0.001）；CTX组和中、高剂量组Tunel中瘤细胞凋亡率，中、高剂量组LDH中NK细胞活力、ELISA中IL‑6水平，高剂量组CCK8中脾细胞活力，PSP组TNF‑α、IL‑2水平均升高（P<0.05）；CTX组和PSP组瘤体积和IHC中p‑P65水平，CTX组ELISA中TNF‑α、IL‑2水平和IHC中p‑PI3K、p‑Akt水平，中、高剂量组IHC中p‑PI3K、p‑Akt水平均降低（P<0.05）。与CTX组相比，PSP组裸鼠瘤体积，LDH法中NK细胞活力，ELISA中TNF‑α、IL‑2水平和IHC中p‑P65水平均升高（P<0.05）；中、高剂量组CCK8中脾细胞活力、ELISA中IL‑6水平，低剂量组IHC中p‑PI3K、p‑Akt水平均升高（P<0.05）；PSP组抑瘤率和Tunel中瘤细胞凋亡率，低、中剂量组IHC中Caspase‑3表达均降低（P<0.01或P<0.001）。与低剂量组相比，中、高剂量组裸鼠抑瘤率，Tunel和流式细胞术中瘤细胞凋亡率，ELISA中TNF‑α、IL‑2、IL‑6水平，IHC中Caspase‑3表达均升高（P<0.05）；中、高剂量组瘤体积和IHC中p‑PI3K、p‑Akt水平，高剂量组p‑P65水平均降低（P<0.05或P<0.001）。与中剂量组比较，高剂量组裸鼠抑瘤率，Tunel和流式细胞术中瘤细胞凋亡率，ELISA中TNF‑α、IL‑2、IL‑6水平，IHC中Caspase‑3水平均升高（P<0.05）；高剂量组瘤体积，IHC中p‑PI3K、p‑Akt、p‑P65水平均降低（P<0.05）。 结论 PSP可抑制荷瘤裸鼠PC‑3细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过降低PI3K、Akt、P65蛋白的活化水平抑制PI3K/Akt、NF‑κB信号通路的激活以及促进凋亡因子Caspase‑3的表达实现的，同时可能与其调节免疫细胞的活性和血清细胞因子TNF‑α、IL‑2、IL‑6的水平有关。

Abstract

Objective To investigate the impacts of Polygonatum sibiricum polysaccharides （PSP） on the growth of PC‑3 cell transplanted tumors in nude mice and key proteins in the phosphatidylinositol‑3‑hydroxy kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） and nuclear factor‑κB （NF‑κB） signaling pathways. Methods PC‑3 androgen‑independent prostate cancer cell line was selected and inoculated into the subcutaneous tissue of BALB/c nude mice to establish a model. The mice were divided into 5 groups， with 6 mice in each group， and the drug dosage was adjusted based on the conversion of body surface area between humans and nude mice. The control group was given physiological saline， cyclophosphamide （CTX） group was given 30 mg·kg^-1·d^-1， low‑dose group was given PSP at 100 mg·kg^-1·d^-1， medium‑dose group was given PSP at 200 mg·kg^-1·d^-1， high‑dose group was given PSP at 400 mg·kg^-1·d^-1. Each nude mouse was administered 0.2 mL by gavage every other day for 30 days. Every three days， the body weight and tumor volume of the nude mice were recorded to analyze the effect of PSP on the growth and size of the transplanted tumors. Tumor volume was measured 4 hours after the last drug administration to calculate the tumor inhibition rate （TIR）. Observation of cell apoptosis in tumor tissue using TdT‑mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and flow cytometry. The proliferation activity of spleen cells was detected by Cell Counting Kit‑8 （CCK8）. The activity of natural killer cells （NKc） was detected by lactate dehydrogenase （LDH） release assay. Using enzyme‑linked immunosorbent assay （ELISA） to detect the levels of tumor necrosis factor‑α， interleukin‑2， and interleukin‑6 （TNF‑α， IL‑2， IL‑6）. Immunohistochemistry （IHC） was performed to analyze the expression of PI3K， Akt， NF‑κB P65， and phosphorylated protein （p‑PI3K， p‑Akt， NF‑κB p‑P65） and caspase‑3 in the transplanted tumor tissues of nude mice. Results In the early stage of model establishment， nude mice were in good spirits， with free and frequent movement， stable food intake， and sensitive responses to external stimuli. However， with the growth of the tumor， all nude mice showed poor mental state， reduced activity and diet. Compared to the control group， TIR， apoptosis rate of PC‑3 cells （ARoPc） in flow cytometry， and caspase‑3 expression （IHC） increased in the CTX and PSP groups （P<0.05， P<0.001）. ARoPc in TUNEL （CTX group）， NK cell vitality （LDH）， IL‑6 levels （ELISA） in medium‑ and high‑dose PSP groups， spleen cell proliferation （CCK8） in high‑dose PSP， and TNF‑α and IL‑2 levels in PSP groups were also increased （P<0.05）. Tumor volume and p‑P65 （IHC） in CTX and PSP groups， along with TNF‑α and IL‑2 levels （ELISA）， p‑PI3K， and p‑Akt （IHC） in CTX， and p‑PI3K and p‑Akt （IHC） in medium‑ and high‑dose PSP groups decreased （P<0.05）. Compared to the CTX group， the PSP group showed increased tumor volume， NKc vitality （LDH）， TNF‑α， IL‑2 levels （ELISA）， and p‑P65 （IHC） （P<0.05）. Spleen cell vitality （CCK8） and IL‑6 levels （ELISA） in medium‑ and high‑dose groups， as well as p‑PI3K and p‑Akt levels （IHC） in the low‑dose PSP group， were also increased （P<0.05）. Tumor IR and ARoPc （TUNEL， flow cytometry） in the PSP group， along with caspase‑3 levels （IHC） in low‑ and medium‑dose groups， were decreased （P<0.01， P<0.001）. In medium‑ and high‑dose PSP groups， tumor IR， ARoPc （TUNEL， flow cytometry）， TNF‑α， IL‑2， IL‑6 levels （ELISA）， and caspase‑3 levels （IHC） increased compared to the low‑dose group （P<0.05）， while tumor volume， p‑PI3K， p‑Akt （IHC） in these groups， and p‑P65 （high‑dose） were decreased （P<0.05， P<0.001）. The high‑dose group showed increased tumor IR， ARoPc （TUNEL， flow cytometry）， TNF‑α， IL‑2， IL‑6 levels （ELISA）， and caspase‑3 levels （IHC） compared to the medium‑dose group （P<0.05）， with reductions in tumor volume and p‑PI3K， p‑Akt， and p‑P65 levels （IHC） （P<0.05）. Conclusion PSP can inhibit the proliferation of PC‑3 cells and induce their apoptosis. The mechanism may be related to inhibiting the PI3K/Akt and NF‑κB signaling pathways by reducing the activation of PI3K， Akt， and P65 proteins， and promoting the expression of Caspase‑3. It may be also related to regulating the activity of immune cells， and levels of TNF‑α， IL‑2， and IL‑6.

Graphical abstract

关键词

黄精多糖 / PC‑3细胞 / 裸鼠 / PI3K/Akt / NF‑κB P65

Key words

Polygonatum sibiricum polysaccharides / PC‑3 cells / Nude mice / PI3K/Akt / NF‑κB P65

前列腺癌好发于前列腺上皮组织，是中老年男性泌尿系统常见肿瘤，也是男性常见的恶性肿瘤是引起男性死亡的重要原因之一^［1］。近年前列腺癌发病率高速增长，在世界男性癌症中发病率高居第2位^［2］。由于社会人口的老龄化及饮食结构的快速转变等原因，国内前列腺癌发病率正在上升^［3］。前列腺癌的治疗主要包括内分泌治疗、手术治疗、放化疗等。尽管早期抗雄激素治疗有效，但经过18~24个月的去势治疗，前列腺癌易发展成为去势抵抗性前列腺癌 ，并易出现肿瘤转移而导致治疗失败^［4］。

为了寻找更有效的治疗手段，中医与西医结合治疗的讨论与研究日益增多，这对改善前列腺患者的生活质量具有重要意义^［5］。黄精属于滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎，能够健脾润肺、补气养阴等，其丰富的生物活性归因于中药多糖、生物碱、黄酮、类固醇皂苷、木质素和氨基酸等多种成分的存在^［6］。现有研究表明，作为黄精主要成分之一的黄精多糖（PSP）具有多种效应，如抗糖尿病损伤、改善肾病肾功能损害、保护骨质流失和抗癌活性^［7］。在前列腺癌领域，有研究发现PSP能够抑制前列腺癌相关成纤维细胞的增殖，具有抗前列腺癌活性^［8］。然而，由于PSP与前列腺癌相关的研究较少，其作用机制尚不清晰，因此本研究开展了针对PC‑3细胞裸鼠移植瘤模型的体内实验，旨在为中医药指导临床肿瘤治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

BALB/c雄性裸鼠（nu/nu），无特定病原体（SPF）级，质量（19.03±1.00）g，6周龄，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证编号为SCXK（京）2019‑0010，且已获得实验动物伦理委员会审批通过（伦理编号：HBNU20240622120）。饲养条件为，温度（23±3）℃，相对湿度40%~70%，12 h/12 h光暗交替，自由进食饮水。所有实验步骤均按照本院动物实验指南进行操作。PC‑3细胞株来自北纳创联生物科技有限公司（编号：BNCC360419），在37 ℃、5%CO₂的细胞培养箱中用RPMI‑1640培养基（含10%胎牛血清），稳定培养。

1.2 主要试剂与仪器

PSP来自上海源叶生物科技有限公司（货号S27804）；TNF‑α、IL‑2、IL‑6 ELISA试剂盒（批号SEKM‑0034、SEKM‑0004、SEKM‑0007）、LDH检测试剂盒（批号BC0680）来自北京Solarbio公司；CCK8检测试剂盒来自MCE公司（批号HY‑K0301）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒来自北京兰杰柯科技有限公司（批号BL644C）；DAB显色试剂盒来自BOSTER公司（批号AR1027）。一抗PI3K、p‑PI3K、Akt、p‑Akt、NF‑κB p65、NF‑κB p‑p65、Caspase‑3来自江苏Affinity Biosciences公司（批号AF6241、AF3241、AF6261、AF0016、AF5006、AF2006、AF6311）；二抗辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔、山羊抗鼠 IgG来自Abcam公司（批号ab6721、ab6789）。

台式麻醉机（货号723011），香港友诚生物科技有限公司；流式细胞仪（型号BeamCyte‑1026），常州必达科生物科技有限公司；倒置荧光显微镜（型号Ts2‑FL），北京恒三江仪器销售有限公司；酶标仪（型号RT‑6100），深圳雷杜生命科学股份有限公司；荧光及化学发光成像系统（ChemiScope 6200），上海勤翔科学仪器有限公司；生物组织冰冻切片机、包埋机（KD‑2950、KD‑BLⅢ），浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。

1.3 前列腺癌荷瘤裸鼠模型的构建及分组

0.2 mL PC‑3细胞悬液（1×10⁷个/mL）接种于BALB/c裸鼠右前肢外侧皮下后饲养3周，瘤体直径达3~5 mm，说明构建模型成功。接种细胞期间每天观察并记录移植瘤的大小以及接种部位有无病理改变，还有裸鼠是否出现食欲、活动、反应减少等生理变化。

根据人与裸鼠体表面积换算各组给药量后，将模型裸鼠随机分为5组、每组6只：对照组予生理盐水，CTX组予环磷酰胺30 mg·kg^-1·d^-1，PSP组分为低剂量组100 mg·kg^-1·d^-1、中剂量组200 mg·kg^-1·d^-1、高剂量组400 mg·kg^-1·d^-1，每次给予0.2 mL灌胃，隔天上午9∶00给药1次，持续30 d。药物干预后，每隔3 d测量1次裸鼠体重和移植瘤的长短径［瘤体积=（长径×短径²）/2］，并绘制时间与体重及肿瘤体积的变化曲线。观察裸鼠有无食欲、活动、反应减少等变化。最后一次灌胃4 h后，采集裸鼠心脏血，分离裸鼠脾脏并剥取瘤体进行后续实验，并计算抑瘤率（%）=（1-给药组平均瘤体积/对照组平均瘤体积）×100%。完成相应实验后，颈椎脱臼法快速处死裸鼠。

1.4 Tunel法和流式细胞术检测PC‑3细胞移植瘤组织中的细胞凋亡情况

根据Tunel法凋亡检测试剂盒说明书进行操作，制备并处理切片，Tunel标记后使用进行复染，在荧光显微镜下观察样本细胞凋亡情况并进行拍照，并使用ImageJ 1.8.0软件分析图像。收集并清洗处理后的细胞，进行Annexin V‑FITC和PE双染，最后将处理好的细胞样本置于流式细胞仪中，通过激光激发荧光染料并捕获荧光信号，进而分析细胞凋亡早期和晚期的分布情况。

1.5 CCK8法检测荷瘤裸鼠脾细胞的增殖活性

在黄精多糖干预周期结束后，取荷瘤裸鼠的新鲜脾脏，经过消化、过滤和裂解，然后重悬成单细胞悬液（5×10⁵个/mL）。以每孔100 μL悬液接种于96孔板中，设3个复孔，常规条件下培养24 h，然后以10 μL/孔滴加CCK8试剂培养1 h。450 nm处酶标仪检测OD值，细胞增殖率（%）=（实验值-空白值）/（对照值-空白值）×100%。

1.6 LDH释放法检测荷瘤裸鼠脾脏自然杀伤细胞（NK）活性

常规方法分离每组裸鼠脾细胞制备效应细胞（2×10⁷个/mL），在37 ℃、5%CO₂条件下，于U型96孔板中与靶细胞（4×10⁵个/mL）进行共培养（效应细胞∶靶细胞=50∶1）4 h后，1 500 r/min离心5 min，取上清，然后按LDH试剂盒要求进行操作。绘制标准曲线，并根据各组裸鼠的OD值和标准曲线得到LDH 的浓度，然后计算出LDH活力。LDH（U/10⁴cells）=0.133×LDH（μmol/mL）。

1.7 ELISA法检测血清细胞因子TNF‑α、IL‑6、IL‑2水平

收集各组裸鼠的心脏血，离心取血清备用。操作均按TNF‑α、IL‑2、IL‑6 ELISA试剂盒的说明书进行，并以标准品的浓度与吸光度值绘制标准曲线。根据标准曲线和各组裸鼠血清TNF‑α、IL‑6、IL‑2对应的吸光度值，计算得出TNF‑α、IL‑6、IL‑2的表达水平。

1.8 IHC检测PI3K/Akt、NF‑κB信号通路相关蛋白的表达

具体操作步骤均按照说明书执行。取裸鼠肿瘤组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋并完成石蜡切片，然后进行脱蜡、梯度酒精水化、冲洗并置于PBS缓冲液中。根据抗体说明书完成抗原修复后，加入适量过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min后PBS冲洗。滴加一抗，4 ℃过夜，滴加反应增强液室温孵育20 min，滴加二抗室温孵育20 min。DAB（1∶20）显色5 min后显微镜观察，苏木素复染3 min。染色完成后，梯度酒精脱水、透明、封片，并在显微镜下观察拍照。对图像结果使用ImageJ 1.8.0软件进行分析。

1.9 统计学处理

使用SPSS25.0统计软件处理结果。符合正态分布的计量资料表示为均数±标准差（\overline{x}\pm s），方差齐时用单因素方差分析，多组间两两比较用LSD法；方差不齐时采用Dunnett's 检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠生长状态和移植瘤瘤重体积的变化情况

在荷瘤模型构建的初期阶段，各组裸鼠展现出相对良好的精神状态，活动自如且频繁，进食情况稳定，对外界刺激的反应亦保持在较为灵敏的水平，整体生理状态尚属可接受范围，但随着瘤体的生长均出现食欲、活动度和反应减少等现象。给予黄精多糖干预后裸鼠的基本情况得到改善。构建模型时，各组裸鼠体重及移植瘤体积均随着时间的延长呈上升趋势（P<0.05），而同一时间点下的裸鼠体重和瘤体积差异没有统计学意义。接种细胞21 d后，移植瘤直径达到3~5 mm，裸鼠模型构建成功。按照分组给予药物干预后，各组裸鼠体重在初期均有略微的增加，随后趋向于稳定，而同一时间下的各组裸鼠体重没有显著性差异（图1A）。给予药物处理后的各组裸鼠移植瘤体积均随着时间的延长而增加（P<0.05），而在同一时间点下裸鼠移植瘤体积在不同剂量黄精多糖作用下开始出现显著性差异（图1B）。末次给药4 h后，CTX组和PSP组较对照组的抑瘤率分别为（44.00±3.37）%、（16.26±2.65）%、（24.58±3.50）%、（34.82±2.73）%（图1C），CTX组显著高于PSP组，且PSP组抑瘤率随着药物剂量的增加而升高（P<0.001）。PSP显著抑制了PC‑3细胞的增殖，并表现出显著的时间‑剂量依赖性。见图1。

2.2 PC‑3细胞在各组荷瘤裸鼠体内的凋亡情况

TUNEL检测结果显示（图 2），与对照组相比，低剂量组瘤细胞凋亡率没有显著性变化，而 CTX组和中、高剂量组癌细胞凋亡率增高（P<0.01）；与CTX组比较，PSP组瘤细胞凋亡率均降低（P<0.001）。流式细胞术检测显示（图3），与对照组相比，CTX组和PSP组裸鼠瘤细胞凋亡率均显著增加（P<0.001）；与CTX组比较，PSP组瘤细胞凋亡率均降低（P<0.001）；移植瘤细胞晚期凋亡率显著高于同组早期凋亡率（P<0.05）。在TUNEL和流式细胞术结果中，裸鼠PC‑3细胞凋亡率在中剂量组均高于低剂量组，在高剂量组均高于中剂量组，呈现出显著的剂量依赖性（P<0.05）。见图2、3。

2.3 黄精多糖对裸鼠脾细胞和NK细胞活性水平的影响

脾细胞在肿瘤免疫中有着重要作用。CCK8检测结果显示（表1），与对照组相比，仅有PSP高剂量组裸鼠脾细胞活力增加（P<0.05），其余各组均没有显著性差异；与CTX组相比，PSP中、高剂量组脾细胞活力增加（P<0.05）；在PSP低、中、高剂量组之间差异没有统计学意义（P>0.05）。LDH活力反映了裸鼠体内NK细胞的活性水平，LDH浓度与吸光度值对应的标准曲线y=0.240 5x+0.003 9（R²=0.998 9）。结果显示，与对照组相比，CTX组和低剂量组裸鼠NK细胞活性水平没有显著性变化，而中、高剂量组裸鼠NK细胞活性水平升高（P<0.05）；与CTX组相比，PSP组裸鼠NK细胞活性均增加（P<0.05）。NK细胞活性水平在低、中、高剂量组裸鼠之间差异没有统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.4 黄精多糖对裸鼠血清TNF‑α、IL‑2、IL‑6水平的影响

ELISA法检测裸鼠血清 TNF‑α、IL‑2、IL‑6水平的结果显示，与对照组相比， CTX组裸鼠TNF‑α、IL‑2水平降低，PSP组裸鼠TNF‑α、IL‑2水平升高（P<0.001）； CTX组和低剂量组裸鼠IL‑6水平没有显著性变化，中、高剂量组裸鼠IL‑6水平升高（P<0.001）。与CTX组比较，PSP组裸鼠TNF‑α、IL‑2水平升高（P<0.001）；低剂量组IL‑6水平没有显著性变化，中、高剂量组IL‑6水平升高（P<0.001）。裸鼠血清TNF‑α、IL‑2、IL‑6水平在中剂量组均高于低剂量组，在高剂量组均高于中剂量组，具有显著的剂量依赖性（P<0.01）。见表2。

2.5 黄精多糖对裸鼠瘤组织中相关蛋白表达水平的影响

移植瘤组织的免疫组化结果显示，与对照组比较，PI3K、Akt、P65蛋白水平表达差异均没有统计学意义，CTX组和中、高剂量组p‑PI3K 、p‑Akt表达水平降低，CTX组和PSP组p‑P65表达水平降低，CTX组和PSP组Caspase‑3表达水平升高（P<0.01）。与CTX组相比，低、高剂量组PI3K水平，中、高剂量组Akt水平，低剂量组p‑PI3K 、p‑Akt水平，PSP组p‑P65水平表达均升高（P<0.05）；低、中剂量组Caspase‑3表达水平降低（P<0.05）。p‑PI3K 、p‑Akt表达水平在中剂量组均低于低剂量组，在高剂量组均低于中剂量组；p‑P65表达水平在高剂量组低于低、中剂量组；Caspase‑3表达水平在中剂量组高于低剂量组，在高剂量组高于中剂量组，存在明显的剂量依赖性（P<0.05）。见表3、图4。

3 讨论

前列腺癌患者会出现尿频、尿急、排尿困难和尿血等症状，并且随着病情进展至晚期，可能会形成转移瘤，严重威胁男性的生理、心理和生命健康。世界卫生组织国际癌症研究组织的调查结果显示，当发生转移后前列腺癌患者的五年生存率会从95%降至34%，严重影响患者预后^［9］。肿瘤的异质性和获得性耐药给传统的内分泌治疗和化疗带来了许多局限，而随着前列腺癌基础研究和基因检测技术的发展，更多可识别和治疗的靶点得以揭示，转移性前列腺癌的精准治疗有了重大进展^［10］。多项研究表明，有些中药能抑制肿瘤细胞的生长，从而发挥抗癌效果^［11］。中药的活性成分涵盖多糖类、黄酮类、萜类、酚类化合物以及生物碱等^{［12‑15］}。研究证明，天然多糖可以通过提高多种细胞因子活性和增强免疫系统的反应性以及调控多条信号通路发挥抗肿瘤作用，如枸杞多糖、红花多糖、灵芝多糖、黄芪多糖等^{［16‑19］}。现代药理学研究证明，PSP具有抗癌、抗炎、抗菌抗病毒、免疫调节、抗氧化抗衰老等多种作用^［20］。

本课题组此前的体外实验结果显示，PSP能抑制PC‑3细胞增殖和促进其凋亡，还显著抑制了细胞S期阻滞。进一步分析结果发现，PSP还可以下调p‑Akt、p‑PI3K、p‑P65以及周期蛋白的表达水平，同时提升Caspase‑3蛋白的活性。由此体外实验结果表明，PSP可能是通过调控PI3K/Akt信号通路及NF‑κB信号通路发挥抗前列腺癌的作用，这为本实验提供了强有力的证据。本研究则是从体内实验的角度出发，首先建立前列腺癌PC‑3细胞荷瘤裸鼠模型，随后进行药物干预，从而研究PSP对荷瘤裸鼠肿瘤细胞增殖及凋亡、免疫细胞活性、血清因子含量、相关通路蛋白表达水平等的影响，最后得出一系列与前期实验基本一致的成果。

本研究通过在BALB/c裸鼠皮下组织接种PC‑3细胞构建前列腺癌模型，各组裸鼠瘤体积均随着时间的延长而增加且三周后瘤体直径达到了3~5 mm，说明前列腺癌模型构建成功。在不同剂量PSP干预后裸鼠瘤体积显著降低，瘤细胞凋亡率显著增加，并存在剂量依赖性，表明PSP可抑制PC‑3细胞增殖和促进瘤细胞凋亡，而CTX对瘤细胞的抑制增殖和促进凋亡作用比PSP更强。免疫细胞和细胞因子是体内免疫反应的重要成分，也是肿瘤免疫中发挥抗肿瘤作用的重要参与者^［21］。中药多糖则可以通过提高机体内免疫细胞反应性和细胞因子水平来发挥抗肿瘤作用^［22］。研究结果显示，PSP可提高裸鼠血清中TNF‑α、IL‑2、IL‑6的含量，并存在显著的剂量依赖性，且较高剂量的PSP可以促进裸鼠脾细胞和NK细胞的活性，这表明了PSP具有良好的促免疫作用。PSP通过增强机体的免疫活性，有效抑制PC‑3细胞的增殖并促进凋亡发生，进而改善裸鼠的生长状态，提示PSP可能具有作为抗前列腺癌药物的潜在应用价值。

肿瘤细胞的形成与发展是一个涉及多条通路的复杂过程。PI3K/Akt信号通路在前列腺癌发生、发展中举足轻重，该磷酸化级联信号介导的下游分子激活对前列腺癌各个表型均具有显著影响^［23］。 此外，PI3K/Akt信号通路在大多数去势抵抗性前列腺癌中被激活^［24］。PI3K/Akt信号通路的异常激活，会引起肿瘤细胞过度的生长和增殖，因此该通路成为了癌症治疗的重要靶点^{［25，26］}。NF‑κB通路在促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡的研究中探讨较多^［27］，而其表达产物几乎覆盖生物全过程，如免疫、炎症血管生成、细胞的增殖和凋亡等^{［28，29］}。NF‑κB通路的异常活动在肿瘤的发展和转移中起着重要作用，并有研究表明该通路的活化与前列腺癌的发生、发展有着密切关系^［30］。P65蛋白是NF‑κB通路的一个重要成员，其磷酸化状态能够激活NF‑κB并增强转录调控功能^［31］。因此，NF‑κB通路也是治疗肿瘤的重要靶点。PSP可调控PI3K/Akt/mTOR、TLR4/NF‑κB信号通路，还可以调节肿瘤细胞凋亡相关蛋白的表达，通过抑制肿瘤细胞增殖和转移，促进细胞凋亡和自噬，抑制肿瘤细胞血管形成和调节机体的免疫功能等达到抗肿瘤的目的^［32］。本实验中，不同剂量PSP治疗后裸鼠p‑PI3K、p‑Akt、p‑P65表达量显著降低，而PI3K、Akt、P65表达量则没有明显变化，提示PSP对前列腺癌PC‑3细胞的调节作用可能与抑制PI3K/Akt、NF‑κB信号通路的激活有关。同时，Caspase‑3表达量的增加表明PSP对裸鼠模型PC‑3细胞具有促凋亡作用。

综上，经PSP干预后，裸鼠PC‑3细胞中p‑Akt、p‑PI3K、p‑P65蛋白表达降低，Caspase‑3蛋白表达明显增加，推测PSP可能通过抑制PI3K、Akt、P65蛋白的活化抑制PI3K/Akt、NF‑κB信号通路的激活以及通过促进Caspase‑3的表达，从而抑制PC‑3细胞增殖并因此抑制其迁移和侵袭性，以促进PC‑3细胞凋亡。同时，PSP具有良好的促免疫作用，其可能通过提高NK细胞的活性以及血清中的TNF‑α、IL‑2、IL‑6水平，进而抑制PC‑3细胞的增殖、迁移和侵袭，提示PSP可能具有良好的抗前列腺癌活性。然而，PSP的抑癌机制非常复杂，本研究只是对一些关键机制进行了探讨，且样本量不大，因此还需更深及大样本的多方实验进行研究。

作者贡献度说明：

赵国斌：项目负责人、研究选题和论文修改；杨帅博：实验研究、数据处理、论文写作和投稿；唐玉红、周艳、赵欣阳、刘鑫、李晨、王新梅：收集数据与实验研究；董少文：收集数据与论文写作；曾鑫、刘晨曦：负责文献检索。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

河北省自然科学基金资助项目(H2021405012)