高压氧暴露调控HIF‑1α对胶原诱导型关节炎小鼠骨破坏的机制研究

Effects of hyperbaric oxygen exposure regulating HIF‑1α expression on bone destruction in mice with collagen‑induced rheumatoid arthritis

摘要

目的 探讨高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）暴露调控缺氧诱导因1α （hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）对Ⅱ型胶原诱导关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型小鼠骨形态学影响的机制。 方法 将40只DBA/1雄性小鼠随机分为正常（NOR）组、模型（CIA）组、低剂量HBO（HBO-L）组、高剂量HBO（HBO-H）组，每组10只。除NOR组外，其余3组小鼠采用二次免疫法进行双后足掌+尾根部皮内注射Ⅱ型胶原-弗氏完全佐剂法诱导建立CIA模型，加强免疫时间间隔7 d。二次免疫后，HBO-L组暴露2.2ATA绝对大气压（atmospheric absolute，ATA）HBO×7 d（qd）；HBO-H组暴露2.2 ATA HBO×14 d（qd），NOR组、CIA组予常压空气。采用关节炎指数（AI）评分评估小鼠关节炎症程度；使用qRT-PCR检测关节组织中HIF-1α、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）mRNA表达量；使用蛋白印迹（Western blot，WB）、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）实验检测关节组织中HIF-1α蛋白表达情况；采用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin，H&E）法观察小鼠关节组织病理变化、统计病理评分；进行各组差异比较。 结果 与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组小鼠关节肿胀程度及AI评分，于第11天起开始逐渐降低，差异均有统计学意义（P<0.01）；与HBO-L组比较，HBO-H组小鼠关节肿胀程度及AI评分，于第15天起开始呈降低趋势，差异均有统计学意义（P<0.05），于第21天降低最为明显，差异均有统计学意义（P<0.001）；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织IL‑1、IL‑6、TNF‑α、HIF‑1α mRNA表达量分别逐渐降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织IL‑1、IL‑6、TNF‑α、HIF‑1α mRNA表达量呈降低趋势，差异均有统计学意义（P<0.01）；与CIA组比较，WB、IHC检测均显示HBO-L组和HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量分别逐渐降低，差异均有统计学意义（P<0.001）；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量呈降低趋势，差异均有统计学意义（P<0.001）；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节病理评分逐渐降低，且差异均有统计学意义（P<0.001）；与HBO-L组比较，HBO-H组关节病理评分呈降低趋势，且差异均有统计学意义（P<0.001）；H&E染色病理显示HBO改善炎性细胞浸润，减轻血管增生，HBO-H组疗效更佳。 结论 HBO暴露能够通过改善关节缺氧环境，显著减轻CIA模型小鼠关节肿胀，抑制关节炎症，其作用机制可能与下调HIF-1α信号通路有关，疗效存在一定的时间依赖性可能。

Abstract

Objective To explore the mechanism of hyperbaric oxygen （HBO） exposure in regulating hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） expression that affects bone morphology in mice with type Ⅱ collagen-induced arthritis （CIA）. Methods A total of 40 male mice of DBA/1 were randomly divided into the normal group （NOR）， the model group （CIA）， the low-dose hyperbaric oxygen treatment group （HBO-L）， and the high-dose hyperbaric oxygen treatment group （HBO-H）， with 10 mice in each group. Except for the NOR group， mice of the other three groups were all treated with 2 immunizations of intradermal injection of type Ⅱ collagen-complete Freund's into the double hind paws and tail root to build the CIA model. The immunization was strengthen at 7 d interval. The mice in the HBO-L group and HBO-H groups were respectively exposed to 2.2 atmospheric absolute （ATA） pressure once a day for 7 d and once a day for 14 d after the second immunization was finished. The mice in the NOR group and the CIA group were all exposed to ordinary pressure air. Arthritis index （AI） was applied to evaluate the swelling degree of arthritis in mice. The level of HIF-1α、interleukin-1 （IL-1）， interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） in the joint were examined by qRT-PCR. The expression of HIF-1α protein was detected by Western blot （WB） and immunohistochemistry （IHC） in the joints. Hematoxylin-eosin （H&E） staining was applied to observe the pathological change of the joints. Pathological scoring of the joint tissue in each group was counted. Statistical data was compared among groups. Results Compared to the CIA group， the degree of joint swelling and AI score in the HBO-L group and HBO-H group began to gradually decrease from the 11th day， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared to the HBO-L group， the degree of joint swelling and AI score in the HBO-H group began to show decreasing trend from the 15th day， and the differences were statistically significant （P<0.05）. AI score decreased most significantly on the 21st day， and the differences were statistically significant （P<0.001）. Compared to the CIA group， the mRNA expression levels of IL‑1， IL‑6， TNF‑α， and HIF‑1α in the joint tissues of the HBO-L group and HBO-H group gradually decreased， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared to the HBO-L group， the mRNA expression levels of IL‑1， IL‑6， TNF‑α， and HIF‑1α in the joint tissues of the HBO-H group showed decreasing trend， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared to the CIA group， the results of WB and IHC detection both showed that the relative expression levels of HIF-1α protein in the joint tissues of the HBO-L group and HBO-H group gradually decreased， and the differences were statistically significant （P<0.001）. Compared to the HBO-L group， the relative expression level of HIF-1α protein in the joint tissues of the HBO-H group showed decreasing trend， and the differences were statistically significant （P<0.001）. Compared to the CIA group， the joint pathological scores of the HBO-L group and the HBO-H group gradually decreased， and the differences were statistically significant （P<0.001）. Compared to the HBO-L group， the joint pathological scores in the HBO-H group showed decreasing trend， and the differences were statistically significant （P<0.001）. H&E staining pathology showed that HBO improved inflammatory cell infiltration and reduced vascular proliferation， and the HBO-H group had better therapeutic effect. Conclusion Hyperbaric oxygen exposure can significantly reduce joint swelling and effectively attenuate the inflammatory in the CIA model by improving joint hypoxia environment. The mechanism may be related to down-regulation of HIF-1α signaling pathway. The curative effect may be time-dependent.

Graphical abstract

关键词

高压氧 / HIF-1α / 胶原诱导型关节炎 / 类风湿关节炎 / 抗炎

Key words

Hyperbaric oxygen / Hypoxia-inducible factor-1α / Collagen-induced rheumatoid arthritis / Rheumatoid arthritis / Anti-inflammatory

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种多个小关节累及的自身免疫性疾病，以手、腕、踝、趾等关节累及最为常见^［1］，临床上RA患者常多个关节肿胀、晨僵、活动障碍、进行性疼痛，甚至关节畸形、功能缺失^［2］。研究显示^［3，4］，RA发病主要原因是关节滑膜炎症反应和异常增生，伴有滑膜微血管的形成。由于免疫机制复杂，RA病因尚未得到彻底研究^［5］。目前治疗侧重于控制炎症、缓解症状^［6］。因此，临床上开发高效、成本低、副作用小、无创、绿色治疗方法具有重要意义。缺氧是RA关节滑膜微环境的主要特征，是一种潜在致病因素，它在促进病理性血管生成，加剧组织炎症以及RA病理生理反应中起重要作用^［7］。研究^［8，9］证实缺氧诱导因子1α （hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）作为对缺氧应答的主要调节因子，是一种异二聚体转录因子复合物，在滑膜缺氧时被激活和过度表达，以调节主要介导炎症、血管生成、血管翳形成和滑膜增生的靶基因的转录。实验^{［10，11］}通过使用化学抑制剂或RNA干扰抑制HIF-1α对RA实验动物具有有效的抑制功能。因此，HIF-1α可被视为开发治疗RA新疗法有希望的靶点^［12］。研究报道高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）暴露可改善缺氧，显著降低HIF-1α表达^［13］。因此本研究拟建立胶原诱导型关节炎（collagen- induced arthritis，CIA）小鼠模型，从调控HIF-1α入手，探讨HBO暴露对模型鼠抗关节炎、免疫调控的可能机制，以期为HBO在早期介入治疗RA提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只DBA/1雄性小鼠8周龄（体质量：18~20 g），均购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2023-0009；实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2020-0028，试验前动物处于SPF级环境饲养（相对湿度60%，24 ℃恒温，12 h/12 h 光/暗交替）、进食、充足食水1周。

1.1.2 实验试剂

免疫源性Ⅱ型胶原（Sigma公司，货号：C7506）；完全弗氏佐剂（Sigma公司，货号：F5881）；不完全弗氏佐剂（Sigma公司，货号：F5506）；HIF-1α（Affinity公司，货号：BF8002）；DEPC处理试剂（Beyotime公司，货号：ST036）；HiScriptⅡQ RT Super Mix for qPCR（Vazyme公司，货号：R222）；2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme公司，货号：Q321）；BCA定量试剂盒（biosharp公司，货号：BL521A）；30%丙烯酰胺（Biosharp公司，货号：BL513B）；PVDF膜（Millipore公司，货号：IPVH00010）。

1.1.3 主要仪器

ZJ-4型IVC笼具系统（苏州冯氏实验动物设备有限公司）；EPS-300稳压稳流电泳仪、EPS-200转膜仪、PowerPac^TMBasic 型电泳仪电源、VE-386型半干转移电泳槽、Tanon 4600全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型垂直电泳槽（美国Bio-rad公司）；Epoch 2型全波长酶标仪（美国Biotek公司）；MICROM-EC350型石蜡包埋机（德国Thermo公司）；RM-2135型轮转切片机（德国Leica公司）；IX73+DP80型荧光倒置显微镜成像系统（日本Olympus公司）；SHC3200/10000-16/4型空气加压氧舱（上海七零一所杨园高压氧舱有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模药物制备

Ⅱ型胶原乳剂：配置0.1 mol/L冰醋酸溶液（114.4 μL冰醋酸+20 mL灭菌注射用水），4 ℃降温1 h；配置2 mg/mL浓度的Ⅱ型胶原溶液，避光过夜；取15 mL冰醋酸溶液+30 mg Ⅱ型胶原溶液。配置模型溶液：初次免疫采用Ⅱ型胶原溶液+CFA（弗氏完全佐剂）；加强免疫采用Ⅱ型胶原溶液+IFA（弗氏不完全佐剂），均按1∶1比例，通过输液器胶管连接的2个注射器在冰浴条件下充分乳化20 min，以造模剂滴在水面不扩散为宜，注意避光，现配现打。

1.2.2 动物分组

建模小鼠适应性饲养1周后，随机分为4组：正常组（Normal，NOR组）、模型组（CIA组）、低剂量HBO组（HBO-L组）、高剂量HBO组（HBO-H组），每组10只。除NOR组，其余3组均采用二次免疫法^［14］构建CIA模型：3组初次免疫时间记录为第0天，于小鼠双后足掌+尾根部皮内注射100 μL初次免疫模型溶液；二次免疫（加强免疫）时间为初次免疫后第7天，在相同部位注射100 μL加强免疫模型溶液；NOR组分别在相同初次免疫、加强免疫时间点、在相同部位、同样方法注射等量0.9% NaCl溶液。

1.2.3 干预方法

HBO治疗全流程：加压阶段：以0.008 Mpa/min升压速率用空气作为加压介质，匀速15 min将舱内压力缓慢升至0.12 Mpa ［2.2 绝对大气压（ATA）］；稳压吸氧阶段：停留在2.2 ATA下，打开Ⅰ级供氧进气阀门，使用医用氧气（氧气纯度≥99.99%，常州双环热工仪表有限公司玻璃转子流量计）以10 000 mL/min的流量对给装有小鼠鼠笼的吸氧头盔持续供氧，吸氧全程氧浓度维持在（87±2）%左右，稳压吸氧60 min；减压阶段：关闭Ⅰ级吸氧进气阀门，以0.005 Mpa/min降压速率匀速25 min将舱内压力缓慢降至1.0 ATA出舱，治疗总时间共100 min，流程图见图1。HBO暴露方案：HBO-L组：2.2 ATA压力，1次/d×7 d，100 min/次；HBO-H组：2.2 ATA压力，1次/d×14 d，100 min/次； 2组分别于加强免疫后当天（初次免疫后第7天）起每日固定时间进行干预；NOR组、CIA组：呼吸1.0 ATA（常压）空气。

1.3 观察内容与指标检测

1.3.1 足趾肿胀度观察

采用关节炎指数（arthritis index，AI）评分标准^［8］，对每只模型4足关节炎的严重程度，进行0~4分等级评分，4足评分之和为每只小鼠AI，最高AI为16分，以AI>4 分为造模成功，见表1。本实验从加强免疫（初次免疫后第7天）开始，每隔2 d观察4组小鼠关节红肿畸形程度并进行AI评分。

1.3.2 各组小鼠mRNA表达水平检测

实验第21天同时处死4组小鼠，使用组织RNA提取试剂盒提取小鼠关节组织中总RNA，用Vazyme-HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR反转录试剂盒和Vazyme 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒逆转录进行白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）及HIF-1α表达水平，使用PCR仪系统进行实时荧光定量PCR，循环45个PCR，使用β‑actin分别作为mRNA对照，所有操作在冰上进行，使用2^{⁃⁃△△CT}计算目的基因相对表达量，所用引物序列见表2。

1.3.3 蛋白印迹（Western blot，WB）检测

关节组织HIF-1α蛋白表达取保存于-80 ℃各组关节组织，分别匀浆后放射免疫沉淀法裂解液（RIPA）冰上裂解细胞提取总蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法测定总蛋白含量，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜、5%脱脂奶粉封闭、加一抗HIF-1α（1∶200）4 ℃孵育过夜，吐温-20-三羟甲基氨甲烷缓冲盐溶液（TBST）洗膜后加二抗，室温孵育2 h，TBST漂洗，ECL显色，发光仪曝光、拍照，蛋白相对定量采用Image J软件分析测定图像灰度，以β-actin为内参。

1.3.4 苏木精‑伊红（hematoxylin‑eosin，H&E）染色法观察病理

取关节组织新鲜标本，置于10%甲醛液中固定，10% EDTA中脱钙，常规石蜡包埋，4 μm切片；切片脱蜡至水化，苏木精染细胞核，伊红染细胞质，封片后显微镜下观察组织形态。进行组织学评分：滑膜炎症、滑膜增生、软骨侵袭、骨破坏程度进行评分，具体方法及评分标准^［15］见表3。

1.3.5 免疫组织化学（immunohistochemistry， IHC）检测HIF-1α阳性表达

切片步骤同“1.3.4”项，切片脱蜡至水化，枸橼酸修复；封闭后加入一抗HIF-1α抗体（1∶200），4 ℃孵育12 h；加入二抗（1∶200）后在 37 ℃下孵育30 min；然后DAB显色、H&E复染、盐酸乙醇分化、梯度脱水、二甲苯透明，最终晾干封片。采用Image J软件分析各组小鼠相应关节组织蛋白阳性细胞所占关节面积百分比，阳性表达为IHC染色下呈现棕色。

1.4 统计学处理

采用SPSS27.0统计软件，构建固定效应模型，对实验数据进行统计学分析，使用GraphPad Prism 8.3.0统计学软件进行绘图。计量资料以平均值±标准差（\overline{x}\pm s）展示实验结果，实验研究结果均重复3次，若计量资料满足正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，组间采用SNK-q检验，若为非正态性分布，则采用非参数分析秩和检验（Kruskal-Wallis H检验），P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HBO干预后各组小鼠关节肿胀的情况

第7天：3组小鼠AI评分均有上升趋势，与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分（Z=1.098，P=0.272；Z=0.488，P=0.626），差异均无统计学意义，与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分（Z=0.125，P=0.901），差异无统计学意义。第9天：3组小鼠AI评分保持上升趋势，与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI（Z=1.588，P=0.112；Z=1.403，P=0.160），差异均无统计学意义，与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分（Z=1.070，P=0.285），差异无统计学意义。第11天：与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分分别呈降低趋势（Z=4.233，P<0.001；Z=3.200，P=0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分略有差异（Z=1.092，P=0.275），但差异无统计学意义。第13天：与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分分别保持降低趋势（Z=4.767，P<0.001；Z=4.359，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分略有差异（Z=0.420，P=0.674），但差异无统计学意义。第15天：与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分分别呈持续降低趋势（Z=4.820，P<0.001；Z=4.696，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分呈降低趋势（Z=2.544，P=0.011），差异有统计学意义。第17天：与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分分别呈持续降低趋势（Z=4.818，P<0.001；Z=4.602，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分呈降低趋势（Z=3.053，P=0.002），差异有统计学意义。第19天：与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分分别呈持续降低趋势（Z=5.315，P<0.001；Z=4.613，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分呈降低趋势（Z=4.257，P<0.001），差异有统计学意义。第21天：与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组AI评分分别呈持续降低趋势（Z=4.615，P<0.001；Z=4.592，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组AI评分呈降低趋势（Z=3.808，P<0.001），差异有统计学意义。以上结果显示：NOR组第1~21天双足未见明显变化且AI评分均为0分，其余3组小鼠自初次免疫后，足趾、关节逐渐开始肿胀，活动度逐渐受限，AI评分持续高于同期NOR组；CIA组第7天二次免疫后，足趾、关节肿胀程度及AI评分于第11天起持续高于同期HBO组，第15天达到高峰，之后足趾、关节肿胀较前有所减轻，至第21天仍高于同期HBO组；HBO-H组足趾、关节肿胀程度及AI评分于第15~21天持续低于同期HBO-L组；AI评分结果总体趋势呈现为CIA组>HBO-L组>HBO-H组>NOR组，结果表明HBO对足趾、关节肿胀能起到一定的缓解作用，且HBO-H组较HBO-L组效果更为显著，见表4、图2、3。

2.2 HBO干预后各组小鼠关节组织HIF‑1α蛋白下调情况

（1）PCR检测HIF‑1α mRNA表达结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织HIF‑1α mRNA表达量逐渐升高（t=11.975、15.008、12.90，P<0.001），差异有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织HIF‑1α mRNA表达量分别逐渐降低（t=2.580，P=0.03；t=8.337，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织HIF‑1α mRNA表达量呈降低趋势（t=12.655，P<0.001），差异有统计学意义；单因素方差分析比较4组平均值（F=86.664，P<0.001），差异有统计学意义，效应量分析中，Eta方为0.878（0.979，0.994），表明HBO能起到一定的下调关节组织HIF-1α水平，且HBO-H组较HBO-L组效果更为明显，见表5、图4。

（2）WB检测HIF-1α蛋白表达结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量逐渐升高（t=32.509、30.140、237.274，P<0.001），差异均有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量分别逐渐降低（t=16.686、54.118，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量呈降低趋势（t=8.792，P<0.001），差异有统计学意义；单因素方差分析比较4组平均值（F=1 374.852，P<0.001），差异有统计学意义。效应量分析中，Eta方为0.987（0.978，0.990），以上结果表明HBO能起到一定的降低HIF-1α蛋白作用，且HBO-H组疗效优于HBO-L组，见表6、图5~6。

（3）IHC结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量逐渐升高（t=11.457、39.839、128.661，P<0.001），差异有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量分别逐渐降低（t=76.171、423.468，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量呈降低趋势（t=79.776，P<0.001），差异有统计学意义；单因素方差分析比较4组平均值（F=2 813.429，P<0.001），差异有统计学意义。效应量分析中，Eta方为0.993（0.989，0.995），以上结果表明HBO能起到一定程度减少HIF-1α蛋白作用，且HBO-H组较HBO-L组效果更佳，见表7、图7。

2.3 下调HIF‑1α对各组小鼠关节组织炎症因子mRNA表达情况

PCR检测IL‑1 mRNA表达结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织IL‑1 mRNA表达量逐渐升高（t=7.751、13.141、11.741，P<0.001），差异均有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织IL‑1 mRNA表达量分别逐渐降低（t=4.722，P=0.001；t=5.998，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织IL‑1 mRNA表达量呈降低趋势（t=3.474，P=0.007），差异有统计学意义，单因素方差分析比较4组平均值（F=63.652，P<0.001），差异有统计学意义。效应量分析中，Eta方为0.841（0.713，0.884），见表8；PCR检测IL‑6 mRNA表达结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织IL‑6 mRNA表达量逐渐升高（t=9.906、10.237、14.811，P<0.001），差异有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织IL‑6 mRNA表达量分别逐渐降低（t=5.951，P<0.001；t=13.718，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织IL‑6 mRNA表达量呈降低趋势（t=8.762，P<0.001），差异有统计学意义，单因素方差分析比较4组平均值（F=74.697，P<0.001），差异有统计学意义，效应量分析中，Eta方为0.862（0748，0.899），见表8；PCR检测TNF‑α mRNA表达结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织TNF‑α mRNA表达量逐渐升高（t=8.520、13.610、12.607，P<0.001），差异有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织TNF‑α mRNA表达量分别逐渐减低（t=2.732，P=0.023；t=5.543，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织TNF‑α mRNA表达量呈降低趋势（t=4.678，P=0.001），差异有统计学意义，单因素方差分析比较4组平均值（F=80.570，P<0.001），差异有统计学意义效应量分析中，Eta方为0.870（0.763，0.905），以上结果均表明HBO介入后，关节组织中炎症因子（IL-1、IL-6、TNF-α）有一定程度下降，表明HBO有一定的抗炎作用，可能与HIF-1α信号通路下调有关，见表8。

2.4 HBO干预后各组小鼠关节组织病理变化

光学显微镜下显示，正常组小鼠关节间隙清晰，关节面平整、规则，未见滑膜细胞增生、血管翳生成、炎性细胞浸润，软骨、滑膜包围均匀，无骨质破坏；CIA组小鼠踝关节可见滑膜异常增生和炎性浸润并填充关节腔，血管数量显著增加，关节间隙融合消失，关节面不连续无规则，软骨出现不同程度的破坏。HBO组踝关节滑膜增生和炎性浸润均减轻，血管数量均减少，总体均好于CIA组；HBO-H组在踝关节滑膜增生、炎性浸润和血管数量减少较HBO-L组更明显。见图8。组织病理评分结果显示：与NOR组比较，HBO-H组、HBO-L组、CIA组关节组织病理评分逐渐升高（t=6.194、11.045、13.443，P<0.001），差异有统计学意义；与CIA组比较，HBO-L组和HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量分别逐渐降低（t=5.014，P=0.001；t=11.500，P<0.001），差异均有统计学意义；与HBO-L组比较，HBO-H组关节组织HIF-1α蛋白相对表达量呈降低趋势（P=8.143，P<0.001），差异有统计学意义，单因素方差分析比较4组平均值（F=24.933，P<0.001），差异有统计学意义，效应量分析中，Eta方为0.800（0.687，0.848），结果表明HBO可一定程度的减轻CIA小鼠关节组织炎症反应，部分修复病理改变，改善病情，且HBO-H组疗效更为突显，显示出骨损伤修复作用，见表9。

3 讨论

RA是一种累及骨、关节及其周围组织的慢性自身免疫系统性疾病，其主要特征是滑膜炎症、滑膜细胞增生形成缺氧微环境、血管新生发展为血管翳侵蚀骨与软骨，最终导致活动受阻、功能障碍甚至残疾^［16］。药物治疗对RA至关重要，然而临床上仍没有疗效显著的针对性药物^［17］，因此开发新的治疗RA方法刻不容缓。DBA/1小鼠品系是CIA经典小鼠模型，具有发病率高、可重复性好，成模率高等优点^［18］。本研究采用DBA/1小鼠，运用Ⅱ型胶原+弗氏佐剂法诱导小鼠关节炎CIA模型，CIA组初次免疫后，足趾、关节逐渐开始肿胀，活动度逐渐受限；7 d后二次免疫，于第15天四足达到高峰；与NOR组比较，CIA组小鼠足趾肿胀程度明显伴有关节变形，AI评分显著升高，差异有统计学意义（P<0.001）；关节组织病理可见滑膜内大量炎性细胞浸润、滑膜组织明显增生、病理性微血管增多、软骨破坏；RA是一种炎症疾病，IL-1、IL-6、TNF-α作为重要的促炎因子，在RA小鼠关节组织中含量显著升高^［19］。Baum等^［20］报道IL-1、IL-6可以诱导破骨细胞分化，增强破骨细胞活性，破坏骨动态平衡，造成骨丢失。Amalraj等^［21］、Bai等^［22］研究发现TNF-α作为炎症瀑布性级联反应的关键因子，在RA中过度表达，促使白细胞聚集，诱导IL-1、IL-6分泌，协同增强炎症反应。本研究CIA组IL‑1、IL‑6、TNF‑α mRNA水平较NOR组均显著升高，组间差异有统计学意义，表明RA小鼠免疫系统被激活，进而在关节组织中释放大量IL-1、IL-6、TNF-α炎症因子，加速滑膜炎症，以上结果充分证实CIA小鼠模型构建成功。

关节内形成缺氧微环境主要是由于关节腔内滑膜增生、免疫细胞浸润，共同提高滑膜对O₂的需求导致。Fearon等^［23］研究发现RA患者关节腔内氧分压显著低于对照组，氧分压仅为2%~4%，更有甚者低于1%，关节腔内缺氧情况与微血管增生、滑膜增生和氧化损伤有关。Blagov等^［24］、Jang等^［25］研究发现在关节腔持续低氧的状态下，免疫细胞、非免疫细胞及细胞因子可能通过调控细胞内信号来发挥生物学作用参与RA的发病过程，并造成RA病情持续进展。HIF-1α属于转录因子，是细胞相应缺氧的关键因子，在正常O₂条件下可以被脯氨酰羟化酶羟基化，最终迅速降解，其在缺氧环境下，α亚基不易被脯氨酰羟化酶羟基化，易于β亚基形成异二聚体在细胞质内大量聚集，并迁移至细胞核，表达量显著增多，通过调控下游靶基因的激活与转录来调节、适应缺氧状态^［26］。本研究通过PCR发现，与NOR组相比，CIA组关节组织中HIF‑1α mRNA显著增加，组间差异有统计学意义（P<0.001）；后续的WB、IHC实验显示：CIA组关节组织中HIF-1α蛋白表达量显著超过NOR组，组间差异均有统计学意义（P<0.001），使缺氧环境下HIF-1α累积的结论得到进一步验证。George等^［27］、Wang等^［28］研究表明HIF-1α是在RA缺氧滑膜中高表达，HIF-1α通过启动下游众多基因的转录表达而参与滑膜病理性炎症。Gan等^［29］研究证明在RA的病理机制中，在缺氧微环境中HIF-1α积累，对促进成纤维细胞样滑膜细胞增殖有着十分重要作用，参与RA的病理过程，本研究与既往研究观察到同样的结果。

HBO治疗是指在超过一个大气压的环境下吸入纯氧来治疗疾病的方法，它可提供更多的O₂给受损组织，改善组织生理功能从而加速组织恢复^［30］。HBO能够通过提高血氧张力进而增加机体的血氧含量，还能够增加组织的氧储量^［13］。Sakata等^［31］在HBO对小鼠胰岛移植的研究中观察到组织中的HIF-1α表达量明显下降。Sun等^［32］在小鼠大脑中动脉闭塞后应用HBOT处理，发现HBO能够明显改善大脑组织的缺氧状态，下调HIF-1α水平。本研究在HBO暴露后，4组PCR检测关节组织HIF‑1α mRNA单因素方差分析，比较平均值差异有统计学意义（F=63.652，P<0.001），效应量：Eta方为0.841（0.713，0.884）；4组WB检测关节组织HIF-1α蛋白相对表达量单因素方差分析，比较平均值差异有统计学意义（F=1 374.852，P<0.001），效应量：Eta方为0.987（0.978，0.990）；4组IHC检测关节组织HIF-1α蛋白相对表达量单因素方差分析，比较平均值差异有统计学意义（F=2 813.429，P<0.001），效应量：Eta方为0.993（0.989，0.995）；以上PCR技术、蛋白电泳技术、免疫组化技术均分析得出HIF-1α蛋白表达总体趋势呈现CIA组>HBO-L组>HBO-H组>NOR组，组间差异均有统计学意义，且组间差异效应量显著，表明通过HBO暴露，可一定程度的改善局部关节组织缺氧状态，从而使小鼠关节组织中HIF‑1α mRNA得到一定程度的抑制，与既往研究结果符合。

本研究单因素方差分析比较4组IL‑1 mRNA平均值差异有统计学意义（F=63.652，P<0.001），效应量分析Eta方为0.841（0.713，0.884）；单因素方差分析比较4组IL‑6 mRNA平均值差异有统计学意义（F=74.697，P<0.001），效应量分析Eta方为0.862（0748，0.899），单因素方差分析比较4组TNF‑α mRNA平均值差异有统计学意义（F=80.570，P<0.001），效应量分析Eta方为0.870（0.763，0.905），结果显示IL‑1、IL‑6、TNF‑α mRNA表达总体趋势呈现CIA组>HBO-L组>HBO-H组>NOR组，组间差异均有统计学意义，且组间差异效应量显著；结果表明HBO可以发挥一定控制炎症因子释放，从而一定程度的有效抑制关节组织炎症浸润、增殖，高剂量HBO降低早期关节组织炎性反应，疗效更佳。本研究4组病理切片及单因素方差分析比较4组病理评分平均值差异有统计学意义（F=24.933，P<0.001），效应量分析Eta方为0.800（0.687，0.848），更直观展示出HBO可一定程度的减轻CIA小鼠关节组织炎症反应，部分修复病理改变，改善病情，且HBO-H组体现出更为显著骨保护作用。AI评分结果显示，HBO第7天介入后，第11天逐步开始显效，第15天起HBO组间差异逐渐增大，HBO-L组足趾、关节肿胀改善趋势减缓，而HBO-H组足趾、关节肿胀减轻程度明显优于HBO-L组，第21天组间差异最为明显，差异有统计学意义（P<0.001），表明HBO介入5 d后，对足趾、关节肿胀状态有所改善，且具有一定的治疗时间依赖性。AI评分结果总体趋势呈现为CIA组>HBO-L组>HBO-H组>NOR组，显示HBO能使CIA小鼠足趾、关节肿胀得到一定的控制，使炎症得到一定的缓解。Harnani等^［33］发现RA动物模型中，经HBO干预后，血清促炎因子表达明显变化，组织炎症显著改善。Sit等^［34］报道HBO可激活内源性修复系统，降低炎性因子的水平，从而修复受损细胞，影响疾病转归。Dulberger等^［35］研究通过MRI量化炎症和损伤的标准方法证实HBO治疗RA的有效性。上述既往研究结果均证实HBO暴露对炎症损伤均有一定的抑制作用，与本研究结果相符。

Harnanik等^［36］通过研究发现以HIF-1α为靶点对胶原诱导的关节炎RA动物模型产生治疗作用；Ban等^［11］在RA动物模型中发现，HIF-1α 的条件性敲除导致研究性关节炎的临床病理学改善，特别是HIF-1α敲除后小鼠的滑膜炎症、水肿形成和软骨破坏明显减少。关节腔内缺氧环境诱发滑膜增生、炎症反应、微血管增生；本研究以HIF-1α为靶点，通过HBO暴露，CIA小鼠滑膜缺氧状态有所改善，关节组织中HIF-1α表达相应有所下调；同时促炎因子释放得到一定程度调控，且研究结果显示HIF‑1α mRNA与促炎因子IL‑1、IL‑6、TNF‑α mRNA表达趋势基本相同，提示可能在炎症早期运用HBO暴露，促使HIF-1α一定程度下调，从而减缓RA骨关节炎症损伤进展。

综上所述，HBO暴露对CIA模型小鼠疾病早期发挥一定的骨关节保护作用，能够在一定程度上改善关节肿胀症状、干预病理过程，存在一定的潜在抗关节炎和免疫调控作用，可能具有一定的治疗时间依赖性，其作用机制可能与下调HIF-1α来调控炎症因子释放相关，而且HBO作为一种非侵入性的物理治疗手段，使用方便，安全性高。尽管本研究通过PCR、WB、IHC实验发现HBO暴露能够下调HIF-1α，但是并没有进行HIF-1α基因敲除小鼠和HBO对CIA小鼠关节影响的实验以进一步明确HIF-1α通路的作用。本实验发现HBO暴露7 d和14 d对于CIA小鼠关节炎症效果的影响有明显差异，但仍需要尝试更多的暴露时间并观察治疗效果以确定HBO暴露最佳时间。此外，本次研究仅对HBO暴露降低CIA小鼠关节炎症因子，改善关节肿胀症状的可能作用机制进行初步分析，未对HBO暴露降低HIF-1α后，抑制CIA小鼠过度激活的免疫系统的可能机制进行深一步探究，因此后续研究可进一步寻找HIF-1α下游靶向调控基因，为进一步拓展其在相关科研奠定基础，也为临床上应用提供一定的科研依据。

作者贡献度说明：

李琴：负责实验试剂、耗材购买；负责实验操作、指标检测、数据整理、图表绘制、统计分析，负责文献检索，文章整体设计、撰写、修订、定稿；殷诺：负责课题设计、方案指导，文章、稿件审阅、修改指导；张辉：负责实验动物造模。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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