苓桂术甘汤干预高脂诱导大鼠心肌纤维化的作用机制研究

Mechanism of Linggui Zhugan Decoction in intervening high‑fat‑induced myocardial fibrosis in rats

摘要

目的 采用网络药理学方法结合体内外实验研究苓桂术甘汤（LGZGD）干预高脂诱导心肌纤维化的作用及机制。 方法 运用网络药理学方法筛选LGZGD的有效成分及靶点，获取心肌纤维化和代谢性心肌病的靶点，对共同靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析，并建立交集靶点的PPI网络和有效成分-核心靶点关联网络。构建高脂喂养诱导的高脂血症大鼠模型，给予LGZGD干预后，采用H&E染色和Sirius red染色观察心肌损伤和胶原纤维沉积，RT-qPCR检测观察心肌组织MMP9、TGF‑β、SMAD3、SMAD7 mRNA表达水平，并进行免疫组化染色检测心肌组织的CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平；构建棕榈酸（Palmitic acid，PA）诱导的大鼠H9C2心肌损伤细胞模型，采用流式细胞术、RT-qPCR检测，探究LGZGD含药血清对凋亡水平以及MMP9、TGF‑β、SMAD3、SMAD7 mRNA表达水平的影响。 结果 网络药理学分析得出共筛选出LGZGD 103个活性成分和886个核心靶点，与疾病相关的核心靶点有12个，与代谢性心肌病引起的心肌纤维化密切相关的富集通路有245条等。动物实验显示，与正常组比较，模型组大鼠心肌组织出现明显的心肌细胞排列紊乱，心肌纤维部分断裂及间质纤维化等病理变化，心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ含量及CollagenⅠ/CollagenⅢ比值显著升高，TGF‑β、SMAD3、MMP9 mRNA表达显著升高，而SMAD7 mRNA表达显著降低（P<0.05）。LGZGD干预8周后，心脏损伤有明显改善，使心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ含量及CollagenⅠ/CollagenⅢ比值，TGF‑β、SMAD3、MMP9 mRNA表达下调，SMAD7 mRNA表达上调（P<0.05）。细胞实验显示，与正常组比较，PA组细胞凋亡水平显著升高，且H9C2心肌细胞TGF‑β、SMAD3、MMP9 mRNA表达显著升高，而SMAD7 mRNA表达显著降低（P<0.01）；与PA组比较，LGZGD干预后，H9C2心肌细胞TGF‑β、SMAD3、MMP9 mRNA表达下调，SMAD7 mRNA表达上调以及细胞凋亡水平均显著改善（P<0.01）。 结论 LGZGD可通过干预心肌组织TGF-β/SMAD通路，从而抑制高脂模型大鼠心肌纤维化。

Abstract

Objective To study the effect and mechanism of Linggui Zhugan Decoction （LGZGD） in the intervention of high-lipid-induced myocardial fibrosis by using network pharmacology combined with in vitro and in vivo experiments. Methods The network pharmacology method was used to screen the active ingredients and targets of LGZGD， the targets of myocardial fibrosis and metabolic cardiomyopathy were obtained， the GO function and KEGG pathway enrichment analysis of the common targets were carried out， and the PPI network and the active ingredient-core target association network of the intersecting targets were established. A rat model of hyperlipidemia induced by high-fat feeding was constructed， and after the intervention of LGZGD， myocardial injury and collagen fiber deposition were observed by H&E staining and Sirius red staining， the mRNA expression levels of MMP9， TGF‑β， SMAD3， and SMAD7 in myocardial tissues were detected by RT-qPCR， and the expression levels of CollagenⅠ and CollagenⅢ in myocardial tissues were detected by immunohistochemical staining. A model of H9C2 cardiomyocyte injury induced by palmitic acid （PA） in rats was constructed， and the effects of LGZGD on the level of apoptosis and the mRNA expression levels of MMP9， TGF‑β， SMAD3， and SMAD7 were investigated by flow cytometry and RT-qPCR. Results The network pharmacology analysis showed that a total of 103 active ingredients and 886 core targets of LGZGD were screened， including 12 core targets related to the diseases， and 245 enrichment pathways closely related to myocardial fibrosis caused by metabolic cardiomyopathy. Animal experiments showed that compared to the normal group， the myocardial tissue of the model group showed obvious myocardial cell arrangement disorder， partial breakage of myocardial fibers， and interstitial fibrosis， the content of CollagenⅠ， CollagenⅢ and the ratio of CollagenⅠ/CollagenⅢ in myocardial tissue were significantly increased， the mRNA expressions of TGF‑β， SMAD3， and MMP9 were significantly increased， and the mRNA expression of SMAD7 expression was significantly reduced （P<0.05）. LGZGD significantly improved the cardiac injury after 8 weeks of intervention， and the content of CollagenⅠ， CollagenⅢ and the ratio of CollagenⅠ/CollagenⅢ in myocardial tissue， the mRNA expression of TGF‑β， SMAD3， and MMP9 was down-regulated， and the mRNA expression of SMAD7 was up-regulated （P<0.05）. Cell experiments showed that compared to the normal group， the apoptosis level of the PA group was significantly increased， and the mRNA expression of TGF‑β， SMAD3， and MMP9 of H9C2 cardiomyocytes was significantly increased， while the mRNA expression of SMAD7 was significantly reduced （P<0.01）； and compared to the PA group， LGZGD could down-regulate the mRNA expression of TGF‑β， SMAD3， and MMP9 in H9C2 cardiomyocytes， up-regulate the mRNA expression of SMAD7， and significantly improve the level of apoptosis （P<0.01）. Conclusion LGZGD can inhibit myocardial fibrosis in high-fat rats by interfering with the TGF-β/SMAD pathway in myocardial tissue.

Graphical abstract

关键词

苓桂术甘汤 / 网络药理学 / 心肌纤维化 / 高脂血症

Key words

Linggui Zhugan Decoction / Network pharmacology / Myocardial fibrosis / Hyperlipidemia

高血脂和肥胖是导致心血管疾病的重要原因^［1］，并且多种代谢异常因子的叠加作用与心血管事件的发生呈正相关^［2］。高脂血症作为一种临床常见的代谢性疾病，是导致代谢性心肌病、冠心病、高血压病、肥胖等诸多疾病的基础^［3］。代谢性心肌病是一种与代谢过程密切相关的长期疾病，其突出的特征包括明显的结构和功能变化，以及间质纤维化的出现 ^［4，5］。代谢性心血管病是一种以糖脂代谢异常为核心，由免疫炎症、氧化应激、血管内皮损伤等多种病理生理过程所致的一种心血管疾病^［6］。另外有研究证明，血脂异常不仅是代谢性心肌病和其他心脑血管疾病形成的重要发病中心环节，也是心肌纤维化形成的主要危险因素^［7］。

苓桂术甘汤（LGZGD）出自《伤寒杂病论》，它是一种主要成分为甘草、茯苓、桂枝、白术的中药材，具有温阳健脾、淡渗利湿的作用^［8］。现代研究显示，它具有治疗心血管疾病的作用。前期研究表明，LGZGD具有良好的抗心肌纤维化作用^［9］。中草药是一种多成分、多靶点、多方法联合干预的中药，同时，其观点与网络药理研究理念契合^{［10，11］}。因此，本课题采用网络药理学方法，研究LGZGD调控高脂诱导心肌纤维化的作用靶点、活性成分。基于前期研究，采用体内动物实验和体外细胞实验，为进一步探讨LGZGD调控高脂诱导心肌纤维化作用机理提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 LGZGD活性成分、靶点筛选

在TCMSP中药综合数据库^［12］分别检索“白术、甘草、桂枝、茯苓”，得到其有效成分。以“口服生物利用度≥30%、药物相似性≥0.18”中药数据库药物筛选标准，筛选出有效成分，导入SwissTargetPrediction数据库^［13］对其进行靶点预测。

1.1.2 心肌纤维化靶点及代谢性心肌病靶点筛选

设定关键词为“Myocardial fibrosis，MF”、“Metabolic cardiomyopathy，MC”，登录GeneCards数据库^［14］（https：//www.genecards.org），筛选心肌纤维化、代谢性心肌病的靶点。

1.1.3 LGZGD干预代谢性心肌病导致的心肌纤维化的靶点预测

将LGZGD活性成分对应靶点及疾病靶点，通过网站^［15］（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app）作韦恩图，获得共同靶点。

1.1.4 蛋白相互作用网络（protein⁃protein interaction，PPI）构建、拓扑学分析

采用String数据库^［16］（https：//string-db.org），将共同靶点导入该数据库构建PPI网络。而后采用Cytoscape 3.7.2软件可视化分析和CytoNCA插件拓扑分析对核心靶点进行筛选，筛选条件：共同靶点的间中心性（betweenness centrality）和中心性（degree centrality）的中位值。

1.1.5 GO、KEGG通路分析

将“1.1.3”项所得出的共同靶点导入Metascape数据库^［17］（https：//metascape.org/），以“Homo sapiens”为物种进行分析，在微生信网（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对排名前20进行可视化。

1.2 分子对接

1.2.1 处理中药活性成分

采用Cytoscape 3.7.2软件中的CytoNCA插件，对LGZGD相应靶点进行网络拓扑分析，按度值大小获得其排名前20的活性成分^［18］。活性成分结构图从TCMSP数据库获取，再用CB-Dock^{［18，19］}（clab.labshare.cn/cb-dock/php/download.php）分子对接。

1.2.2 筛选核心靶点蛋白结构

蛋白质晶体结构从PDB数据库^［18］（https：//www.rcsb.org/）获取。

1.2.3 分子对接 TGF‑B核心靶点

排名前20的活性成分导入CB-Dock^［18］（clab.labshare.cn/cb-dock/php/download.php）对接，得到其对接数据。

1.3 动物及细胞实验

1.3.1 药物与试剂

按前期课题组的提取技术^［20］，以LGZGD为原料，制成干浸膏（含4.2 g生药），密闭，放置在4 ℃冰箱，待用。LGZGD饮片（茯苓、桂枝、白术、甘草，质量比例4∶3∶3∶2）购于安徽敬道生物科技有限公司，茯苓批号：220701，桂枝批号：210902，白术批号：220801，甘草批号：210501；正常饮食饲料（北京华阜康生物科技股份有限公司），批号：2210220909^［18］；高脂饲料（安徽合肥青源生化技术有限公司），高脂饲料含5%猪油，5%糖分，5%蛋黄，1%胆固醇，84%基本维持饲料；棕榈酸（palmitic acid，PA）购于BIOBOMEI公司；胎牛血清（优级）（Servicebio公司）；DMEM高糖培养基（含丙酮酸钠）（Biosharp公司）；青链霉素混合液（Servicebio公司）；胰酶细胞消化液（Servicebio公司）；RNA提取液（Servicebio公司）；SYBR（Servicebio公司）；反转录试剂盒（Biosharp公司）；免疫组化所用一抗为：兔抗鼠CollagenⅠ抗体（GB11022-3-100）购于Servicebio公司，兔抗鼠CollagenⅢ抗体（GB111629-100）购于Servicebio公司。

1.3.2 动物

SPF级60只雄性SD大鼠，重量180~220 g，产地：郑州市华兴实验动物养殖场，实验动物生产许可证为：SCXK（豫）2019-0002。动物实验经安徽中医药大学动物实验伦理委员会审查、批准，动物伦理编号：AHUCM-rats-2022085。

1.3.3 细胞

大鼠心肌细胞H9c2细胞株（STCC30008P）购自武汉赛维尔生物有限公司。

1.3.4 实验仪器

KH-TS型自动组织脱水型（湖北孝感阔海医疗科技有限公司）；HM525 NX型冷冻切片机［艾普迪实验器材制造（上海）有限公司］；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；YP6002电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；YD-AB摊片烤片机（金华市益迪医疗设备有限公司）；YD-6L生物组织冷冻包埋机（金华市益迪医疗设备有限公司）；UB203i显微镜（重庆澳浦光电技术有限公司）。

1.3.5 高脂大鼠模型建立、分组及给药

高脂饲料喂养SPF级雄性SD大鼠20周建立大鼠模型^{［21，22］}。SD大鼠高脂饲料喂养12周后，随机分成模型组和LGZGD组。在13周称重后分别给药，LGZGD组给药剂量为4.2 g/kg，正常组、模型组分别以蒸馏水喂养8周，用药完成后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，取腹主动脉血，4%多聚甲醛固定心脏组织，H&E染色和Sirius red染色检测，剩余的心脏组织冷冻保存在-80 ℃的冷冻箱中，待用^［17］。

1.3.6 大鼠血脂水平检测

实验结束后取各组大鼠血清，按照试剂盒说明书检测各组大鼠总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）含量。

1.3.7 心肌组织病理学检测

剖取模型大鼠的心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，制作厚4 μm的切片，H&E染色、Sirius red染色，光学显微镜下观察病理改变^［23］。

1.3.8 RT‑qPCR检测大鼠心肌组织相关基因表达

从大鼠心脏标本中提取50 mg心肌组织并加入1 mL Trizol。匀浆、分离、沉淀、洗脱、溶出等步骤提取RNA，确定其纯度，最后逆转录为cDNA模板产物^［24］。使用RNA提取液提取总RNA，使用反转录试剂盒逆转录为cDNA，RT-qPCR采用三步法，Light Cycler 96具体程序设置如下：95 ℃ 5 min预热，然后扩增40个循环（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 0.5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s），Cooling（37 ℃）0.5 min。在结束后对其进行溶解曲线分析以确保扩增单一产物，然后获得目的基因以及对应内参基因的Cq值，应用2^－△△cq法进行结果分析。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

1.3.9 免疫组化

将大鼠麻醉，取心脏置于4%多聚甲醛固定24 h，经脱水后石蜡包埋，切至5 μm置于载玻片上，脱蜡处理后进行抗原修复，并阻断内源型过氧化物酶，在室温下用BSA封闭30 min，然后加入一抗，在4 ℃的湿箱温孵1夜，隔日用PBS冲洗，最后加二抗室温孵育50 min^［25］，PBS洗涤切片后滴加DAB显色液自来水终止染色，苏木素染色3 min后使用分化液分化数秒，返蓝液返蓝后流水冲洗，而后进行脱水封片，置于显微镜下观察。

1.3.10 LGZGD含药血清制备

将20只SD大鼠随机分为空白组和LGZGD组，每组10只。LGZGD组给予LGZGD 8.4 g生药/kg，按照1 mL/100 g剂量灌胃，早晚各1次，空白组按照同样方法给予蒸馏水，连续5 d。最后1次灌胃30 min后，腹主动脉取血，静置4 h，3 000 r/min，离心20 min，取上清，56 ℃水浴锅灭活30 min，用0.22 μm滤膜过滤，-80 ℃保存。

1.3.11 PA溶液的制备

称取40.92 mg PA，向其加入0.1 mol/L的NaOH溶液4 mL，75 ℃水浴30 min充分皂化；称取1.6 g不含脂肪酸的BSA加入4 mL去离子水配置40% BSA溶液，与PA皂化钠溶液按照1∶1比例混合均匀，得到20 mmol/L的PA存储^［26］备用。

1.3.12 实验分组及给药

将细胞接种于六孔板中，等到生长至实验所需丰度后随机分为NC、PA、LGZGD 3组，NC组和PA组经20%空白血清预处理12 h，LGZGD组经20%LGZGD含药血清预处理12 h，而后PA和LGZGD组后加入20 mmol PA继续培养。

1.3.13 流式细胞术检测心肌细胞细胞凋亡水平

将细胞接种于六孔板中，等到生长至实验所需丰度后随机分为NC、PA、LGZGD 3组，经给药处理后按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书处理细胞后上机检测。

1.3.14 RT‑qPCR法检测H9C2心肌细胞基因表达

同“1.3.8”项。

1.4 统计学处理

利用GraphPad Prism 8软件、SPSS22.0软件对各组数据进行统计学处理，并对多组数据进行单因素方差分析。结果均以均值±标准差（\overline{x}\pm s）的形式显示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 LGZGD活性成分、靶点分析

通过中药综合数据库筛选出121个主要活性成分，除18个无靶点成分，在SwissTargetPrediction数据库对103个活性成分进行靶点预测，得到886个靶点^［17］。

2.1.2 心肌纤维化靶点及代谢性心肌病靶点分析

登录GeneCards数据库，设定关键词为“Myocardial fibrosis”、“Metabolic cardiomyopathy”，并对其进行中位值筛选，得到534个心肌纤维化靶点、884个代谢性心肌病靶点。

2.1.3 LGZGD靶点、心肌纤维化和代谢性心肌病靶点分析

通过jvenn网站，将这些靶点导入进行韦恩图绘制，得到59个共同靶点（图1）。

2.1.4 LGZGD干预代谢性心肌病导致的心肌纤维化的靶点网络分析

通过Sring数据库，对59个共同靶点分析并制成PPI网络图（图2）。用Cytoscape 3.7.2软件可视化，圆圈颜色深、大，表示其靶点间相关性很高（图3）。网络拓朴学分析用CytoNCA插件，核心靶点筛选得到Degree值、特征向量中心度（EC）、Closeness值、Betweenness值中其大于中位值的靶点（表2）。

2.1.5 GO与KEGG通路分析

登录Metascape数据库，对59个共同靶点分析。得到558个分子功能，主要涉及蛋白激酶结合、丝氨酸激酶活性、蛋白质结构域特异性结合；269个细胞组成，主要涉及内质网腔膜筏、细胞外基质、分泌颗粒腔；3 712个生物过程，主要涉及对激素的反应、血液循环、调节炎症反应，获得245个信号通路（筛选标准：P<0.05），并对其前20个的通路进行可视化，见图4。

2.2 分子对接结果

2.2.1 活性成分及核心靶点结构信息

网络拓扑分析应用CytoNCA插件，依据degree值的大小，选出其排名前二十的活性成分^［18］，见表3。从PDB数据库获取蛋白的晶体结构，见表4。

2.2.2 对接结果

将核心靶点TGF-B蛋白分别与LGZGD排名前20的活性成分对接，得到20组对接数据，再进行可视化，如图5所示，当结合能≤-5.0 kJ/mol时，认为活性成分与核心靶点具有良好的结合能力。部分对接结果如表5、图5所示。2.3　动物实验结果

2.3.1 LGZGD对高脂模型大鼠血清血脂水平的影响

按照试剂盒说明书检测各组大鼠TC、TG、LDL、HDL水平。与正常组相比，模型组血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量明显升高，高密度脂蛋白含量明显降低。而经LGZGD连续干预

8周后，能明显降低模型组大鼠的TC、TG、LDL水平，显著升高HDL水平且与模型组具有显著性差异。结果显示LGZGD可显著改善高脂模型大鼠的血脂水平，见表6、图6。

2.3.2 LGZGD对高脂模型大鼠心肌组织病理学的影响

H&E染色结果可见，与正常组相比，模型组心肌细胞排列以及形态异常，且心肌纤维断裂明显，细胞间浸润较多炎性细胞；而LGZGD干预后，明显减少了炎性细胞浸润，心肌细胞结构形态清晰，排列有序，病理改变减轻。Sirius red染色结果显示，与正常组相比，模型组大鼠心脏的胶原纤维沉积明显增加；与正常组比较，LGZGD组大鼠心肌细胞的纤维化面积显著减少（图7）。

2.3.3 RT‑qPCR检测大鼠心肌组织相关基因表达

对各组大鼠的SMAD3、SMAD7、TGF‑β、MMP9 mRNA进行RT-qPCR检测，结果显示，模型组大鼠心肌组织中TGF‑β、MMP9、SMAD3的mRNA表达明显上调（P<0.05），SMAD7的mRNA表达明显下调（P<0.05）；而LGZGD干预后，大鼠心肌组织SMAD3和TGF‑β、MMP9的mRNA表达明显降低（P<0.05），SMAD7的mRNA表达明显升高（P<0.05），见表7、图8。

2.3.4 LGZGD对高脂模型大鼠的心肌组织 CollagenⅠ、CollagenⅢ水平的影响

免疫组化染色结果可见，模型组大鼠心肌组织中明显上调了CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平和CollagenⅠ/CollagenⅢ的比值；而LGZGD干预后，明显降低了大鼠心肌组织CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平和CollagenⅠ/CollagenⅢ的比值（P<0.01），见表8、图9。

2.4 细胞实验

2.4.1 LGZGD对PA诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响

采用流式细胞仪检测各组细胞细胞凋亡水平。结果如图所示，与NC组相比，PA组细胞凋亡水平显著升高；与PA组相比，LGZGD组凋亡水平显著改善，见表9、图10。

2.4.2 RT⁃qPCR法检测H9C2心肌细胞基因表达

对各组心肌细胞的SMAD3、SMAD7、TGF⁃β、MMP9 mRNA进行RT-qPCR检测，结果所示，模型组心肌细胞TGF⁃β、MMP9、SMAD3的mRNA表达明显上调（P<0.01），SMAD7的mRNA表达明显下调（P<0.01）；与模型组比较，LGZGD组心肌细胞SMAD3和TGF⁃β、MMP9的 mRNA表达显著降低（P<0.01），SMAD7的mRNA表达显著升高（P<0.01），见表10、图11。

3 讨论

高脂血症是机体脂类代谢异常所致血脂水平升高的一种代谢性疾病，是导致代谢性心肌病、冠心病、肥胖等诸多疾病的基础^［7］。血脂异常会导致胰岛素抵抗、脂质毒性、微血管改变、线粒体功能异常、活性氧的产生、纤维化等 ^{［7，26，27］}。血脂异常可能引起代谢性心肌病后， 局部心肌受损，心肌细胞大量死亡，并被胶原蛋白所取代，进而诱发心肌纤维化^［28］。TGF-β/Smad信号通路是介导器官纤维化最经典的信号通路，在促进纤维性疾病中起主导作用，也可被看成是一个关键的成纤维细胞活化因子，具有很强的促纤维化作用^［29］。

本研究旨在探究LGZGD治疗高脂诱导心肌纤维化的潜在作用机制。网络药理学结果显示，筛选出59个LGZGD治疗代谢性心肌病导致的心肌纤维化的潜在核心靶点，通过PPI蛋白互作及拓朴学分析获得12个核心蛋白靶点：TNF、IL6、ALB、AKT1、ACE、REN、MMP9、PPARG、HIF1A、PTGS2、TGFB1、ESR1。GO功能富集分析也显示LGZGD干预心肌纤维化主要涉及内质网腔膜筏、细胞外基质、分泌颗粒腔、蛋白激酶结合、蛋白质结构域特异性结合、丝氨酸激酶活性、对激素的反应、血液循环、调节炎症反应。KEGG通路结果显示，主要涉及肥厚型心肌病、糖尿病心肌病相关信号通路、HIF-1信号通路、AGE-RAGE信号通路、AMPK信号通路、癌症及胰岛素抵抗。分子对接结果显示，核心靶点TGF-B与中药复方前20有效活性成分均有较好的结合作用，可以通过相互作用进而干预高脂诱导的纤维化进程。

TGFB1作为心血管系统中最重要的异构体，参与了对基质金属蛋白酶系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统以及炎症和免疫系统的调节，促进心肌纤维化^［30］。心肌纤维化过程中，成纤维细胞活化和转化为肌成纤维细胞是导致心肌纤维化的重要细胞学事件^［31］。细胞外基质主要由胶原组成，即大部分为Ⅰ、Ⅲ型胶原组成，Ⅰ型胶原比较粗大，抗牵伸性较强；Ⅲ型胶原蛋白一般会形成较细的纤维，使基质网具有弹性；在心脏纤维化过程中，Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达增多，以Ⅰ/Ⅲ型胶原比例升高为特征^［32］。MMP9是一种基质金属蛋白酶，在纤维化过程中具有调节作用；MMP9的过量表达会使心肌的胶原蛋白结构发生改变，使室壁变薄，心腔增大，从而对心脏功能产生不利的影响^［33］。Smad7是一种抑制因子，可下调Smad2/3而负向调节TGF-β1/SMAD通路^{［34，35］}。

本研究采用高脂饲料喂养建立大鼠模型并进行体外细胞实验验证网络药理学分析结果，探讨LGZGD治疗心肌纤维化是否通过调控TGF-β/SMAD信号通路及相关重要蛋白表达发挥作用。动物实验结果表明，模型组大鼠在LGZGD对其进行干预后，有明显的组织学结构的恢复和纤维化面积的减少，同时心肌组织TGF⁃β，SMAD3，MMP9 mRNA表达水平以及CollagenⅠ、CollagenⅢ水平降低，SMAD7 mRNA表达水平升高。细胞实验结果显示，经PA诱导的H9C2心肌细胞在LGZGD对其进行干预后，细胞凋亡水平显著下降，同时，明显下调心肌细胞TGF⁃β，SMAD3，MMP9 mRNA表达，而SMAD7 mRNA表达明显上调。

LGZGD在高脂饮食诱导的心肌纤维化模型中展现了较好的治疗效果。研究表明，LGZGD能够有效降低心肌组织中的纤维化面积，并改善组织结构。这一作用机制可能与其对TGF-β/SMAD信号通路的调控密切相关。具体来说，通过动物实验和细胞实验验证了该汤剂的抗纤维化效果，表现为纤维化面积减少和相关蛋白表达的显著变化。这一变化表明LGZGD可能通过抑制心肌细胞的凋亡和纤维化过程，从而减缓心肌损伤。此外，LGZGD的抗纤维化作用也与其调节细胞信号通路、改善细胞微环境有密切关系。前期研究发现，LGZGD具有显著的抗心肌纤维化作用，其作用机理与TGF-β/ SMAD通路密切相关。

综上所述，以高脂模型大鼠为研究对象，采用网络药理学等方法，从动物-细胞-分子水平探讨LGZGD对高脂诱导心肌纤维化的作用机理，因此，本研究发现LGZGD可能是通过调节TGF-β， MMP9的表达，控制TGF-β/SMAD信号通路来改善高脂诱导心肌纤维化，为深入研究LGZGD干预高脂诱导心肌纤维化提供了研究方向。

作者贡献度说明：

彭红艳：文章整体设计、撰写及相关实验；张文龙：数据收集及部分实验；郭露琴：数据收集及部分实验；王靓：指导文章设计撰写，论文整体质量把控并定稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

安徽自然科学基金面上项目(2208085MH277)