RECK基因对肝癌细胞系MHCC97‑H/L表型作用的影响

Effect of RECK gene on the phenotype of liver cancer cell line MHCC97‑H/L

摘要

目的 探讨RECK表达水平对人肝癌细胞MHCC97‑H/L细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响。 方法 首先对TCGA和GTEx数据库中肝细胞癌样本的RNA‑seq数据进行生物信息学分析，筛选出一个与肿瘤转移相关的关键基因RECK；然后利用慢病毒转染在MHCC97‑H/L细胞中构建RECK干扰/过表达模型；通过qRT‑PCR和蛋白免疫印记检测RECK在MHCC97‑H/L细胞中的表达情况；EDU检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Transwell实验检测细胞侵袭情况；划痕实验检测细胞迁移情况；明胶酶谱、ELISA和蛋白免疫印记检测MMP‑2、MMP‑9和MT1‑MMP表达。 结果 RECK的表达在肝细胞癌样本的各个分期（尤其是G₃期）中的差异均有统计学意义（P<0.05）。与Sh‑NC组相比，沉默RECK表达后， MHCC97‑L细胞的增殖能力提高，细胞侵袭能力和迁移率增加，细胞凋亡率下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；与Oe‑NC组相比，过表达RECK后，MHCC97‑H细胞增殖能力下降，细胞侵袭能力和迁移率降低，细胞凋亡率升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；干扰RECK表达显著促进MHCC97‑L细胞内MMP‑2、MMP‑9和MT1‑MMP的表达，反之，过表达RECK抑制MHCC97‑H细胞内MMP‑2、MMP‑9和MT1‑MMP的表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结论 RECK的表达能够增强肝癌细胞凋亡，并降低肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

Abstract

Objective To investigate the effect of RECK expression levels on the proliferation， apoptosis， invasion and migration ability of human liver cancer cell line MHCC97‑H/L. Methods Firstly， the RNA‑seq data of hepatocellular carcinoma samples in TCGA and GTEx databases were analyzed by bioinformatics to screen out a key gene RECK related to tumor metastasis. Then， RECK interference and overexpression models were constructed in MHCC97‑H and MHCC97‑L cells by lentiviral transfection， respectively. The mRNA and protein expression of RECK in MHCC97H/L cells were detected by qRT‑PCR and Western blot， respectively. EDU method was used to detect cell proliferation. Flow cytometry analysis was used to detect cell apoptosis. Transwell migration assay was used to detect cell invasion. Cell scratch assay was used to detect cell migration. Gelatin enzyme spectrum， ELISA， and Western blot were used to detect the expression of MMP‑2， MMP‑9 and MT1‑MMP in MHCC97‑H/L cells. Results The expression of RECK showed statistically significant differences （P<0.05） in G₁‑G₄ stages （especially in G₃ stage） of hepatocellular carcinoma samples. Compared to the Sh‑NC group， increased proliferation ability， cell invasion and migration， and decreased cell apoptosis in MHCC97‑L cells were observed in Sh‑RECK group with a significant difference （P<0.05）. Compared to the Oe‑NC group， decreased proliferation ability， cell invasion and migration， and increased cell apoptosis in MHCC97‑H cells were observed in the Oe‑RECK group with a significant significance （P<0.05）. Further research showed that the Sh‑RECK group significantly promoted the expression of MMP‑2， MMP‑9 and MT1‑MMP in MHCC97‑L cells. While the Oe‑RECK group inhibited the expression of these MMPs in MHCC97‑H cells， which showed a statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion The expression of RECK can enhance apoptosis of liver cancer cells and reduce their proliferation， invasion， and migration abilities.

Graphical abstract

关键词

RECK基因 / 肝细胞癌 / 转移 / 表型

Key words

RECK gene / Hepatocellular carcinoma / Metastasis / Phenotype

肝癌是一种具有高复发性和转移性的恶性肿瘤，也是第三大致死性癌症 ^［1］。 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是原发性肝癌最主要的组织学分型，占全球肝癌总病例数的80%以上 ^［2］。我国是HCC发生率较高的国家^［3］。 发病率高、诊断晚、耐药持续、反复发作等一系列原因导致大多数HCC患者预后不佳 ^［4］。因此，新型治疗靶点的开发仍是基础研究人员的首要任务。含kazal基序的逆转诱导的富半胱氨酸蛋白（reversion‑inducing cysteine‑rich protein with Kazal motifs， RECK）是近年来发现的一种定位于细胞膜上的新型肿瘤抑制因子^［5］。RECK是不同基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）和去整合素和金属蛋白酶（adamalysins， ADAMs）的膜锚定抑制剂 ^［6］。它能够在转录后抑制MMP2、MMP9和MT‑MMPs，以维持细胞外基质（extracellular matrix， ECM）重塑并调节信号通路，从而促进有序的组织重塑，抑制肿瘤新生血管以及肿瘤细胞的侵袭和转移 ^［7‑9］。 肝癌的研究显示，RECK在肝癌组织中表达水平明显低于癌旁的肝硬化组织及正常肝组织 ^{［12，13］}。也有研究发现，HCC中只有60%的患者样本低表达RECK ^［13］。这说明，RECK水平能够作为HCC患者生存时间的潜在预后标志，为患者的临床治疗提供更科学有效的指导策略。本研究为明确RECK水平改变对肝癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的作用及其机制，旨在为探索RECK对HCC诊疗的意义提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌细胞系MHCC97‑H/L购自中科院上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清和Lipofectamine 3000试剂购自美国赛默飞公司；胰酶购自美国Sigma‑aldrich公司；逆转录酶购自上海碧云天公司；荧光定量PCR试剂购自北京索莱宝公司；RECK、MMP2、MMP9抗体购自Affinity Biosciences公司；MT1‑MMP抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；β‑actin抗体和羊抗兔lgG‑HRP购自沈阳万类生物科技有限公司；EdU成像检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Annexin V‑Light650/PI细胞凋亡试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司；超净工作台购自中国苏州净化设备有限公司；超速冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超纯水系统购自香港力康生物医疗科技控股有限公司；倒置相差显微镜购自日本OLYMPUS公司；激光共聚焦显微镜购自Zeiss公司；荧光定量PCR仪购自Funglyn Biotech公司；垂直电泳仪购自Bio‑Rad公司；流式分析仪购自美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 生信分析

从癌症基因组图谱（TCGA）数据集（https：//portal.gdc.com）获得肝细胞癌的RNAseq数据（level3）和相应的临床信息。GTEx数据来自V8版本（https：//gtexportal.org/home/datasets）。 使用R软件ggplot2 v4.0.3进行统计分析。不同组样本中RECK 表达分布通过卡方检验分析显著性P值，其中数值大小为取-log₁₀（P value），P<0.05则代表相应两组中该临床特征分布存在显著差异。

1.2.2 沉默及过表达细胞模型构建

在37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青/链霉素双抗的DMEM高糖培养基中常规培养HCC肿瘤细胞系MHCC97‑H/L。针对人源RECK基因（NM_001316346.2）合成并构建shRNA干扰片段或过表达载体及相应阴性对照，在细胞对数生长期内，采用Lipofectamine 3000试剂进行转染。转染后使用实时荧光定量PCR法评估转染效率。实验分组如下：MHCC97‑L细胞：未转染组（Control），shRNA干扰对照组（Sh‑NC），shRNA干扰组（Sh‑RECK），MHCC97‑H细胞：未转染组（Control），过表达对照组（Oe‑NC）及RECK过表达组（Oe‑RECK）。

1.2.3 荧光定量PCR实验（qRT‑PCR）

使用TRIpure试剂裂解细胞，从细胞中提取总RNA，并进行反转录得到相应cDNA。以cDNA为模板，使用SYBR Green法在Exicycler^TM 96实时荧光定量PCR仪进行定量分析。以β‑actin作为内参基因，采用2^-△△Ct法计算RECK mRNA的相对表达量。相应引物：RECK（F：ACCAAATGTGCCGTGAT/R： CAGCAGCCTAAGCCAAC）；β‑actin（F： GGCA CCCAGCACAATGAA/R：TAGAAGCATTTGCGGTGG）

1.2.4 蛋白免疫印记检测（Western blot）

提取细胞上清液，并用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定各组上清和细胞蛋白浓度。各组取20 μg蛋白样本上样，100 V电泳；90 V湿转至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h；加入相应一抗4 ℃孵育过夜；TBST洗膜后，分别加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗室温孵育2 h，使用CCD显影仪曝光蛋白条带并用ImageJ软件计算蛋白相对表达量。

1.2.5 5‑乙炔基‑2‑脱氧尿嘧啶核苷法（EdU）检测细胞增殖

按照“1.2.2项”中分组进行转染，并于转染后48 h内进行EdU检测。将10 μmol/L的EdU染色液加入各组转染细胞后，37 ℃培养2 h；4%多聚甲醛固定15 min； 0.5% Triton X‑100室温孵育20 min后，加入Click‑iT反应液，室温避光孵育30 min，接着用 DAPI染色5 min，随后于荧光显微镜观察细胞并记录EdU阳性细胞的百分比。

1.2.6 细胞凋亡实验

收集各组转染细胞并进行细胞计数，使上样细胞量在5×10⁵左右。联用Annexin V‑Light 650 和碘化丙啶（PI）染色，室温避光孵育15 min，立即使用NovoCyte流式细胞仪检测细胞凋亡情况，用FlowJo软件分析细胞凋亡率。

1.2.7 细胞侵袭实验

将预先稀释的Matrigel胶包被于Transwell小室膜上， 37 ℃静置2 h使胶凝固。消化转染后的各组细胞，将细胞（5×10⁴）重悬于无血清的DMEM培养基中并在Transwell上室培养，下室加入800 μL含10% FBS的完全培养基，在37 ℃、5% CO₂的条件下继续培养24 h。然后用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%的结晶紫染液染色5 min。最后在倒置显微镜下（200×）计数微孔膜下层细胞，每个样本选取5个视野计数。

1.2.8 细胞划痕实验

将细胞接种于6孔板，培养24 h后转染。用200 μL无菌吸头制造划痕后，PBS洗涤细胞3次以除去细胞碎片。加入无血清的DMEM高糖培养基并置于细胞培养箱中继续培养。使用光学显微镜对0、24、48 h的划痕进行拍照记录，计算迁移距离。

1.2.9 明胶酶谱

各组取60 μg细胞上清蛋白上样，恒压70 V电泳2.5 h。凝胶经过洗脱、漂洗、孵育、染色操作后，置于不同浓度的甲醇/乙酸混合液中分别脱色0.5、1、2 h，以上步骤均按照说明书严格执行。最后用凝胶成像系统对凝胶进行拍照，分析条带的光密度值。

1.2.10 酶联免疫吸附实验（ELISA）

使用MMP‑2和MMP‑9的ELISA试剂盒检测各组细胞中MMP‑2和MMP9的表达水平，具体步骤完全按照试剂商说明书进行。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0进行统计分析。所有实验均至少重复3次，计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间两两比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生信分析

对从TCGA数据库和GTEx数据库获得的182例肝细胞癌样本的临床信息和RNAseq数据进行生信分析。结果显示，从不同分期的样本中RECK表达分布占比来看，RECK基因在HCC各个分期中的表达具有差异性（χ²=10.81，P<0.05）。而处于G3分期的HCC样本中，RECK高表达的样本数显著高于低表达的样本数，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 RECK沉默及过表达模型的建立

使用人肝癌细胞系MHCC97‑L构建RECK基因沉默模型，MHCC97‑H构建RECK基因过表达模型。qPCR结果显示，相比于Control，Sh‑NC组的RECK mRNA表达水平无差异，Sh‑RECK组可见RECK mRNA的表达水平显著下调（P<0.001）（图2A）。Western blot结果显示上述各组RECK蛋白表达水平与其qPCR结果趋势一致（图2B）。相比于Control， Oe‑NC 组的RECK mRNA表达水平无差异，Oe‑RECK组RECK mRNA的表达水平显著上调（P<0.001）（图2C）。同样，Western blot结果显示上述各组RECK蛋白表达水平与其qPCR结果趋势一致（图2D）。上述结果证实RECK基因沉默和过表达模型的成功构建。

2.3 沉默RECK基因对MHCC97‑L细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响

EDU结果显示，与Control和Sh‑NC组相比，Sh‑RECK组细胞增殖能力显著增强（P<0.001）（图3A）。流式细胞术检测发现，Sh‑RECK组细胞凋亡减少（图3B）。侵袭实验显示，Sh‑RECK组相较于两组对照（Control和Sh‑NC）拥有更强的侵袭能力（P<0.001）（图3C）。细胞划痕实验显示，Sh‑RECK组相较于两组对照拥有更强的迁移能力（P<0.001）（图3D）。上述结果说明，RECK沉默能够增强MHCC97‑L细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并减少细胞凋亡。

2.4 过表达RECK基因对MHCC97‑H细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响

EDU结果显示，与Control和Oe‑NC组相比，Oe‑RECK组细胞增殖能力显著下降（P<0.001）（图4A）。凋亡结果显示，Oe‑RECK组细胞凋亡比例明显升高（图4B）。侵袭实验和细胞划痕实验检测发现，Oe‑RECK组相较于两组对照（Control和Oe‑NC）拥有更弱的侵袭和迁移能力（P<0.001）（图4C、D）。上述结果说明，RECK过表达增强了MHCC97‑H细胞凋亡的过程，降低了细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

2.5 RECK水平改变对细胞内外MMPs蛋白表达的影响

Western blot结果显示，RECK沉默后，肝癌细胞MHCC97‑L内的基质金属蛋白酶MMP‑2、MMP‑9和MT1‑MMP的表达水平相比于对照组（Control和Sh‑NC）显著升高（图5A、B），而RECK过表达则使MHCC97‑H细胞内上述MMPs表达水平显著下调（图5A、C）。使用明胶酶谱法（图5D）检测细胞内MMP‑2和MMP‑9的活性，凝胶染色显示RECK沉默后MHCC97‑L细胞内MMP‑2和MMP‑9的活性显著增强，而RECK过表达后MHCC97‑H细胞内的上述两种MMP活性明显降低。然后使用ELISA法（图5E、F）验证细胞外MMP‑2和MMP‑9的分泌水平，得到与Western blot趋势一致的结果，即RECK水平降低促进MHCC97‑L细胞分泌MMP‑2和MMP‑9到细胞外，而RECK水平升高则会抑制MHCC97‑H细胞分泌MMP‑2和MMP‑9。

3 讨论

HCC的发展涉及到突变、增殖、生存、侵袭和转移等多个步骤^［14］。转移则是HCC患者死亡最常见的原因 ^{［15，16］}。然而HCC转移的分子机制仍然未被阐明 ^{［16，17］}。肿瘤的恶性程度可以根据其分化程度高低进行病理分级，分级越低，肿瘤恶性程度越高。根据Edmondson‑Steiner分级法，HCC可分为Ⅰ‑Ⅳ级，第Ⅰ级，癌细胞高度分化，与正常人的肝细胞类似；第Ⅱ级，癌细胞中度分化，形态接近正常细胞，肝癌切除率降低；第Ⅲ级，癌细胞分化差；第Ⅳ级，癌细胞分化最差，细胞癌内、外转移^［18］。HCC的侵袭和转移首先需要突破基底膜和ECM，在这种病理环境下，MMPs通过破坏基质的降解平衡，诱导肝癌细胞突破由基底膜和ECM组成的组织屏障，侵袭邻近组织，转移到远处组织 ^［19］。因此，筛选与肿瘤侵袭和迁移相关的关键靶基因，是找到HCC转移发生机制的关键。

RECK是一种新发现的抑癌基因， RECK的表达被发现在多种浸润性癌症（胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌等）中下调，其表达水平降低与癌症的恶性程度增加和不良预后高度相关，而恢复其表达能够有效逆转癌细胞的转移 ^{［5，9，20］}。在机制上，RECK通过靶向MMPs，ADAMs/ADAMTSs等效应分子的表达与激活，参与细胞增殖、迁移以及ECM重塑的负向调节 ^［20］。从TCGA数据库和GTEx数据库中获取到182例肝细胞癌患者的基因表达数据，经过生物信息学分析后，发现随着肝癌细胞从G1进展到G3期，RECK基因的表达水平逐步升高，而且处于G3期的癌细胞样本表现出RECK水平的显著上调。RECK是细胞外基质重塑和信号通路的关键调节剂， 可抑制MMPs，具有分解 ECM 的功能 ^［21］。作为MMPs抑制剂，RECK的表达可抑制多种恶性肿瘤侵袭和转移 ^{［21，22］}。因此，猜想G₁~G₃期肝细胞癌样本中RECK表达水平的升高是其作为抑癌基因的一种“代偿性”保护措施，通过高表达RECK抑制癌细胞向G₄期发展，即抑制肝细胞癌转移扩散。一旦HCC突破G₃期发展到G₄期（癌症终末期），发生不可逆转的全身转移，RECK的抑癌作用“失代偿”，不再起到保护作用。Abd‑Elfatah等 ^［23］和Chung等 ^［24］的研究发现人HCC的恶化、转移及其临床病理特征受到RECK基因多态性和单倍型影响。猜测RECK这种在HCC发展中上调的保护作用可能也与人群个体化差异以及HCC的诱发因素密切相关。

多种细胞系（HELA、C33A、HTR8/SvNeo 和hTERT（+）‑AM）的研究显示，外源性的RECK基因能通过脂质体有效转染进入细胞，降低细胞的体外迁移及侵袭能力^{［25‑27］}。本研究分别在两种人肝癌细胞系：MHCC97‑L（低转移）和MHCC97‑H（高转移）中建立RECK基因干扰和过表达模型，探索RECK基因表达改变对肝癌细胞增殖、侵袭、凋亡和迁移功能表型以及对金属蛋白酶MMP‑2、MMP‑9和MT1‑MMP表达的影响^［8］。上调RECK表达水平时，肝癌细胞中促进癌细胞转移相关金属蛋白酶MMP‑2和MMP‑9的表达显著降低，同时也发现肝癌细胞中MT1‑MMP的表达在上调RECK表达水平时也存在显著降低的趋势。MT1‑MMP是一种跨膜蛋白，它能够参与体内MMP‑2的裂解和活化^［28］，提示RECK的正常表达能够调节MMPs的功能，参与调节ECM的重塑，从而抑制细胞的侵袭转移。这与本研究的表型实验结果吻合，即RECK表达能够增强肝癌细胞凋亡，并降低肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

综上所述，RECK是一个有利的预后因素，其表达能够促进高肿瘤免疫和低转移微环境的塑造，有效抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。未来应进一步探讨如何干预肿瘤细胞内RECK基因，提高其表达，为HCC的靶向治疗提供新的治疗策略。

作者贡献度说明：

丁碧莹：基础实验及文章撰写；王利新：文章修改；董辉：研究内容和方向把控及文章修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金青年项目(82002955)

宁夏自然科学基金资助项目(2022AAC03567)