人脐带间充质干细胞源外泌体负载刺槐素的制备方法研究

Research on preparation method of acacetin loaded on exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells

摘要

目的 构建刺槐素（Acacetin）的外泌体（Exosomes，EXOs）递药系统。 方法 以人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）来源外泌体为药物载体，采用共孵育法、超声法和反复冻融法3种方式包载刺槐素，制备负载刺槐素的外泌体（EX-Aca）。采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定EX-Aca包封率和载药率。透射电镜（TEM）、粒径分析和 Western Blot对EXOs和EX-Aca 的表征进行检测，通过体外毒性实验检测Ex-Aca的安全性，同时考察其细胞摄取能力。 结果 通过高效液相色谱计算得出共孵育法包封率及载药率均高于超声法和反复冻融法。当刺槐素浓度为80 μg/mL时，包封率和载药量最高，分别为91.90% 和19.68%。透射电镜（TEM）下EXOs和EX-Aca均呈杯碟状，平均粒径分别为（102.356 96±0.656 23）nm和（117.300 38±0.747 83）nm，呈现典型外泌体特性。Western Blot均检测到EXOs和EX-Aca表面标志物CD9、ALIX和TSG101的蛋白表达。因此，EX-Aca的最优制备方法参数为：刺槐素浓度为80 μg/mL，与hUMSCs来源外泌体4 ℃ 共孵育48 h。体外实验验证了EX-Aca对细胞低毒性，细胞存活率>94% 且EX-Aca可被BV2细胞摄取。 结论 成功构建刺槐素的外泌体递药系统，制备的EX-Aca对细胞具有低毒性，具有一定靶向性 。

Abstract

Objective To construct exosomes （EXOs） drug delivery system of acacetin. Methods Using exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells （hUMSCs） as drug carriers， The exosomes loaded with acacetin （EX-Aca）were prepared by co-incubation， ultrasound and repeated freeze-thaw methods. The encapsulation rate and loading rate of EX-Aca were determined by high performance liquid chromatography. Transmission electron microscopy （TEM）， particle size analysis and Western Blot were used to detect the characterization of EXOs and EX-Aca. The safety of Ex-Aca was tested by in vitro toxicity test， and its cellular uptake capacity was also investigated. Result The results of high performance liquid chromatography showed that the encapsulation rate and drug loading rate of co-incubation method were higher than that of ultrasonic method and repeated freeze-thaw method. When the concentration of acacetin was 80 μg /mL， the encapsulation rate and drug loading were the highest， which were 91.90% and 19.68%， respectively. Under transmission electron microscopy （TEM）， EXOs and EX-Aca were cup-and-saucer-shaped， with average particle sizes of （102.356 96±0.656 23）nm and （117.300 38±0.747 83）nm， respectively， showing typical exosome characteristics. Western Blot detection of EXOs and EX-Aca surface markers CD9， ALIX and TSG101 protein expression. Therefore， the optimal preparation parameters of EX-Aca were as follows： The concentration of acacetin was 80 μg/mL， and hUMSCs-derived exosomes were incubated at 4 ℃ for 48 h. In vitro experiments confirmed that EX-Aca had low cytotoxicity， cell survival rate was > 94%， and EX-Aca could be taken up by BV2 cells. Conclusion The exosomes drug delivery system of acacetin was successfully constructed， and the prepared EX-Aca had low toxicity to cells and certain targeting.

Graphical abstract

关键词

刺槐素 / 外泌体 / 药物载体 / 高效液相色谱 / 包封率

Key words

Acacetin / Exosomes / Drug carrier / High performance liquid chromatography / Encapsulation efficiency

刺槐素（acacetin）也被叫做刺槐黄素或金合欢素，属于黄酮类化合物。在菊花、刺槐、雪莲等多种植物中被发现并采集^［1］，其毒副作用小，具有广泛的药理活性，包括解痉作用、抗氧化、抗炎和免疫抑制、降血糖和抗肿瘤作用等^［2］。由于刺槐素难溶于水，其低水溶性限制了临床的应用。通过纳米递送载体，实现药物精确高效递送，是目前提高药物生物利用度的有效方法之一。关于刺槐素的载体研究较少，目前有将 IgG 修饰的脂质体作为药物传递系统，在细胞实验中发现刺槐素脂质体可以提高脑靶向性和屏障穿越能力^［3］。有研究成功开发并评估了一种用于透皮递送刺槐素的新型微乳液 （ME） 制剂，证实ME是刺槐素透皮递送的潜在载体^［4］。然而目前常见的药物载体会引起免疫排斥、与纳米尺寸蛋白发生相互作用等一系列不良反应。

外泌体（exosomes，EXOs）是一种具有脂质双分子层结构的细胞外囊泡，可参与细胞间信号传导作为药物载体从而应用于疾病的研究^［5］。外泌体与目前可用的人工药物递送载体体系相比具有很多优势。首先，外泌体本身具有可以穿透血脑屏障（BBB）的能力^［6］和细胞靶向特性^［7］。其次，外泌体的循环稳定性可以避免巨噬细胞的吞噬作用从而可以延长药物的半衰期^{［8， 9］}。越来越多的研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植后的治疗效果主要是来源于 MSCs 衍生的外泌体。外泌体作为新一代的纳米药物载体，具有多种生物活性分子，能过聚集在炎症区域，具有良好的靶向性，可穿越血脑屏障，且载药方式灵活等优势，倍受关注^{［10， 11］}。而hUMSCs 来源外泌体能否作为刺槐素的药物载体从而提高刺槐素的生物利用度，目前尚未见相关报道。因此本研究以人脐带间充质干细胞（hUMSCs）来源外泌体为载体，采用共孵育法、超声法和反复冻融法包载刺槐素构建一种具有主动靶向性的刺槐素递药系统。

1 材料与方法

1.1 材料

刺槐素（acacetin）购自美国sigma公司；原代人脐带间充质干细胞和原代间充质干细胞无血清培养体系均购自上海赛百慷公司；小鼠小胶质细胞（BV2）来自武汉博士德公司；纳米颗粒追踪分析仪来自德国Particle Metrix公司；透射电镜（Hitachi-4800，日本）；高效液相色谱仪（LC-20AT）日本岛津公司；INERTSIL ODS-2 （4.6 mm×150 mm，5 µm）液相色谱柱购自日本岛津公司；胎牛血清、青霉素、链霉素和0.25% 胰蛋白酶溶液购自美国Gibco公司； PBS、TBST、RIPA裂解液、PKH26染料、BCA试剂盒和CCK-8试剂均购自北京索莱宝公司； CD9 、ALIX 、TSG101 抗体购自美国 Abcam 公司；Actin-Tracker Green-488探针（鬼笔环肽）购自上海碧云天公司；荧光倒置显微镜来自尼康公司；蛋白电泳仪、化学发光成像仪、多功能酶标仪均购自美国BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人脐带间充质干细胞（hUMSCs）用原代间充质干细胞无血清培养体系培养，BV2细胞用含10% 胎牛血清和1% 双抗的DMEM高糖培养基培养，常规置于37 ℃，含 5% CO₂，饱和湿度的培养箱中培养。当细胞生长至融合率达80% 时进行传代培养。

1.2.2 外泌体提取分离

取培养至3~4代的hUMSCs 细胞培养上清于50 mL 离心管中。4 ℃， 300×g 离心10 min 除去死细胞后留上清；4 ℃，2 000×g 离心20 min 除去杂质留上清；4 ℃，10 000×g 离心30 min 除去杂质后留上清；0.22 µm过滤筛除去杂质；4 ℃，100 000×g 离心90 min 沉淀外泌体后弃上清； 4 ℃，100 000×g 离心90 min 清洗外泌体后弃上清，用适量PBS重悬沉淀获取外泌体溶液。外泌体蛋白浓度采用BCA 蛋白含量检测试剂盒进行蛋白定量，得到的外泌体溶液可存放于-80 ℃保存。

1.2.3 透射电镜法检测外泌体的形态

吸取外泌体样品20 µL滴至亲水碳膜铜网上，静置 15 min 左右使外泌体能够吸附在铜网上。水洗3次，每次5 min，滤纸吸去浮液。吸取20 µL 1% 磷钨酸溶液滴至铜网上进行负染1 min，滤纸吸去浮液，干燥 10 min 后上机拍照。

1.2.4 纳米粒径分析法检测外泌体粒径大小

超纯水稀释样品，使浓度在1×10⁷~1×10⁹/mL后用仪器测定粒径大小。

1.2.5 Western Blot 法检测外泌体表面标记物

将hUMSCs来源外泌体和负载刺槐素的外泌体EX-Aca与 RIPA 裂解液按1∶1比例混合，置于冰上裂解 30 min 后 4 ℃，12 000 rpm离心30 min 获得上清液，采用 BCA 法测定总蛋白浓度。根据蛋白分子量的差别选择不同的凝胶和PVDF膜。选用分段恒压进行电泳，浓缩胶用90 V，30 min；分离胶用120 V，60 min；300 mA转膜40 min后用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，加入 CD9（1∶1 000） 、ALIX（1∶1 000） 和TSG101 （1∶1 000）的一抗稀释液4 ℃孵育过夜。次日TBST 洗膜后加入二抗稀释液（1∶2 000）室温孵育 1 h， TBST 洗膜3次。滴加适量 ECL 显色液后曝片。

1.2.6 外泌体负载刺槐素的制备方法

分别采用共孵育法、超声法和反复冻融法进行刺槐素负载。 配制0.312 6 mg/mL 外泌体和不同浓度的刺槐素溶液（刺槐素浓度为 0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL），从不同浓度刺槐素溶液中各吸取25 µL，分别与475 µL 0.3126 mg/mL 的外泌体溶液混合，此时混合溶液中外泌体浓度为0.3 mg/mL、DMSO 浓度为 5% ，刺槐素浓度分别为80、40、20、10 µg/mL。

（1）共孵育法：将混合溶液置于4 ℃ ，避光孵育 48 h。

（2）超声法：将制备的混合溶液置于1.5 mL EP管（Eppendorf管）中，将EP管放置在浮漂上从而悬浮在超声机中，调整超声机功率为140 W。开始进行超声ON/OFF 各15 s，重复3次后取出冰浴 2 min，循环3次以上操作。超声结束后将EP管立刻置于37 ℃水浴恒温锅内孵育1 h，以恢复外泌体的膜稳定性，水浴后恢复室温。

（3）反复冻融法：将混合溶液置于冻存管内并存放于冻存盒内，于-196 ℃ 液氮罐中冷冻1 min，再置于常温下避光解冻 30 min，融化后再于-196 ℃液氮罐冷冻1 min，如此重复冻融3次。

BCA 法测量其蛋白浓度后放置-80℃ 冰箱备用。

1.2.7 载药外泌体（EX‑Aca）表征

同外泌体检测方法相同（透射电镜、粒径分析和Western blot）。

1.2.8 包封率和载药率测定

色谱条件：色谱柱为 INERTSIL ODS-2 （4.6×150 mm，5 µm），流动相为甲醇-水（含0.05% 冰乙酸）（75∶25），流速 1 mL/min，检测波长334 nm，柱温30 ℃。

采用高效液相色谱法检测游离刺槐素的含量，分别取刺槐素标准品溶液和外泌体溶液各20 µL 流入液相色谱，记录色谱图；制备刺槐素对照品溶液用于标准曲线绘制，将制备的 EX-Aca 样品各 20 µL 流入液相色谱，记录色谱图，记录峰面积并计算包封率和载药率。

包封率（EE，%）=\frac{\mathrm{总药}\mathrm{物质}\mathrm{量}-\mathrm{游离}\mathrm{药物}\mathrm{质量}}{\mathrm{总药}\mathrm{物质}\mathrm{量}}\times100

载药率（DL，%）=\frac{\mathrm{总药}\mathrm{物质}\mathrm{量}-\mathrm{游离}\mathrm{药物}\mathrm{质量}}{\mathrm{载药}\mathrm{载体}\mathrm{总量}}\times100

1.2.9 体外毒性实验检测EX‑Aca的安全性

选取对数生长的BV2细胞，以1×10⁴ 个细胞/孔的浓度接种在96孔板，每组设3个复孔，置于37 ℃ 含有 5% CO₂ 的湿润培养箱中培养。次日，细胞贴壁后加入共孵育法不同质量浓度的EX-Aca（刺槐素质量浓度梯度为10、20、40、80 μg/mL）。培养24 h后，每孔加入10 µL的CCK8溶液，37 ℃ 孵育40 min后测定各孔在450 nm 波长处的吸收值，以3 次独立重复实验平均结果作为研究结果。根据公式计算细胞活力。

细胞活力（%）=\frac{A(\mathrm{加药})-A(\mathrm{空白})}{A\mathrm{0}(\mathrm{加药})-A(\mathrm{空白})}\times100

1.2.10 外泌体摄取实验

使用 PKH26红色亲脂性染料标记EXOs和EX-Aca。按照说明书使用200 µL稀释液C重悬外泌体，加入3 µL PKH26混匀后避光孵育5 min；加入4倍体积的 5% BSA溶液终止染色，混匀孵育1 min。离心弃上清以去除未结合染料，200 µL PBS重悬PKH26标记的外泌体。取 BV2 细胞以5×10⁴个/孔接种在24孔板中，当细胞融合度达到80% 时每孔加入20 µL PKH26标记的EXOs 和 EX-Aca，37 ℃ 培养12 h。弃去培养基，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定，然后加入鬼笔环肽对细胞骨架进行染色（用 5% BSA 按照100∶1 的比例稀释），避光孵育30 min；孵育结束后去除多余的染液， PBS洗涤3次（每次5 min），在每孔加入500 µL DAPI染液作用5 min，PBS 洗涤3次（每次5 min），操作全程注意避光。染色完成后在倒置荧光显微镜下避光观察并拍照记录。

1.3 统计学处理

采用 GraphPad Prim8.0 统计软件进行统计学分析。采用 One-way ANOVA 检验选项比较各组差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hUMSC‑EXOs 和 EX‑Aca 鉴定

透射电镜检测法（TEM）观察到EXOs和EX-Aca 均呈现茶杯状形态，符合外泌体的形态特征结构（图1A）。粒径分析法（NTA）检测到EXOs和 EX-Aca 平均直径分别为（102.356 96±0.656 23） nm和（117.300 38±0.747 83） nm，符合外泌体粒径（30~150 nm）特征（图1B）。Western Blot法检测到外泌体表面标志物 CD9 、ALIX 和 TSG101的蛋白表达（图1C）。

以上三项鉴定方法证明 hUMSCs 提取物为外泌体，且在外泌体负载刺槐素后不会对外泌体的外表形态发生破坏，可用于后续实验。

2.2 EX‑Aca包封率和载药率测定

分别取刺槐素标准溶液、外泌体标准溶液各20 µL 流入液相色谱，记录色谱图。通过比较刺槐素标准品溶液和外泌体标准品溶液的峰图可以看出外泌体对刺槐素的测定无影响（图2A、B）。绘制刺槐素对照品标准曲线，回归曲线为Y=80 262X- 123 345（R²=0.999 6）（图2C）。通过计算得出不同负载方式不同浓度刺槐素的包封率和载药率。结果显示共孵育法包封率和载药率最高分别为91.90%和19.68%；超声法包封率和载药率最高分别为78.67%和17.34%；反复冻融法包封率和载药率最高分别为83.97%和17.91%。以上结果表明相对于超声法和反复冻融法，共孵育法具有更高的载药量和包封率，当刺槐素浓度为80 µg/mL时，包封率和载药量最高，分别为91.90 %和19.68 %。见表1。

2.3 EX‑Aca 对细胞活力的影响

为了探究载药外泌体对BV2细胞的体外安全性，共孵育法构建载刺槐素外泌体，通过CCK-8法检测不同浓度EX-Aca对BV2细胞的毒性作用。研究结果表明，当 EX-Aca 浓度为10 µg/mL时，细胞存活率为95.4%；当EX-Aca浓度为20 µg/mL时，细胞存活率为95.2%；当EX-Aca浓度为40 µg/mL时，细胞存活率为96.0% ；当EX-Aca 浓度为80 µg/mL时，细胞存活率为94.2%；4组细胞存活率均>94%，说明载药外泌体未表现出明显细胞毒性（P>0.05）。可用于后续实验（图3）。

2.4 BV2 摄取EXOs 和EX-Aca

为检测EXOs和EX-Aca 能否被 BV2 细胞摄取。首先用PKH26标记EXOs 和EX-Aca，进一步与 BV2 细胞共培养，共培养24 h后用鬼笔环肽标记细胞骨架，再用DAPI 标记细胞核。结果表明PKH26标记的EXOs 和EX-Aca 位于 BV2 细胞内，并且均分布在细胞的胞浆内。说明EXOs和EX-Aca已被BV2成功摄取。见图4。

3 讨论

外泌体的提取方法主要有超速离心、过滤、沉淀法、密度梯度离心等^［12］，然而都存在一定的局限性，方法的选择通常导致外泌体纯度和产率之间的差异。超速离心是最广泛使用的外泌体分离技术，适用于细胞培养上清和各种生物流体^［13］。在高离心力过程中囊泡膜的损伤和损失会极大地阻碍其回收和应用。过滤法的一个显著限制是在过滤前后都需要多个离心步骤，这可能使过程变的非常繁琐。通过沉淀法提取外泌体原理简单且成本较低，但是纯度和回收率比较低，杂蛋白较多，可能会产生难以去除的聚合物。通过使用密度梯度离心可以提高外泌体的纯度，但步骤繁琐，耗时长，需要特定的设备和技术^［14］。本实验采用经典的超速离心法进行外泌体的提取，同时对得到的外泌体和载药外泌体进行表征，结果表明EXOs 和 EX-Aca 均符合外泌体的形态特征结构。

外泌体的载药方法分为内源性载药途径和外源性载药途径。内源性载药途径是从供体细胞培养物上清液中分离含有生物活性物质的外泌体。因外泌体具有更高的特异性、可控性和无毒性，也常被作为癌症疫苗研究^［15］。有研究表明，当与癌症疫苗共同施用时，由M1极化的巨噬细胞释放的外泌体可以增强小鼠模型中的疫苗免疫原性和抗肿瘤免疫应答^［16］。外源载药途径首先是分离外泌体，然后使用各种技术在外部掺入药物或生物活性物质。常见外源载药方法包括共孵育、电穿孔、超声处理、冻融循环和挤出法。电穿孔法是通过瞬间电流瞬时提高细胞膜的通透性从而增强外泌体的载药能力，多用于负载载核酸、亲水小分子如氨基酸和肽等，合适的电穿孔条件可以减少电穿孔对外泌体膜稳定性的影响。挤出法将装载药物溶解到溶剂中，然后将药物溶液与外泌体悬浮液混合，混合物多次通过脂质挤出机，将药物装载到外泌体中，但挤出法可能破坏外泌体的完整性，影响载药效率。笔者采用共孵育法、超声法和反复冻融法三种方式对人脐带来源间充质干细胞进行刺槐素的负载，结果表明共孵育法得到的载药外泌体包封率和载药率均高于其他两组。共孵育法保证了外泌体膜的完整性，适用于小的疏水分子，目前研究发现多个化合物可通过共孵育法加载到外泌体中，如蛇床子素、姜黄素和紫杉醇^［17-19］。在后续实验中我们将采用共孵育法构建载刺槐素外泌体。

外泌体载药评价主要从药物包封效率、细胞摄取效率和生物安全性等方面进行。药物包封效率的测定方法主要有紫外分光法和高效液相色谱法，He^［18］等通过紫光分光法测定了载姜黄素外泌体的包封率，测得载姜黄素外泌体的包封率为87.25%；Wang等^［20］采用中性粒细胞来源的外泌体负载阿霉素，通过紫光分光法检测其包封率和载药率，结果显示NEs-Exos/DOX 载药率为 6.51%，包封率为 13.71%。Zhang等^［21］提取ADSCs外泌体负载虾青素，HPLC检测其包封率和载药率。在本实验中我们通过HPLC检测载刺槐素外泌体的包封率为66.89%~91.90%，载药率为2.18%~19.68%。

细胞摄取效率测定的主要方法有共聚焦显微镜和细胞学染色。Zhao等 ^［22］构建了负载地塞米松的外泌体，通过共聚焦显微镜考察RAW264.7巨噬细胞和L02肝细胞对DID标记的负载地塞米松外泌体的摄取情况，结果显示在共聚焦显微镜下可以观察到RAW264.7细胞和L02细胞对负载地塞米松的外泌体摄取量会随时间的推移而增加。李美乐 ^［23］等制备装载人参皂苷Rh2的外泌体，采用荧光倒置显微镜观察Huh7细胞和PLC细胞对装载人参皂苷Rh2外泌体的摄取情况。结果显示PKH26标记的装载人参皂苷Rh2的外泌体可以被Huh7细胞和PLC 细胞摄取，主要存在于细胞质中。本实验中我们发现BV2细胞可以摄取PKH26标记的负载刺槐素的外泌体，并且负载刺槐素的外泌体主要存在于BV2细胞的胞浆中。

体外细胞毒性测定可以确定外泌体和载药外泌体对细胞的潜在毒性。Yang ^［24］等人评估了负载抗菌药物利奈唑胺和万古霉素的外泌体，并证明负载药物的外泌体没有细胞毒性。Han等 ^［25］通过自然杀伤细胞提取的外泌体装载紫杉醇，发现与紫杉醇相比，用外泌体装载紫杉醇对正常细胞的毒副作用更小，能有效抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。在本实验中通过CCK8评估了负载刺槐素的外泌体对BV2细胞的毒性作用。结果显示在24 h内细胞的存活率率均大于94%，EX-ACA在10~80 µg/mL之间对细胞没有明显细胞毒性。

综上所述，笔者采用共孵育法构建了刺槐素的外泌体递药系统，BV2 细胞对EX-Aca有良好的摄取能力，EX-Aca对BV2细胞无明显毒性作用，说明外泌体作为刺槐素的药物载体是可行的。研究结果可为开发刺槐素纳米制剂提供实验依据以及提供新思路。然而本实验仅开展体外细胞水平的考察，还需体内实验对其进一步验证。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] 牛晓珊，杨丽娟， 补娟. 刺槐素对小鼠脑缺血再灌注损伤后血脑屏障的影响［J］. 卒中与神经疾病，2020，27（5）：572-575，603.

[2] Niu X， Yang L， Bu J. The effects of Acacetin on biood-brain barrier after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice［J］. Stroke Nerv Dis，2020，27（5）：572-575，603.

[3] 周媛媛. 刺槐素衍生物及其前药的设计合成与生物活性评价［D］. 广西医科大学， 2014.

[4] Zhou Y. The synthesis and bioactivities evaluationof derivatives and prodrugs of acacetin［D］. Guangxi Med Univ，2014.

[5] 杨钦磊. IgG修饰的刺槐素脂质体的研究［D］. 厦门大学， 2014.

[6] Yang Q. The study on the IgG modified acacetin loaded liposomes［D］. Xiamen Univ，2014.

[7] Wang Y， Chen Q， Huang X， Yan X Acacetin-loaded microemulsion for transdermal delivery： Preparation， optimization and evaluation［J］. Pharm Biol，2023，61（1）： 790-798.

[8] 姜姗姗，尹羽琪，厉芊妤，等. 哺乳动物外泌体：分离纯化、临床应用与展望［J/OL］. 中国生物工程杂志，1-17［2025-01-06］.

[9] Jiang S， Yin Y， Li Q， et al. Mammalian exosomes： Isolation and purification， clinical applications and prospects［J/OL］. China Biotechnol，1-17［2025-01-06］.

[10] 王中奇，于海宽，李然，等. 前体和成熟破骨细胞外泌体对成骨细胞分化的作用研究［J/OL］. 解放军医学院学报，1-7［2025-01-06］.

[11] Wang Z， Yu H， Li R， et al. Effects of exosomes derived from precursor osteoclasts and mature osteoclasts in facilitating osteogenic differentiation［J/OL］. Acad J Chin， PLA Med Sch， 1-7［2025-01-06］.

[12] 王双敏，汪显耀， 何志旭. 工程化间充质干细胞来源外泌体在靶向递送抗肿瘤药物中的应用与问题［J］. 中国组织工程研究，2025，29（23）：4975-4983.

[13] Wang S， Wang X， He Z. Application and problems in targeted delivery of antitumor drugs by exosomes derived from engineered mesenchymal stem cells［J］. Chin. J. Tissue Eng. Res，2025，29（23）：4975-4983.

[14] 任文静，李朝霞， 仇峰. 中药基于外泌体影响肿瘤治疗的研究进展［J］. 中草药，2022，53（22）：7234-7241.

[15] Ren W， Li Z， Qiu F. Research progress on traditional Chinese medicine affecting tumor therapy based on exosomes［J］. Chin Tradit Herb Drugs，2022，53（22）：7234-7241.

[16] 谢姿，马晓瑭，张惠婷， 钟望涛. 外泌体作为脑血管疾病治疗药物载体的研究进展［J］. 中风与神经疾病杂志，2021，38（10）：1135-1137.

[17] Xie Z， Ma X， Zhang H， Zhong W. Research progress of exosomes as drug carriers for cerebrovascular diseases［J］. J Apoplexy Nerv， Dis，2021，38（10）：1135-1137.

[18] 王国燮，杨林幅，牙红莲，等. 外泌体与三七总皂苷在缺血性脑卒中的研究进展［J］. 右江民族医学院学报，2024，46（2）：246-250.

[19] Wang G， Yang L， Ya H， et al. Research progress of exosomes and total saponins of panax notoginseng in ischemic stroke［J］. J Youjiang Med Univ National，2024，46（2）：246-250.

[20] 马宝南，孙丽娜， 韩美华. 肿瘤治疗的细胞药物递送系统的研究进展［J］. 现代药物与临床，2024，39（2）：503-513.

[21] Ma B， Sun L， Han M. Research advances of cell drug delivery system in treatment of tumor［J］. Hsien Tai Yao Wu Yu Lin Ch'uang，2024，39（2）：503-513.

[22] 吕丽华，朱丽娜，王皓，等. 血浆外泌体提取方法的比较［J］. 检验医学，2020，35（12）：1224-1228.

[23] Lv L， Zhu L， Wang H， et al. Comparison of plasma exosome extraction methods［J］. Chien Yen I Hsueh，2020，35（12）：1224-1228.

[24] 杨婷婷. 缓释EVs的3D打印Gel/HA/nHAP复合支架促进糖尿病大鼠骨再生［D］. 南开大学， 2023.

[25] Yang T. Sustained release of BMSCs-EVs from 3D printing Gel/HA/nHAP scaffolds for promoting bone regeneration in diabetic rats［D］. Nankai University，2023.

[26] 毛敏，林雅婷，伍翠莹，等. 不同预处理及分离方法提取山羊血浆外泌体效果的研究［J］. 黑龙江畜牧兽医，2023，19：62-65，139.

[27] Mao M， Lin Y， Wu C， et al. Study on the effect of different pretreatment and separation methods on extraction of goat plasma exosomes［J］. Heilongjiang Anim Sci Vet Med，2023，19：62-65，139.

[28] Meng S， Whitt AG， Stamp BF， et al. Exosome-based cancer vaccine for prevention of lung cancer［J］. Stem Cell Invest，2023，10： 2-2.

[29] Gunassekaran GR， Poongkavithai Vadevoo SM， Baek MC， Lee B M1 macrophage exosomes engineered to foster M1 polarization and target the IL-4 receptor inhibit tumor growth by reprogramming tumor-associated macrophages into M1-like macrophages［J］. Biomaterials，2021，278： 121137.

[30] 李明莉，胡冬生，杨秀竹，等. 外泌体装载蛇床子素的方法探究［J］. 中国药理学通报，2023，39（10）：1994-1998.

[31] Li M， Hu D， Yang X， et al. Study on method of osthole loaded by exosomes［J］. Chin J Biotechnol，2023，39（10）：1994-1998.

[32] He R， Jiang Y， Shi Y， et al. Curcumin-laden exosomes target ischemic brain tissue and alleviate cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting ROS-mediated mitochondrial apoptosis［J］. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2020，117： 111314.

[33] Man F， Meng C， Liu Y， et al. The study of ginger-derived extracellular vesicles as a natural nanoscale drug carrier and their intestinal absorption in rats［J］. AAPS Pharm Sci Tech，2021，22（6）： 206.

[34] Wang J， Tang W， Yang M， et al. Inflammatory tumor microenvironment responsive neutrophil exosomes-based drug delivery system for targeted glioma therapy［J］. Biomaterials，2021，273： 120784.

[35] Zhang X， Han C， Du B， et al. Isolation and identification of adipose stem cell exosomes and the study of its potential as drug delivery carrier in vitro ［J］. Appl Biochem Biotechnol，2022，194（6）： 2594-2603.

[36] Zhao J, Li Y, Jia R, et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes as dexamethasone delivery vehicles for autoimmune hepatitis therapy[J]. Front Bioeng Biotechnol,2021,9:650376.

[37] 李美乐,赵梓粤,金凯,等. 装载人参皂苷Rh2外泌体的制备及其对肝癌细胞株Huh7、PLC半数抑制浓度测算[J]. 山东医药,2024,64(9):33-36.

[38] Li M, Zhao Z, Jin K, et al. Preparation of ginsenoside Rh2-loaded exosomes and estimation of IC50 on hepatoma cell lines Huh7 and PLC[J]. Shandong Med. J,2024,64(9):33-36.

[39] Yang X, Xie B, Peng H, et al. Eradicating intracellular MRSA via targeted delivery of lysostaphin and vancomycin with mannose-modified exosomes[J]. J Control Release,2021,329:454-467.

[40] Han D, Wang K, Zhang T, et al. Natural killer cell-derived exosome-entrapped paclitaxel can enhance its anti-tumor effect[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2020,24(10):5703-5713.