基于代谢组学和网络药理学探讨二至丸治疗LPS诱导小鼠肝炎的药效物质及机制研究

Active components and mechanism of Erzhi pills in treating LPS‑induced hepatitis in mice based on metabolomics and network pharmacology

摘要

目的 探究二至丸治疗肝炎的药效物质基础及作用机制。 方法 将39只C57BL/6J小鼠随机分为空白组（Control）、模型组（脂多糖，LPS）和二至丸组（EZP），采用腹腔注射脂多糖（LPS）复制肝炎小鼠模型，利用全自动生化仪对小鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平进行测定；通过酶联免疫吸附法（ELISA）对小鼠肝组织中肿瘤坏死因子α（TNF‑α）和白细胞介素‑1β（IL‑1β）的表达水平进行检测；HE染色观察肝脏组织形态。UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS检测二至丸的入肝成分；非靶向代谢组学检测各组小鼠肝脏组织差异代谢产物；网络药理学预测二至丸入肝成分的潜在靶点与通路。 结果 与Control组比，LPS组小鼠的血清ALT和AST水平显著增高，肝组织TNF‑α和IL‑1β水平增高，肝小叶结构异常，出现大量炎性细胞浸润，LPS组小鼠给予二至丸干预后，可有效逆转上述指标。液质联用分析共鉴定出木犀草素、芹菜素和阿魏酸等24个入肝成分；肝脏代谢组学筛选出ADP、谷氨酸和谷胱甘肽等31个差异代谢物，主要富集到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢和谷胱甘肽代谢等6条代谢通路；网络药理学预测得到二至丸入肝成分与肝炎的交集靶点303个，PPI网络筛选得到22个核心靶点，涉及HIF‑1、PI3K‑Akt、MAPK等信号通路。 结论 该研究初步揭示了二至丸的药效物质基础，及其改善LPS诱导小鼠肝炎的作用机制，为进一步深入研究提供了基础。

Abstract

Objective To explore the active components basis and mechanism of Erzhi pills in treating hepatitis. Method 39 C57BL/6J mice were randomly divided into blank group （Control）， model group （LPS） and Erzhi pills group （EZP）. Lipopolysaccharide （LPS） was injected intraperitoneal to replicate the hepatitis mouse model. The levels of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in serum of mice were measured by automatic biochemical instrument. The expression levels of tumor necrosis factor α （TNF‑α） and interleukin‑1β （IL‑1β） in mouse liver were determined by enzyme‑linked immunosorbent assay （ELISA）. The liver morphology was observed by HE staining. UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS was used to detect the hepatic components of Erzhi pills. Metabolomics was used to detect different metabolites in liver tissue of mice in each group. Network pharmacology predicted the potential target and pathway of the hepatic components of Erzhi pills. Result Compared with the Control group， ALT and AST levels in the serum， TNF‑α and IL‑1β levels in liver tissue were increased significantly in LPS group， the structure of liver lobules was abnormal， and a large number of inflammatory cells were infiltrated. After the intervention of Erzhi pills in LPS group， the above indexes could be reversed effectively. A total of 24 components such as luteolin， apigenin and ferulic acid were identified by LC‑MS. 31 different metabolites of ADP， glutamic acid and glutathione were identified by liver metabolomics， and 6 metabolic pathways were mainly concentrated in phenylalanine， tyrosine and tryptophan biosynthesis， phenylalanine metabolism and glutathione metabolism. Network pharmacology predicted 303 intersection targets of Erzhi pills and hepatitis， and 22 core targets were identified by PPI network screening， involving HIF‑1， PI3K‑AKT， MAPK and other signaling pathways. Conclusion This study preliminarily revealed the pharmacodynamic material basis of Erzhi pills and its mechanism of improving LPS‑induced hepatitis in mice， which provided a basis for further research.

Graphical abstract

关键词

二至丸 / 肝炎 / UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS / 药效物质 / 网络药理学 / 非靶向代谢组学

Key words

Erzhi pills / Hepatitis / UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS / Active components / Network pharmacology / Non‑targeted metabolomics

肝脏是人体重要的活性代谢器官，负责调节物质代谢、解毒、防御和免疫等多种功能，肝脏炎症往往与这些功能的受损有关^［1］。在日常生活中，很多患者由于长期生活不规律导致抵抗力下降，不经意间受到外界干扰可能会引发肝炎，如果不及时干预，有可能演变成严重的肝病，如肝硬化和肝癌，这些都是对人类健康构成威胁的主要原因。故针对早期肝炎的预防或治疗可有效改善患者健康^［2］。在缺乏可靠的现代保肝药物的情况下，开发肝炎治疗的新药、探索新的治疗靶点，对人类卫生保健具有重要意义^［3］。

二至丸由女贞子和墨旱莲（1∶1）组成，方中女贞子，甘苦而凉，善能滋补肝肾之阴；旱莲草，甘酸而寒，亦能补养肝肾之阴，又凉血止血。两者药性皆平和，归肝、肾经，能有效滋养肝阴，缓缓滋润肝脏，而不滋腻，故成平补肝肾之良剂^［4，5］。现代药理研究表明，二至丸多用于治疗和预防各种慢性肝病，如慢性肝炎、酒精性肝炎、酒精性肝硬化和中毒性肝硬化^［6］。多项研究显示，二至丸可通过增强抗氧化防御系统和激活TSC/mTOR信号通路改善炎症反应发挥对实验性肝损伤模型小鼠的保肝作用^［7］；二至丸提取物可以通过抑制PI3K‑Akt通路来抑制肝癌细胞的增殖，从而起到抗肝癌的作用^［8］。然而，这些研究仍然集中于二至丸的药理学研究，未对其药效活性成分进行探讨，故本研究深入研究其入肝活性成分，再结合代谢组学和网络药理学，从有效成分、代谢物、靶点3个方面，探讨二至丸治疗肝脏疾病的具体药效物质基础及作用机制，为二至丸的临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性SPF级C57BL/6J小鼠39只，体重（18~22） g，均购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019‑0010。在温度（23±3）℃，相对湿度（50±10）%，12 h光暗循环条件下自主进食饮水。所有实验操作均得到中国医学科学院药用植物研究所云南分所动物伦理委员会的批准（2023005）。

1.1.2 药材及试剂

女贞子（酒）（Ligustrum lucidum Ait.）、墨旱莲（Eclipta prostrata L.）饮片均购于哈尔滨市北京同仁堂，并且经黑龙江中医药大学陈效忠副教授进行鉴定，符合2020版《中国药典》的规范要求；脂多糖（LPS）（德国SIGMA公司，批号：L2880）；苏木素‑伊红（hematoxylin‑eosin，HE）染液（北京索莱宝科技有限公司，批号G1120）；谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）试剂片（美国IDEXXG公司）；肿瘤坏死因子‑α（Tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）和白细胞介素‑1β（Interleukin‑1β，IL‑1β）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（江苏酶标生物科技有限公司，批号：MB‑2868B、MB‑2776B）；色谱甲醇、乙腈（美国Honeywell公司，批号：UN1230、UN1648）；色谱甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号F112034）。

1.1.3 仪器

VetTest8008全自动生化分析仪（美国IDEXXG公司）；LC‑40D X3高效液相色谱仪（上海岛津公司）；X500 Q‑TOF质谱仪（美国AB SCIEX公司）；SepctraMax i3高通道多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Sigma 1‑14高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）；GEMINIAS自动染色机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DP43荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组、给药及造模

适应性喂养1周后，将小鼠按体重随机分为空白组（Control组）、模型组（LPS组）和二至丸组（EZP组），每组13只。EZP组灌胃给予二至丸药液2.43 g/kg，Control组与LPS组小鼠给予等体积的双蒸水，连续14 d。末次给药后2 h后，Control组腹腔注射生理盐水，EZP和LPS组小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg建立肝炎模型。腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠，眼眶取血处死小鼠并收集肝脏样本。血液静置2 h后4 ℃ 3 500 r/min离心10 min，收集血清保存备用；部分肝脏在4%多聚甲醛中固定以进行组织病理实验；其余组织在液氮中速冻并在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 血清及肝脏生化指标检测

使用全自动生化分析仪来检测血清中ALT、AST水平。取肝脏组织解冻后称重，低温制成匀浆液，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min后取上清液，按照ELISA试剂盒说明书来测定肝组织中TNF‑α和IL‑1β水平。

1.2.3 肝脏组织病理检测

将固定24 h以上的肝组织脱水、包埋、切片，利用自动染色机进行HE染色，在显微镜下观察肝脏病理变化。

1.2.4 肝组织二至丸成分分析

1.2.4.1 供试品溶液制备

将适量二至丸药液加70%的甲醇溶液稀释10倍，超声15 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，得到二至丸体外样品溶液。取模型组和二至丸组肝脏组织解冻后称重，低温加入4 倍体积的0.1%甲酸水匀浆，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，取上清液，使用氮吹仪4 ℃蒸干，加入200 μL 0.1%甲酸乙腈复溶，涡旋3 min，4 ℃ 13 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 µm微孔滤膜，即得二至丸体外和体内样品溶液。

1.2.4.2 色谱条件

Waters色谱柱UPLC HSS T3（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）‑0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱：0 ~ 8 min，5%~20% B；8~25 min，20%~60% B；25~ 35 min，60%~90% B；35~37 min，90%~5% B；37 ~42 min，5% B；柱温为30 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL。

1.2.4.3 质谱条件

ESI离子源，正负离子检测模式；扫描范围m/z 50 ~ 1 500 Da，ESI喷雾电压（+）5 500 V，（-）4 500 V；雾化气（Gas1）和辅助气（Gas2）压力均为50 psi（1 psi ≈ 6.895 kPa）；气帘气（CUR）压力为30 psi，锥孔电压（DP）为80 V，一级质谱碰撞能量（CE）为10 V，二级质谱CE为35 V，碰撞能量范围（CES）为15 V。

1.2.4.4 数据处理

利用Analysis Base File Converter软件转换为abf格式后导入MSDIAL软件进行峰识别、峰对齐、峰提取、标准化处理。成分鉴定使用msp库Natural Products（https：//mona.fiehnlab.ucda vis.edu/downloads）。以模型组峰面积为零，二至丸组峰面积为正值，同时二至丸药液峰面积大于0的原则筛选得到潜在的入肝成分列表。将化合物的保留时间、元素组成、精确分子质量、同位素丰度和一级质谱图（误差5 ppm）、二级质谱图（误差10 ppm）等信息作为鉴定依据，并进一步将上述信息与文献、自建库、MS FINDER软件等方法比对鉴定二至丸入肝成分。

1.2.5 肝脏代谢组学分析

1.2.5.1 肝脏样本制备

将肝脏组织解冻后称重20 mg，加入400 μL混合液（乙腈∶甲醇∶水 = 2∶2∶1），超声15 min，-20 ℃静置1 h，4 ℃ 13 000 r/min离心15 min取上清液，使用氮吹仪4 ℃蒸干，加入乙腈∶水（1∶1）200 μL复溶，涡旋混合3 min，4 ℃ 13 000 r/min离心15 min取上清液，4 ℃保存备用。取各样本10 μL进行混合，制成QC样本，各样本过0.22 µm微孔滤膜，即得二至丸代谢组学样品溶液。在样品分析时，每进5针样品进1针QC样品，以检验系统的稳定性。

1.2.5.2 色谱条件

Waters色谱柱UPLC HSS T3（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）‑0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱：0~2 min，5%~10% B；2~4 min，10%~20% B；4~10 min，20%~35% B；10~11 min，35%~65% B；11~13 min，65%~95% B；13~13.1 min，95%~5% B；13.1~14.5 min，5% B；柱温为30 ℃，流速为0.3 mL/min，进样量为5 μL。

1.2.5.3 质谱条件

质谱条件同“1.2.4.3”。

1.2.5.4 数据处理

质谱数据处理同1.2.4.4，得到代谢物的初步鉴定结果，代谢物鉴定使用msp库LC‑MS/MS Positive Mode、LC‑MS/MS Negative Mode。采用MetaboAnalyst数据库（https：//www.metaboanalyst.ca/）对数据进行多元统计分析，包含正交偏最小二乘法判别分析（OPLS‑DA），将VIP>1，P<0.05的代谢物作为潜在差异代谢物，根据二级质谱、文献信息，HMDB数据库（https：//hmdb.ca/）进行综合筛选和鉴定，最终筛选出差异代谢产物。

1.2.6 网络药理学分析

1.2.6.1 二至丸成分靶点筛选

将1.2.4项下得到的化学成分导入TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/）、ETCM数据库（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）、SwissTargetPrediction 数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）、Pharmmapper数据库（https：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），获取二至丸入肝成分的靶点信息。

1.2.6.2 肝炎相关靶点筛选

以“Hepatitis”为关键词在OMIM数据库（https：//www.omim.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）中搜集肝炎相关靶点，汇总各数据库靶点并剔除重复值，得到肝炎相关的靶点。

1.2.6.3 二至丸入肝成分抗肝炎靶点预测

利用欧易云平台（https：//cloud.oebiotech.com/）构建二至丸入肝成分和肝炎靶点的韦恩图，获得二至丸入肝成分抗肝炎的靶点。

1.2.6.4 二至丸入肝成分与肝炎核心蛋白相互作用网络（PPI）的构建

将1.2.6.3项下的交集靶点提交至STRING数据库（https：//string-db.org/）以建立PPI网络，将生物种类设定为Homo sapiens，并将最小互相作用阈值设定为“medium confidence”（>0.4），其余设置均为默认，删除无联系的靶点后得到PPI网络。通过CytoScape 3.7.0软件中的插件CytoNCA筛选大于平均值的潜在关键靶点。

1.2.6.5 GO功能与KEGG通路富集分析

将1.2.6.3项下得到的交集靶点导入欧易云平台进行GO功能和KEGG通路富集分析，获得二至丸中入肝成分治疗肝炎的主要生物学过程和关键通路。

1.2.6.6 代谢组学与网络药理学关联分析

将1.2.5项下得到的差异性代谢物和1.2.6.3项下得到的交集靶点上传MetaboAnalyst 数据库，利用Network analysis模块，将代谢物与靶点关联，并构建代谢物‑基因网络。将网络导入Cytoscape 3.7.0软件中进行美化。

1.3 统计分析

用SPSS 24.0软件对所有数据进行处理，数据以（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两样本比较采用LSD检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 二至丸对各组小鼠肝功能的影响

结果如图1所示，与Control组比较，LPS组小鼠肝功能指数ALT、AST显著升高（P<0.01），提示肝细胞受损，肝功能出现障碍；与LPS组比较，EZP组小鼠肝功能指数ALT、AST显著降低（P<0.01）。

2.2 二至丸对各组小鼠肝脏组织病理的影响

结果如图 2所示，Control组小鼠肝脏细胞形态完整排列整齐呈放射状，无明显病理改变；LPS组小鼠肝脏细胞排列紊乱，肝小叶结构异常，有大面积空泡，出现大量炎症细胞浸润；而EZP组小鼠肝脏细胞结构损伤明显减轻，空泡数量及炎症浸润细胞较LPS组明显减少，表明二至丸可明显减轻LPS诱导的小鼠肝细胞损伤和肝脏炎症。

2.3 二至丸对各组小鼠肝组织TNF‑α和IL‑1β表达水平的影响

结果如图 3所示，与Control组相比，LPS组小鼠肝脏组织TNF‑α和IL‑1β表达水平显著升高（P<0.01）；与LPS组相比，EZP组小鼠肝脏组织TNF‑α和IL‑1β表达水平显著降低（P<0.05）。

2.4 肝脏组织二至丸成分分析

通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用（UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS）技术在正、负离子模式下对二至丸体内外样品进行分析，共鉴定出24个入肝成分，结果见表 1，二至丸体内外样品溶液总离子流图，见图4。

2.5 代谢组学数据分析

2.5.1 QC样本总离子流图

采用QC样本总离子流叠加图对系统稳定性进行评价，样品物质出峰的保留时间和峰面积基本重叠，表明实验仪器稳定性良好，见图 5。

2.5.2 多变量统计分析

利用MetaboAnalyst平台进行多元统计分析，探究二至丸改善LPS诱导肝炎的过程中，小鼠肝脏组织代谢变化。OPLS‑DA结果如图 6所示，Control组与LPS组、EZP组与LPS组之间分离明显，聚合度较好，表明Control组与LPS组、EZP组与LPS组之间差异代谢产物明显。通过200次置换检验，Control与LPS相比，R²Y＝0.98，Q²＝0.886，EZP与LPS组相比，R²Y＝0.942，Q² ＝0.864，表明模型具有良好的拟合度和预测能力，且不存在过拟合现象，反映造模成功。

2.5.3 差异代谢物筛选及鉴定

最终筛选出二至丸干预后的内源性差异代谢物共31个，其中二至丸干预后上调17个，下调14个，见表 2。

2.5.4 差异代谢物通路富集分析

将上述2.5.3项下鉴定得到的31个差异代谢物导入MetaboAnalyst平台，进一步以impact value>0.01，P<0.05进行筛选，得到6条代谢通路，结果如图 7所示，提示二至丸可能主要通过氨基酸、谷胱甘肽代谢途径发挥治疗肝炎的作用。

2.6 网络药理学分析

2.6.1 二至丸入肝成分及差异代谢物抗肝炎靶点预测

利用数据库共获得二至丸入肝成分靶点587个；肝炎相关疾病靶点2 996个。合并交集靶点共303个，见图 8。

2.6.2 PPI网络构建图

利用STRING在线平台工具获得291个基因的PPI网络。利用CytoNCA插件计算每个基因的degree、eigenvector、betweenness和closeness值，首先根据degree大于均值，进行第1次筛选，由291个筛选至109个；接着对剩下3个参数以均值进行第2次筛选，得到22个核心靶点，最后按degree值从大到小排列，图案颜色越深则表示degree越大，流程见图 9。因此，二至丸抗肝炎的潜在核心靶点为：TP53、IL6、STAT3、AKT1、CTNNB1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、IL1B、BCL2、INS、GAPDH、CASP3、ESR1、HIF1A、ALB、TLR4、PTGS2、CXCL8、ERBB2和PPARG。

2.6.3 GO和KEGG通路富集分析

GO富集的生物过程（biological process，BP）涉及异生物代谢过程、蛋白质磷酸化、对细胞凋亡过程的负调控等；细胞组分（cellular component，CC）涉及受体复合物、细胞质、膜筏等；分子功能（molecular function，MF）涉及酶结合、ATP结合、核受体活性等；分别取 BP、CC和MF前10项进行可视化（图10，A）。将KEGG结果分为两个模块。在代谢模块中富集的多条通路与代谢组学富集的通路相同，如精氨酸的生物合成、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢、酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、嘌呤代谢等（图10，B）；环境信息处理模块中富集了HIF‑1信号通路、PI3K‑Akt信号通路、MAPK信号通路等（图10，C）。

2.6.4 代谢组学与网络药理学整合分析

为全面了解二至丸抗肝炎机制，故基于上述代谢组学和网络药理学的结果构建相互作用网络（图 11）。从该网络中发现了SRC、PTGS2、AKT1、GAPDH、IL6、PPARG、MAPK3、GSK3B等10种关键靶点，ADP、亚油酸、腺苷、谷胱甘肽、FAD、L‑谷氨酰胺、L‑亮氨酸等11种关键代谢产物。

3 讨论

LPS是革兰氏阴性细菌外壁中的一种特有成分，能激活自身免疫系统，促进TNF‑α和IL‑1β等炎症因子的释放，对于肝炎发生、发展具有重要作用^［9］。故本实验采用LPS复制肝炎模型，具体方法参考文献^［10］。ALT与AST主要分布在肝细胞内，小部分分布于肌肉细胞内。当肝脏受损时，肝细胞中的转氨酶便释放进入血液，使得血液中ALT和AST水平升高，故临床将其作为特异性指标提示肝细胞的损伤情况^［11］。在本研究中，与Control组相比，LPS组小鼠血清中转氨酶（ALT、AST）和促炎因子（TNF‑α、IL‑1β）水平显著增高，表明肝炎小鼠模型构建成功；与LPS组相比，EZP组小鼠血清和肝组织中转氨酶（ALT、AST）和促炎因子（TNF‑α、IL‑1β）水平均有不同程度降低，表明二至丸可有效改善LPS小鼠肝脏炎症。肝炎病理通常表现为肝小叶结构异常，有大面积空泡变性，HE染色结果显示，相较于LPS组，EZP组小鼠肝脏结构较为完整，空泡数量明显减少。以上结果表明，在LPS诱导的肝炎小鼠模型中，二至丸可对肝脏炎症有明显改善作用，故在二至丸有效的情况下，进行深入研究。

UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS技术为中药成分的高效分离和结构表征提供了一种强大的方法，已被广泛应用于中药药效物质基础、入血成分分析以及代谢组学等研究^{［12，13］}。因此，本实验利用UPLC‑Q‑TOF‑MS/MS技术，共鉴定出24个二至丸的入肝成分，包括木犀草素、芹菜素、特女贞苷、大豆苷元、芦丁和阿魏酸等，均可缓解肝脏炎症^{［14‑20］}。有研究显示，木犀草素、芹菜素可以通过调节炎症反应减轻肝损伤，还可通过增加核因子红细胞介素2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2， Nrf2）核转位以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators‑activated receptors γ，PPARγ）等蛋白的表达来改善D‑半乳糖胺/脂多糖诱导的急性肝炎^{［14，15］}。大豆苷元可以通过Akt/GSK3β/Nrf2通路减轻刀豆蛋白A诱导的肝损伤^［17］。阿魏酸作为植物性食物中的主要化学成分可通过抑制MAPK和NF‑κB/IκBα信号通路改善四氯化碳诱导的肝脏损伤^［20］。上述研究与网络药理学的预测结果一致，这表明二至丸中有效成分可以通过MAPK、PPARγ、Akt等靶点在预防和治疗肝炎中起到关键作用。

代谢组学可以系统地鉴定内源性小分子代谢物，是系统生物学的组成部分，有助于在代谢水平上理解疾病发生和发展背后的机制^［21］。本研究发现了苯丙氨酸、谷胱甘肽代谢和磷酸戊糖途径等6条主要代谢通路。有多项相关研究表明，当肝细胞受到损伤时，芳香族氨基酸分解途径减慢，肝内苯丙氨酸水平增高^{［22，23］}。本研究结果表明，二至丸可以明显降低肝内苯丙氨酸水平，调控其代谢紊乱。此外，影响谷胱甘肽合成的酶在肝受损时同样受到抑制，导致γ‑谷氨酰半胱氨酸过度积累，γ‑谷氨酰环转移酶可将其转化为焦谷氨酸，使得焦谷氨酸水平增高^［24］。有研究表明，肝脏疾病、酗酒等引起的谷胱甘肽缺乏症相关病例中患者肝脏内高水平的焦谷氨酸，可引起高阴离子间隙代谢性酸中毒，加重肝脏损伤^{［25，26］}。代谢组学结果提示，二至丸可以通过改善肝脏代谢紊乱治疗肝炎。

网络药理学将系统网络与药理学相结合，将中药成分与靶点联系起来，从而系统地揭示药物小分子‑疾病机制的调控原理^［21］。网络药理学分析发现多个靶点，其中PTGS2为抗炎通路关键靶点。环氧合酶2（Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2，PTGS2）在前列腺素类化合物的生物合成途径中具有双环氧合酶和过氧化物酶活性，是炎症的关键指标，参与脂肪酸、脂质和前列腺素的制造和代谢，其可以通过前列腺素E受体1加速LPS诱导的肝损伤^{［27，28］}。网络药理学结果提示，二至丸中的木犀草素、芹菜素等活性成分能够直接作用于PTGS2，通过下调炎症指标和抑制促炎细胞因子（IL‑6、TNF‑α和IL‑1β）释放发挥肝脏保护作用。

综上所述，本研究旨在探讨二至丸抗肝炎的药效物质基础及潜在作用机制，通过体内外成分分析、代谢组学和网络药理学技术，推测二至丸24个活性成分可能通过作用于PTGS2、MAPK1、AKT和PPARG等靶点调节代谢紊乱发挥对肝炎的治疗作用。为进一步探究二至丸抗肝炎的具体机制提供了依据和思路，也为传统中药复方的现代化研究提供了参考。

作者贡献度说明：

李雪：参与实验研究、数据分析及论文撰写；李光、薛傲：对文章的知识性内容作批评性审阅；杨萌、赵红梅、赵灿：协助完成实验实施，采集及分析数据；任毅帆：相关文献搜集与整理；张亚峰、张宁：研究设计构思、文章修改审阅、项目经费资助。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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