基于网络药理学、分子对接和细胞实验探讨高粱泡叶醇提物抗炎的作用机制

Exploring the anti‑inflammatory mechanism of action of Rubus lambertianus leaf ethanol extract based on network pharmacology, molecular docking and cellular experiments

摘要

目的 基于网络药理学、分子对接及细胞实验验证探讨高粱泡叶醇提物（AELR）抗炎的疗效及作用机制。 方法 采用超高效液相色谱‑高分辨四极杆轨道阱质谱（UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS）技术分析AELR的化学成分，通过SwissADME平台筛选AELR化学成分，再用SwissTargetPrediction数据库检索潜在靶点；OMIM、GeneCards、TTD数据库检索疾病靶点；Venny2.1平台得到“成分‑疾病”交集靶点，并构建蛋白质‑蛋白质相互作用（protein‑protein interaction，PPI）网络；利用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能及KEGG信号通路富集分析；用AutoDock等软件对关键活性成分和核心靶点进行分子对接验证；最后，采用LPS诱导RAW264.7细胞构建体外炎症模型，通过Griess、ELISA以及流式细胞仪法检测细胞上清液相关炎症因子水平，RT‑PCR、Western blot技术检测细胞相关蛋白mRNA和信号通路蛋白表达。 结果 UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS共鉴定出56种化合物；网络药理学筛选得到21种AELR活性成分及419个靶点，炎症疾病靶点1 923个，交集靶点187个，其中IL‑1B、AKT1、STAT3、EGFR、PTGS2为核心靶点，与石吊兰素、木犀草素、异泽兰黄素、苜蓿素、棕矢车菊素活性成分分子对接结果良好；GO和KEGG分析发现，AELR抗炎可能通过PI3K/AKT、MAPK、NF‑κB信号通路转导。体外细胞实验表明，与模型组比较，AELR能显著降低细胞上清液中的NO、IL‑6、TNF‑α以及细胞内ROS水平含量（P<0.01）；显著降低细胞COX‑2、IL‑6、TNF‑α、IL‑1β mRNA表达（P<0.01），COX‑2（P<0.01）蛋白表达下调，p‑p65/p65、p‑IκBα/IκBα、p‑JNK/JNK、p‑ERK/ERK、p‑Akt/Akt蛋白表达比值均降低（P<0.01）。 结论 AELR具有抗炎作用，其抗炎作用机制可能是通过多成分和多靶点来抑制NF‑κB、MAPK及Akt信号通路的蛋白表达。

Abstract

Objective To explore the anti‑inflammatory efficacy and mechanism of action of Rubus lambertianus leaf ethanol extract （AELR） based on network pharmacology，molecular docking and cellular experimental validation. Methods The chemical composition of AELR was analyzed by ultra‑high performance liquid chromatography coupled with high‑resolution quadrupole orbit trap mass spectrometry（UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS）.The AELR chemistry was screened by SwissADME platform and then the SwissTargetPrediction database was used to retrieve potential targets；OMIM，GeneCards，and TTD databases were used to search for disease targets；Venny2.1 platform was used to obtain“component‑disease”intersection targets and construct protein‑protein interaction （PPI） networks；GO function and KEGG signaling pathway enrichment analysis of intersecting targets were conducted using the DAVID database；Molecular docking validation of key active ingredients and core targets was performed using software such as AutoDock；Finally，an in vitro inflammation model was constructed using LPS‑induced RAW264.7 cells.The levels of cell supernatant‑associated inflammatory factors were detected by Griess，ELISA，and flow cytometry，and cell‑associated protein mRNA and signaling pathway protein expression were detected by RT‑PCR and Western blot techniques. Results A total of 56 compounds were identified by UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS；21 AELR active ingredients and 419 targets were obtained by network pharmacological screening，with 1 923 inflammatory disease targets and 187 intersecting targets，among which IL‑1B，AKT1，STAT3，EGFR，PTGS2 were the core targets，and the molecular docking results with the active ingredients of stigmasterol，lignoceroside，isoxanthin，brown cornflower，cloverberry Xanthin，brown cornflower，alfalfa active ingredient molecular docking results were good；GO and KEGG analyses revealed that AELR anti‑inflammatory may be transduced through PI3K/AKT，MAPK，and NF‑κB signaling pathways.In vitro cellular experiments showed that AELR significantly reduced NO，IL‑6，TNF‑αand intracellular ROS levels in cell supernatants compared with the model group（P<0.01），significantly reduced cellular COX‑2、IL‑6、TNF‑α、IL‑1β mRNA expression reduction（P<0.01），and significantly down‑regulated p‑p65/p65、p‑IκBα/IκBα、p‑JNK/JNK、p‑ERK/ERK、p‑Akt/Akt protein expression（P<0.01）. Conclusion AELR has anti‑inflammatory effects，and its anti‑inflammatory mechanism of action may be inhibition of the protein expression of NF‑κB，MAPK and Akt signaling pathways through multiple components and targets.

Graphical abstract

关键词

高粱泡叶 / 抗炎 / 网络药理学 / UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS / 作用机制

Key words

Rubus lambertianus leaf / Anti‑inflammatory / Network pharmacology / UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS / Mechanism of action

炎症是一种常见的机体抵御外界刺激的病理反应。当机体损伤时，炎症会引起巨噬细胞释放促炎因子（如：NO、COX‑2、IL‑6、IL‑1β，TNF‑α），从而杀灭病原体，但过度炎症也会诱发很多疾病（如癌症、Ⅱ型糖尿病、关节炎等）。炎症的发生与复杂的信号通路紧密相连，核因子‑κB（NF‑κB）信号通路在炎症反应中起着核心作用，当受到刺激时，该通路被激活，促使多种炎症因子的表达，引发一系列免疫反应。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路也参与炎症调控，影响细胞的增殖、分化和凋亡等过程。目前抗炎药主要包括抗生素、甾体和非甾体类药物，但是这些药物存在耐药性、副作用和药物残留等问题^［1］。因为植物提取的活性物质具有药效温和、耐药性低、毒性低和副作用少等优势，所以寻求天然来源的活性物来抗炎成为研究热点。

高粱泡叶是蔷薇科植物高粱泡（Rubus lambertianus Ser.）的干燥叶。高粱泡叶具有治疗皮肤糜烂、黄水疮、治疗烫伤等作用，可能和其具有抗炎作用有关。前期实验也表明高粱泡叶可能含有多种抗炎活性成分^［2］。目前，关于高粱泡叶醇提物的抗炎活性及作用机制未见报导。本研究采用UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS分析AELR中的化学成分，用网络药理学方法预测其作用机制，并通过体外细胞实验验证AELR的抗炎作用机制，为高粱泡叶的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

高粱泡叶样品采自贵州省贵阳市花溪区元芳村，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为蔷薇科植物高粱泡（Rubus lambertianus）。

1.1.2 试剂

DMEM高糖培养基（购自赛默飞世尔生物化学制品公司，批号8122500）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批号22040703）；IL‑6试剂盒（联科生物，批号EK282/4‑01）；TNF‑α试剂盒（睿信生物科技有限公司，批号RX‑G202412M）；LPS、ROS检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物有限公司，批号011722220615、S0033、P0012）；小鼠单克隆抗体β‑actin（三鹰生物技术有限公司，批号66009‑1‑Ig）；兔多克隆抗体ERK、P‑ERK、JNK、P‑JNK、P65、P‑P65（Affinity公司，批号AF0155、AF1015、AF6318、AF3318、AF5006、AF2006）；兔多克隆抗体COX‑2、Akt、p‑Akt（万类生物有限公司，批号WL01750、WLP001a、WL003b）；HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号BA1051、BA1054）；ECL底物液（北京普利莱基因技术有限公司，批号P1050）；其余均为分析纯，水为超纯水。

1.1.3 仪器

二氧化碳培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，BPN‑80CH）、PCR仪（杭州米欧仪器有限公司，PR‑96）、酶标仪（赛默飞世尔科技公司，mμlISKANMK3），VILBER Fusion FX7Spectra 凝胶成像系统（北京五洲东方科技发展有限公司），电泳仪、电转仪（北京六一仪器厂，DYY‑7C、DYCZ‑40），DYCZ‑40），水平摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS‑1），流式细胞仪（Beckmancoulter，cytoFLEX）。

1.1.4 细胞株

小鼠RAW264.7巨噬细胞株购自ATCC。

1.2 AELR样品的制备

称取高粱泡叶粉末（过60目筛）100.0 g，料液比1∶10，40%乙醇90 ℃回流提取2次，每次1.5 h，抽滤，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，即得AELR，备用。

1.3 UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS检测

1.3.1 供试品的制备

称取AELR样品100 mg置于2 mL离心管中，加入70%甲醇，用全自动样品快速研磨仪震荡破碎3 min，冷却后低温超声10 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，取上层清液稀释2~100倍，过0.22 μm微孔滤膜后进样。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1 mm×100 mm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）‑乙腈（B）；梯度洗脱（0~2 min，5% B；2~6 min，5~30% B；6~7，30% B；7~12 min，30%~78% B；12~14 min，78% B；14~17 min，78%~95% B；17~20 min，95% B）柱温为30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量为2 μL。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；正/负离子模式；喷雾电压3.5 kV；毛细管温度330 ℃；鞘气：45 arb；辅助气：15 arb；扫描离子范围100~1 500 m/z；分辨率Full Scan模式为：120 000；dd‑MS2模式为：60 000；碰撞模式：高能量碰撞解离（HCD）。

1.3.4 化学成分鉴定

根据其相对分子质量和一级、二级质谱碎片离子结合zmAaul本地谱库、mz‑Cloud云谱库及相关文献、色谱峰对应的化合物定牲分析，鉴定高粱泡叶40%醇提物的相关化学成分。

1.4 网络药理学分析

1.4.1 成分靶点与疾病靶点的获取

AELR通过UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS分析得到56个化合物，导入SwissADME平台预测，筛选同时满足胃肠吸收“High”、类药五原则中有≥4个“Yes”的化合物为活性成分，在SwissTargetPrediction数据库中收集各活性成分靶点，使用Cytoscape3.10.1构建“药物‑有效成分‑靶点”网络图。在GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库中检索炎症（Inflammation）疾病基因靶点。利用Venny2.1.0平台对活性成分靶点与炎症疾病靶点取交集，得到AELR治疗炎症的潜在靶点。

1.4.2 蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将交集靶点导入STRING数据库，选择“multiple proteins”模式，蛋白种属设置为“Homo sapiens”、置信度>0.4，构建PPI网络，使用Cytoscape 3.10.1软件进行可视化处理。

1.4.3 GO功能和KEGG信号通路分析

将交集靶点导入DAVID数据库，选择物种“Homo sapiens”，以P≤0.01和FDR≤0.05为标准，进行GO功能和KEGG信号通路分析，并使用微生信进行可视化。

1.4.4 分子对接分析

选取AELR度值排名前5的活性成分为配体，PPI网络中度值前5个关键靶点作为受体进行分子对接。通过PubChem数据库下载活性成分3D结构sdf格式文件，导入Chen 3D软件将分子能力最小化，并保存为mol2格式；从PDB数据库筛选下载靶点蛋白结构。运用AutoDock软件对配体和受体进行处理，保存pdbqt格式，使用AutoDock Vina进行分子对接，PyMOL进行可视化处理。

1.5 细胞实验

1.5.1 MTT法检测细胞活性

取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中，培养24 h后弃上清液。分别加入含AELR（100、200、400、600、800、1 000 μg/mL）、LPS（0.312、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL）的培养基100 μL，孵育24 h后，每孔加入30 μL MTT溶液，孵育4 h，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，于酶标仪490 nm处测定吸光度，并计算抑制率。

1.5.2 Griess法和ELISA法检测细胞上清液中NO、IL‑6、TNF‑α水平

取对数生长期的RAW264.7细胞，接种于6孔板中，培养24 h后弃上清液。实验分为空白对照组（完全培养基）、模型组（含1 μg/mLLPS培养基）、AELR低、中、高剂量组（含0.25、0.5、1 mg/mLAELR和1 μg/mLLPS培养基），培养24 h后，收集各组上清液，1 500 r/min离心15 min，采用Griess法测定NO浓度，ELISA法测定IL‑6和TNF‑α浓度。

1.5.3 流式细胞仪检测细胞内ROS水平

按“1.5.2”项下方法培养细胞及分组，培养24 h后，制成单细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清，用PBS润洗2次。每孔加入1 mL DCFH‑DA（1∶1 000稀释）工作液，孵育20 min，每隔3 min混匀。用无血清培养基清洗3次，500 μLPBS重悬，进行流式细胞仪检测荧光强度。

1.5.4 RT‑PCR法检测细胞COX‑2、IL‑6、TNF‑α和IL‑1β mRNA的表达

按“1.5.2”项下方法培养细胞及分组，培养24 h后弃去上清液，用PBS洗涤细胞3次，收集细胞，提取总RNA并逆转录为cDNA。按试剂盒说明进行PCR扩增，程序为：95 ℃预变性10 min，循环1次；扩增过程95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次；融解曲线分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，循环1次。引物由擎科生物技术有限公司提供。以β‑actin为内参，结果采用2^‑△△CT法进行数据分析。靶基因引物序列（表1）。

1.5.5 Western blot检测相关蛋白表达

按“1.5.2”项下方法培养细胞及分组，培养24 h后弃上清，用预冷PBS洗涤3次，加入细胞裂解液，在冰上裂解0.5 h，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，在100 ℃变性5 min。样品通过10% SDS‑PAGE电泳分离，以200 mA恒流转膜1.5 h转移至PVDF膜。在5%脱脂牛奶中封闭2 h（磷酸化蛋白用1% BSA），加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。回收一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育2 h，再次TBST洗膜3次，使用ECL显色。以β‑actin为内参，用Image J软件量化条带强度，计算各蛋白灰度值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 26.0、Graphpad Prism9.0软件分析。数据以（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用One‑wayANOVA Dunnet′s检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AELR的UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS分析

根据UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS对AELR分析，共鉴别出56个化合物（表2），包括黄酮类、酚酸类、有机酸类、糖苷类、氨基酸类、萜类等成分。正、负离子模式下的总离子流图（图1）。

2.2 网络药理学预测结果

2.2.1 AELR及炎症相关靶点的获取

AELR通过筛选得到21个符合条件活性成分（表3），经Swiss Target Prediction数据库得到419个活性靶点，用Cytoscape3.10.1软件构建“药物‑活性成分‑靶点”网络（见图2A），网络包含327个节点、746条边。检索GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库得到的疾病靶点筛选、去重后，得到炎症疾病靶点1 923个。活性成分靶点和疾病靶点用Venny2.1.0平台交集分析，得到187个共同靶点（图2B），可能作为AELR抗炎症的潜在作用靶点。

2.2.2 PPI网络的构建及核心靶点的获取

将187个交集靶点导入STRING数据库，下载PPI网络图和tsv文件，得到187个节点和2 960条边，平均节点度为31.7；tsv文件导入Cytoscape3.10.1软件，以度值大小进行排列，其抗炎作用可能与IL1B、AKT1、ATAT3、EGFR、PTGS2等靶点相关，度值大于50的核心靶点构建互作网络（图3）。

2.2.3 GO功能及KEGG通路富集分析

将187个共同靶点导入DAVID数据库进行GO功能和KEGG通路富集分析，以P≤0.01、FDR≤0.05进行筛选；GO功能富集分析共得到441条，生物过程（BP）302条、细胞组成（CC）52条、分子功能（MF）87条，其中生物过程包括ERK1和ERK2级联的正向调节、炎症反应、细胞凋亡过程负调控等，细胞组分包括细胞质核周区、细胞表面、细胞外区域等，分子功能包括蛋白激酶活性、酶结合力、蛋白质结合等（图4A、C）。KEGG分析获得136条信号通路，AELR发挥抗炎作用主要与EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性、TNF信号通路、NF‑κB信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K‑AKT信号通路等相关（图4B、D）。

2.2.4 关键成分与核心靶点的分子对接验证

将筛选出的5个活性成分与5个核心靶点依次进行分子对接，结合能越小，结合活性越好，活性成分与核心靶点结合能均小于-6 kcal/moL，说明各成分与蛋白均能较好地结合（表4）。此外，使用PyMoL软件进行可视化分析，活性成分与核心靶点蛋白可通过氢键作用力结合，形成稳定的结合作用（图5）。

2.3 细胞体外实验结果

2.3.1 AELR和LPS对RAW264.7细胞活性的影响

与对照组相比，AELR浓度为1.2 mg/mL或LPS浓度超过5 μg/mL时，细胞存活率降低（P<0.01）。表明AELR在100~1 000 μg/mL和LPS在0.312~2.5 μg/mL范围内对RAW264.7细胞无抑制作用。因此，本研究选取AELR质量浓度0.25、0.5、1 mg/mL，LPS质量浓度1 μg/mL进行后续实验。见图6。

2.3.2 AELR对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中NO、IL‑6、TNF‑α含量的影响

与空白组相比，模型组细胞上清液中NO、IL‑6、TNF‑α水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，AELR不同剂量干预后细胞上清液中NO、IL‑6、TNF‑α水平显著降低（P<0.01）。表明AELR能抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子水平，且呈剂量依赖性。见图7、表5。

2.3.3 AELR对LPS诱导的RAW264.7细胞内ROS水平的影响

见图8、表6，与空白组相比，模型组细胞中ROS表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，AELR各剂量组细胞中ROS表达水平显著降低（P<0.01），且呈剂量效应。

2.3.4 AELR对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX‑2、IL‑6、TNF‑α和IL‑1β mRNA表达的影响

与空白组相比，模型组细胞中COX‑2、IL‑6、TNF‑α和IL‑1β mRNA表达升高（P<0.01）；与模型组比较，AELR干预后细胞中COX‑2、IL‑6、TNF‑α和IL‑1β mRNA表达显著降低（P<0.01），且呈现出剂量效应。见图9、表7。

2.3.5 AELR对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX‑2及NF‑κB/Akt/MAPK信号通路蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组细胞中COX‑2蛋白表达显著升高（P<0.01），p‑p65/p65、p‑IκBα/IκBα、p‑JNK/JNK、p‑ERK/ERK、p‑Akt/Akt蛋白表达量比值显著升高（P<0.01）；与模型组相比，AELR干预后的COX‑2蛋白表达显著降低（P<0.01），p‑p65/p65、p‑JNK/JNK、p‑ERK/ERK、p‑IκBα/IκBα、p‑Akt/Akt蛋白表达量比值显著降低（P<0.01）。见图10、表8。

3 讨论

炎症是在广泛的有害刺激（如感染、组织损伤和兴奋剂）下发生的一系列反应，是人体一种正常的、自我保护的、高度调节的机制^［30］。过度或慢性炎症会引起癌症、关节炎和神经退行性疾病等多种疾病。巨噬细胞通过分泌细胞因子、趋化因子和炎症介质调控炎症反应，并识别和吞噬病原体及损伤细胞，以及召集其他免疫细胞到炎症部位，促进组织修复。当M1型巨噬细胞受到外界刺激物（LPS）时，TNF‑α、IL‑6和IL‑1β等炎症因子被激活并通过细胞内信号级联激活MAPK、NF‑κB和Akt信号通路，产生炎症细胞因子并调节LPS诱导的巨噬细胞炎症反应^［31］。高粱泡叶具有清热凉血、解毒消疮等功效，但其抗炎作用机制尚不明确，本研究通过网络药理学和体外细胞实验探讨AELR治疗炎症的作用机制。

本研究采用UHPLC‑Q‑Exactive HF/MS技术分析了AELR化学成分，共鉴定出了56种化合物。网络药理学分析得到AELR有21个符合条件的活性成分，筛选得到石吊兰素、木犀草素、异泽兰黄素、苜蓿素以及棕矢车菊素为主要活性成分；PPI网络分析得到AELR治疗炎症的关键靶点主要包括IL‑1B、AKT1、STAT3、EGFR、PTGS2等；GO功能富集分析得到444条，KEGG分析获得137条信号通路，主要涉及NF‑κB、MAPK、PI3K‑AKT等信号通路；AELR中5种活性成分与5个关键靶点分子对接均具有很好结合能力。

在NF‑κB通路中，未激活的NF‑κB与抑制性蛋白IκB共存于细胞浆中。当LPS激活后，RAW264.7细胞生成大量炎性因子（如NO、IL‑6、TNF‑α），IκB被磷酸化并降解，NF‑κB被活化并转移至细胞核内调控基因表达，进一步促使下游联级反应，增强细胞因子及趋化因子表达，加重炎症^{［32，33］}，本研究中AELR干预后，p65/p‑p65、IκBα/p‑IκBα蛋白的表达显著降低，表明AELR能够抑制LPS诱导的巨噬细胞中NF‑κB的异常活化。MAPK信号通路的JNK、和ERK蛋白在细胞炎症应激反应中发挥着重要作用^{［34‑36］}，研究结果表明，AELR显著降低巨噬细胞ERK/p‑ERK、JNK/p‑JNK蛋白的表达，抑制MAPK信号通路，从而发挥抗炎作用。PI3K/Akt/mTOR通路通过限制骨髓吞噬细胞的促炎反应，控制细胞对病原体的反应^［37］，研究结果表明，AELR显著降低p‑Akt蛋白表达。本研究采用LPS诱导RAW264.7细胞构建了体外炎症模型，经AELR干预后，细胞上清液NO、IL‑6、TNF‑α以及细胞内ROS水平均显著降低，细胞中COX‑2、IL‑6、TNF‑α和IL‑1β mRNA基因表达量显著降低，说明了AELR具有较好的抗炎作用，其作用机制可能是通过下调NF‑κB、MAPK及Akt信号通路炎症因子的表达来缓解炎症，和网络药理学预测结果基本一致。

综上所述，本研究采用LC‑MS技术结合网络药理学和体外细胞实验探讨AELR治疗炎症的作用机制，其作用机制可能是降低MAPK、NF‑κB和Akt信号通路的活化水平，抑制COX‑2、IL‑6、TNF‑α和IL‑1β mRNA的表达，减少NO、IL‑6、TNF‑α以及ROS的生成，从而发挥抗炎作用，为进一步研究AELR治疗炎症相关疾病提供依据。

作者贡献度说明：

田孟斌、李旭东：设计实验方案、收集实验数据、分析数据、文章撰写；韦美燕、聂琴、陈汝玲：绘制图表、协助实验、查阅文献、收集资料；吴静澜、韩伟：指导实验、修改论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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