姜黄素调控铁死亡干预帕金森病的网络药理学研究及实验验证

Network pharmacological study and experimental verification of curcumin regulating ferroptosis in Parkinson's disease

摘要

目的 基于网络药理学、分子对接及实验验证，探讨姜黄素（curcumin，Cur）调控铁死亡干预帕金森病（Parkinson's disease，PD）的可能靶标及作用机制。 方法 通过Swiss Target Prediction、SEA等数据库获取Cur作用靶点。通过GeneCards数据库获取PD的治疗靶标。利用Venn在线工具获取共同作用靶点，通过Cytoscape插件获取核心靶点及核心子网络，并通过DAVID数据库进行富集分析及利用微生信平台进行可视化。通过FerrDb数据库获取铁死亡相关基因，并与Cur和PD的共同靶点进行综合探讨，对潜在治疗靶点作出预测。通过鱼藤酮构建C17.2 PD模型；CCK-8法确定Cur最佳浓度；试剂盒检测ROS、GSH、亚铁离子含量及GPx、SOD活性；RT-qPCR检测NFE2L2及NOX4基因表达情况，Western blot检测Nrf2、NOX4蛋白表达水平。 结果 网络药理学预测得到NOX4、NFE2L2等17个Cur调控铁死亡抗帕金森病的可能作用靶标，并介导氧化应激相关信号通路调控铁死亡。体外实验验证，与模型组比较，2.0 μmol/L Cur可降低ROS、亚铁离子含量（P<0.01），升高GSH含量（P<0.01）及GPx、SOD活性升高（P<0.05），抑制NOX4基因及蛋白表达（P<0.05）并促进Nrf2基因及蛋白表达（P<0.05）。 结论 姜黄素可能通过调控Nrf2及NOX4改善鱼藤酮诱导的C17.2细胞的氧化应激及铁死亡状态，实现保护神经干细胞来改善PD的作用。

Abstract

Objective To explore the potential targets and mechanisms by which curcumin regulates ferroptosis in the intervention of Parkinson's disease （PD） based on network pharmacology， molecular docking， and experimental validation. Methods Curcumin targets were obtained using databases such as Swiss Target Prediction and SEA. Therapeutic targets for PD were sourced from the GeneCards database. Common targets were identified using Venn online tools， and core targets and networks were analyzed with Cytoscape plugins. Enrichment analysis was performed using the DAVID database， with visualization via microbioinformatics platforms. Ferroptosis-related genes were retrieved from the FerrDb database. An integrated analysis of common targets among curcumin， PD， and ferroptosis was conducted， predicting potential therapeutic targets. A C17.2 PD model was established using rotenone； the optimal concentration of curcumin was determined via CCK-8 assay. ROS， GSH， ferrous ion levels， and GPx and SOD activities were measured using kits， while RT-qPCR and Western blot analyses assessed NFE2L2 and NOX4 gene and protein expressions， respectively. Results Network pharmacology identified 17 potential targets， including NOX4 and NFE2L2， through which curcumin may regulate ferroptosis in PD by mediating oxidative stress-related signaling pathways. In vitro experiments demonstrated that 2.0 μmol/L curcumin significantly reduced ROS and ferrous ion levels （P<0.01）， increased GSH content （P<0.01）， and enhanced GPx and SOD activities （P<0.05）， while inhibiting NOX4 gene and protein expression （P<0.05） and promoting Nrf2 gene and protein expression （P<0.05）. Conclusion Curcumin may improve oxidative stress and ferroptosis in rotenone-induced C17.2 cells by regulating Nrf2 and NOX4， thereby protecting neural stem cells and improving PD outcomes.

Graphical abstract

关键词

帕金森病 / 姜黄素 / 铁死亡 / 网络药理学 / Nrf2 / NOX4

Key words

Parkinson's disease / Curcumin / ferroptosis / network pharmacology / Nrf2 / NOX4

中老年人多发的以静止性震颤等运动症状为主要临床表现的帕金森病（Parkinson's disease， PD）^［1］，随着社会老龄化程度逐渐加重，预测累计发病率将逐渐增加^［2］。PD的病因及病理、生理学机制复杂，涉及多个方面，以黑质多巴胺能神经元的变性死亡为突出的病理改变。铁依赖性细胞程序性死亡即铁死亡，以铁积聚、脂质过氧化物增高、活性氧（reactive oxygen， ROS）积聚等为特征表现^［3］。研究发现，PD的发展过程有铁死亡的参与^［4］。脑组织作为高脂质含量和高耗氧量的器官，更易在氧化应激的状态下损伤^［5］。PD患者黑质区域的铁含量显著增加^［6］，而积聚的铁通过芬顿反应与H₂O₂相互作用，提高细胞内ROS水平，从而导致神经元的氧化损伤^［7］。因此，发现PD发展过程中铁死亡特异性靶点并针对性干预有望对PD的治疗提供新思路。

姜黄素（curcumin， Cur）是具有多种生物功能的天然产物，以Cur为主要成分的多种姜科和天南星科中药在PD临床治疗中广泛运用。现代研究表明，姜黄素可通过降低单胺氧化酶B、α-突触核蛋白等病理产物的表达^［8］，或通过抗炎缓解PD的发展^［9］。此外，Cur还可以通过平衡氧化-抗氧化系统，对PD产生明显治疗作用^［10］。同时，Cur作为研究最广泛的铁死亡抑制剂之一^［11］，其二羰基结构使其能够与Fe²⁺和Fe³⁺结合，从而发挥潜在的铁螯合作用^［12］。已有研究表明，Cur能够减轻神经元中的铁积聚^［13］，并通过调节Nrf2/HO-1信号通路抑制ROS的产生，提高细胞内谷胱甘肽（GSH）含量，从而减轻铁死亡^［14］。

Cur能否通过调控铁死亡治疗PD具有研究意义，本研究旨在通过系统药理学的方法，综合网络药理学及体外药效机制研究，探讨Cur调控铁死亡干预PD可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

C17.2细胞购自大连美仑生物科技有限公司，编号：PWE-MU030。

1.1.2 实验药物

Cur、鱼藤酮（rotenone， Rot）（23031125、RNBL4453，美国Sigma-Aidrich公司）。10 mg Cur中加入1.357 mL二甲基亚砜（DMSO），配置为20 mmol/L母液。称取3.94 mg Rot加入1 mL DMSO，配置为10 mmol/L母液。-20 ℃冰箱保存，正式实验时稀释为相应浓度。

1.1.3 试剂

胎牛血清、DMEM基础培养基、0.25%胰蛋白酶溶液、DMSO（2045512CP、8123098、2323363、RNBH4453，美国Gibco）；磷酸盐缓冲液、青霉素-链霉素混合液、细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂盒（MA0015-Jun-07J、PWL062-Feb-12J、MA0218-Feb-29J，大连美仑生物科技有限公司）；ROS荧光法测试盒、GSH比色法测试盒、细胞亚铁比色法测试盒（WA03NN4V3085、WU04DJ426340、WA0704204962，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；Western blot及IP细胞裂解液、总谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）检测试剂盒（NADPH法）、总SOD活性检测试剂盒（WST-8法）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（042524240117、061623240117、111521240411、062222240331，上海碧云天生物技术有限公司）；小鼠GAPDH内参引物［J93KA0931，生工生物工程（上海）股份有限公司］；鼠单克隆β-肌动蛋白（β-actin）抗体、兔多克隆核因子（网织红细胞衍生2）样2（NFE2L2）抗体、超敏ECL化学发光检测试剂盒（10025459、00093644、20034021，武汉三鹰生物技术有限公司）；兔多克隆尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）（0209910101，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；一步法快速WB（HRP）试剂盒（兔）、一步法快速WB（HRP）试剂盒（鼠）（31022、28112，康为世纪生物科技股份有限公司）。

1.1.4 仪器

SC-3612型低速水平离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；SW-CJ-2FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；JSY-SC-031N型全自动细胞计数仪（广州博大博聚科技有限公司）；BT223S型电子天平（德国Sarturios）；Synergy H1/H1MFD型多功能酶标仪（美国Bio Tek）；FQD-96A型荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测系统（杭州博日科技股份有限公司）；680RGB型高灵敏度化学发光成像系统（美国GE）；PowerPac Universal型通用电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad）。

1.2 获取姜黄素作用靶点

通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取Cur的多种格式结构文件，通过SEA（http：//sea. bkslab. org）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction）等数据库获取Cur的作用靶点。去除重复靶点后，构建Cur靶点数据集。

1.3 获取PD相关基因

通过GeneCards数据库（https：//www.genecards.org./），检索“parkinson's disease”相关基因，建立PD相关基因数据集。

1.4 获取潜在作用靶点

将Cur靶点数据集与PD相关基因数据集输入Venn图在线工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），识别交集靶点，即Cur治疗PD的潜在作用靶点。

1.5 构建蛋白质相互作用（PPI）网络图

将交集靶点上传至STRING 11.0在线平台（https：//string-db.org），选择“Homo sapiens”为基因来源，获取靶点蛋白之间的相互作用信息，并通过Cytoscape 3.8.2进行可视化处理。

1.6 筛选核心靶点

CytoHubba为Cytoscape内置插件之一，采用多种拓扑分析方法进行网络拓扑和节点中心性分析。利用最大集团中心度（maximal clique centrality，MCC）算法识别Cur治疗PD的关键靶点，并构建关键子网络。

1.7 基因本体（GO）分类富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

通过生物学信息注释数据库（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）对靶点蛋白进行GO及KEGG分析，根据P<0.01的条件筛选功能和通路，并按P值升序排列，分别选取GO分析和KEGG分析前10位结果，通过微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn）进行可视化绘图。

1.8 铁死亡调控基因获取及其与Cur、PD 3者靶点综合分析

通过FerrDb数据库（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）获取与铁死亡相关的基因靶点。汇总各类铁死亡基因，并绘制Venn图以可视化铁死亡调控基因与Cur影响的PD靶基因的交集。构建交集基因的PPI网络，并进行GO及KEGG分析。以P<0.01为条件筛选功能和通路，结果通过微生信平台进行可视化。

1.9 分子对接

从Pubchem下载Cur小分子结构。通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）搜索核心靶点，种属设定为人。若无解析出的晶体结构，则使用AlphaFold 2预测三维结构。利用Schrödinger软件的Ligprep模块基于OPLS_4力场准备小分子的3D结构并确定坐标，使用Epik模块确定质子化状态及可能立体异构体。通过Protein Preparation Wizard模块进行蛋白准备。进行分配键级、补全缺失侧链、加氢等操作。去除蛋白中的水分子和辅因子，优化氢键网络，采用OPLS_4力场进行能量最小化。

分子对接通过Schrödinger中的Glide模块进行。对于含结晶配体的，原结晶小分子位置作为对接口袋；对于不含结晶配体的蛋白，使用Sitemap预测结合口袋。采用标准精度（SP-docking）进行对接，并使用GlideScore作为评分函数。每个小分子进行对接模拟，生成10个构象，并在对接后进行能量最小化。分析每组中评分最高的构象，并通过PyMol软件完成可视化。

1.10 细胞实验

1.10.1 细胞培养及体外模型建立

C17.2细胞系是小鼠永生化神经干细胞系，采用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的DMEM培养液，在37 ℃、5%CO₂的培养箱中进行培养，待细胞融合度达到90%时，用0.25%胰酶消化并传代。

Rot被广泛应用于诱导PD体内外模型，其作用机制包括导致多巴胺神经递质减少、α-syn异常聚集、线粒体功能障以及神经细胞凋亡和自噬途径等病理改变^［15］。本研究采用0.32 μmol/L的Rot诱导C17.2细胞体外PD模型。

1.10.2 CCK8确定Cur浓度

将细胞接种于96孔板，分为对照组、模型组和Cur组。Cur组设置5个浓度；0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L和6.0 μmol/L；各组DMSO含量相同。每组设有3个复孔，预处理2 h后，除对照组外，均加入终浓度为0.32 μmol/L的Rot。干预24 h后，去除原有培养基，按照说明书操作加入CCK8试剂，并测定450 nm处的吸光度，计算细胞存活率，确定Cur的最佳浓度。

1.10.3 ROS检测

将细胞接种于96孔板，分为对照组、模型组和Cur组，每组DMSO含量一致。2.0 μmol/L Cur组预处理2 h后，除对照组外，加入终浓度为0.32 μmol/L的Rot。干预24 h后，根据说明书原位装载探针，通过荧光显微镜在488通道进行观察并拍照。使用Image J分析平均荧光强度，计算各组ROS相对水平。

1.10.4 亚铁离子含量检测

将C17.2细胞以4×10⁴个/mL密度接种于60 mm培养皿，分组及处理同“1.10.3”项。干预结束后，根据照说明书进行亚铁离子含量检测，通过酶标仪在593 nm处测定OD值，并计算亚铁离子含量。

1.10.5 GSH含量检测

细胞处理同“1.10.4”项。干预结束后，照说明书进行GSH含量检测，通过酶标仪在405 nm处测定OD值，并计算GSH含量。

1.10.6 GPx活性检测

细胞处理同“1.10.4”项。干预结束后，根据照说明书进行GPx活性检测，加样及检测需在同一空间进行以保持温度一致。使用酶标仪每隔2 min自动测定一次A340。连续记录20 min，获得11个点的数据，计算样本GPx活性。

1.10.7 总SOD活性检测

细胞处理同“1.10.4”项。干预结束后，根据说明书进行总SOD活性检测，通过酶标仪在405 nm处测定OD值，计算样本总SOD活性。

1.10.8 RT‑qPCR检测NFE2L2、NOX4表达水平

将C17.2细胞以4×10⁴个/mL密度接种于6孔板，分组及处理同1.10.3。Trizol法收集细胞RNA，并按照试剂盒说明书合成cDNA，以GAPDH作为内参，进行NFE2L2、NOX4的RT-qPCR分析，并通过比较循环阈值（2^-ΔΔCt法）分析其表达水平，引物序列见表1。

1.10.9 Western blot检测Nrf2、NOX4蛋白表达水平

将C17.2细胞以4×10⁴个/mL密度接种于100 mm培养皿，分组及处理同“1.10.3”项。干预结束后，收集细胞并加入100 μL含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行细胞裂解，测定蛋白含量并配平，加入上样缓冲液，100 ℃金属浴变性5 min。上样至SDS-PAGE电泳凝胶各孔中进行蛋白电泳，随后将蛋白转移至PVDF膜上，并根据一步法WB试剂盒说明书进行后续操作。各抗体稀释比例为Nrf2（1∶2 000）和NOX4（1∶1 000）。

1.11 统计学方法

实验数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，使用GraphPad Prism 9.1软件进行统计学分析，两组样本间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Cur靶点、PD相关基因获取及潜在作用靶点获取

通过多个数据库检索及预测，去除重复靶点，共获取Cur靶点263个，PD相关基因8 711个。将Cur靶点与PD相关基因取交集，最终得到206个Cur治疗PD的潜在作用靶点（图1）。

2.2 Cur治疗PD潜在靶点的PPI网络构建及核心PPI网络筛选

通过STRING数据库，以人为基因来源，构建了Cur治疗PD潜在靶点的PPI（图2）。该网络图包括206个靶标节点及的2 567条表示靶标之间相互联系的边线。为清晰展示靶点间的关系，隐藏了与其他节点无关联的靶点。使用Cytohubba插件中的MCC算法，对PPI网络图进行分析，筛选出排名前10的核心靶点，包括核因子（网织红细胞衍生2）样2（NFE2L2）、v-rel网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A（RELA）、转录因子AP-1（JUN）、前列腺素内过氧化物合酶 2（PTGS2）、NADPH氧化酶4（NOX4）、NADPH氧化酶1（NOX1）、一氧化氮合酶 2（NOS2）、信号转导因子和转录激活因子3（STAT3）、花生四烯酸5-脂氧合酶（ALOX5）、表皮生长因子受体（EGFR）（图3）。这些蛋白之间的相互作用可能在Cur对PD的治疗机制中发挥重要作用。

2.3 GO和KEGG通路富集分析

将Cur与PD相关的核心靶点导入DAVID数据平台进行GO功能分析，设置显著性水平为P<0.01。整理后的数据上传到微生信平台，将GO功能富集分析结果可视化（图4）。GO富集分析共获得629个生物过程（biological process， BP）、27个细胞组分（cellular component， CC）和65个分子功能（molecular function， MF），根据Count值大小，分别列举每个模块前10的条目。从GO分析结果可以看出，这些基因BP主要涉及NADH脱氢酶复合物组装、氧化磷酸化、线粒体呼吸链复合体组装、呼吸电子传输链、细胞呼吸等。CC主要涉及NADH脱氢酶复合物、线粒体呼吸小体、呼吸链复合体、氧化还原酶复合体等。MF主要涉及NADH脱氢酶活性、氧化还原酶活性等。

通过KEGG通路富集分析，共识别出75条通路（P<0.01）。利用微生信平台对KEGG分析结果进行可视化处理，展示前10条通路（图5），主要包括氧化磷酸化、活性氧、帕金森病、神经退行性变途径等。

2.4 铁死亡调控因子的获取及其与Cur、PD 3者交集基因筛选和分析

通过FerrDb数据库筛选并汇总各类铁死亡相关基因共259个。对这259个基因与上述206个交集基因进行Venn分析，识别出17个同时与Cur作用靶点、PD治疗靶点及铁死亡过程调控相关的基因（图6），具体包括STAT3、PTGS2、JUN、EGFR、NFE2L2、RELA、NOX4、NOS2、NOX1、ALOX5、花生四烯酸15-脂氧合酶（ALOX15）、X-框结合蛋白1（XBP1）、重组人激光激酶A（AURKA）、花生四烯酸12-脂氧合酶（ALOX12）、CDGSH 铁硫结构域1（CISD1）、ATP 结合家族亚家族C成员1（ABCC1）、碳酸酐酶9（CA9）。GO富集分析及KEGG通路分析（P<0.01）共获得236个BP、12个CC、24个MF及44条通路。依据Count值大小，分别列举每个模块前10的条目（图7、8）。

GO分析结果显示，BP主要涉及活性氧代谢过程及调控、超氧化物代谢过程、脂氧合酶途径、细胞对氧化应激的反应、老化等。CC主要涉及NADPH氧化酶复合物、基质膜、基底外侧质膜、细胞基部、核膜、顶质膜、核被膜氧化还原酶复合体等。MF主要涉及氧化还原酶、加双氧酶活动、产生超氧化物的NAD（P）H氧化酶活性等。KEGG结果显示，通路主要涉及活性氧、抗氧化性等。

进一步绘制17个基因的PPI网络图，并将这些基因按置信度排序，发现排名前10位的基因与Cur抗PD核心靶点完全重合（图9）。这表明，通过调控铁死亡途径干预PD可能是Cur发挥疗效的重要机制之一。

2.5 分子对接

根据分子对接分析，Cur与10个核心靶点基因蛋白的结合能见表2。结果显示，Cur与各核心靶点结合能均<-5 kcal/mol，多数组合结合能<-7 kcal/mol，说明Cur与核心靶点的结合活性较好。结合能最低的分子对接结果的可视化见图10。

2.6 不同浓度的Cur对C17.2细胞PD模型细胞活力的影响

与对照组相比，模型组细胞活力显著降低（P<0.000 1，t=50.670）；与模型组相比，各浓度Cur处理组细胞活力均有所升高（P<0.01，P<0.05，t值分别为2.788、22.250、7.447、5.425、7.805），其中，当Cur浓度为2.0 μmol/L时，细胞活力恢复效果最佳（图11）。

2.7 Cur对C17.2细胞PD模型ROS、亚铁离子含量的影响

图12绿色荧光信号为ROS荧光，与对照组相比，模型组ROS荧光信号显著升高（P<0.01，t=7.320）；与模型组比较，Cur组ROS水平显著降低（P<0.01，t=6.977）。同时，模型组的亚铁离子水平也显著升高（P<0.01，t=5.648），而Cur能够明显抑制Rot诱导的亚铁离子升高（P<0.01，t=4.725），具体数据见表3。

2.8 Cur对C17.2细胞PD模型GSH含量、GPx、SOD活性的影响

与对照组相比，模型组还原系统GSH含量、GPx、SOD活性显著降低（P<0.001，P<0.01，P<0.05，t值分别为10.330、7.379、4.473）；与模型组相比，Cur处理后可显著提高GSH含量及GPx、SOD活性（P<0.01，P<0.05，t值分别为5.428、6.681、2.783），见表4。

2.9 Cur对C17.2细胞PD模型NFE2L2、NOX4基因表达水平的影响

与对照组相比，模型组NOX4表达显著上调（P<0.05，t=3.479）、NFE2L2表达显著抑制（P<0.01，t=6.475）。与模型组相比，Cur组NOX4表达水平显著降低（P<0.001，t=13.430），同时NFE2L2表达水平显著升高（P<0.05，t=3.087），见表5。

2.10 Cur对C17.2细胞PD模型NOX4、Nrf2蛋白表达水平的影响

与对照组相比，模型组Nrf2表达水平显著下降（P<0.001，t=13.040），NOX4表达水平无显著差异（P>0.05，t=1.409）。与模型组相比，Cur组Nrf2表达水平显著升高（P<0.05，t=2.806），同时NOX4表达水平下降（P<0.05，t=3.463），见图13。

3 讨论

PD致病因素及发病机制复杂，除了家族遗传因素外^［16］，线粒体功能障碍^［17］、氧化应激^［18］等多种因素均有可能影响疾病的发展。研究显示，PD患者脑内铁沉积可较运动症状更早出现，且沉积水平与症状的严重程度密切相关^［19］。而通过调控PD大鼠模型铁死亡相关指标，可改善其运动症状并抑制神经元丢失及α-syn的聚集^［20］。因此铁死亡可被认为是PD发病因素之一。在PD铁死亡发生过程中，抗氧化剂如Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）等显著抑制^［21］，而ROS、NOX4等促氧化物质高度表达^［22］。这些发现进一步支持了铁死亡在PD发病机制中的作用。

中医理论认为，PD的发生发展与证候演变与内风息息相关^［23］，姜黄辛散温通，属“风药”，升清至脑^［24］，对临床治疗PD具有良好效果。研究表明，姜黄的主要成分Cur具有调节铁代谢和抗氧化的作用，从而发挥神经保护效果^［25］。Cur已被证实可通过多途径刺激Nrf2信号通路，包括抑制Keap1、影响Nrf2上游介质、影响Nrf2和靶基因的表达以及改善Nrf2的核转位^［26］，进而增强细胞对氧化损伤的保护。Rathore等^［27］使用鱼藤酮诱导小鼠PD模型并使用Cur进行治疗，发挥显著抗氧化效果，并改善了线粒体功能。且Nrf2的敲除可消除Cur对铁死亡的抑制作用^［28］。NOX4作为在损伤时产生ROS的关键介质，也可通过Cur降低其表达水平^［29］。Cur能否通过调控铁死亡治疗PD具有一定的研究价值。

神经干细胞（neural stem cells， NSCs）具有自我更新、增殖、分化潜能，可替代受损的神经组织。干细胞疗法在PD治疗方面受到越来越广泛的关注，主要包括干细胞移植与内源性干细胞分化诱导。内源性NSCs存在于侧脑室室管膜下区， 可通过刺激使其迁移至纹状体， 并分化为多巴胺能神经元，提升PD模型纹状体内多巴胺水平^［30］。然而，ROS介导的氧化应激微环境制约了NSCs的存活、增殖和分化^［31］。本研究选用C17.2建造PD模型，旨在探讨Cur对NSCs的保护作用及机制，通过网络药理学分析，获取了17个Cur干预铁死亡治疗PD的潜在靶点，包括STAT3、PTGS2、JUN、EGFR、NFE2L2、RELA、NOX4、NOS2、NOX1、ALOX5，富集分析结果显示，这些靶点与ROS、抗氧化、HIF-1等氧化应激相关过程及通路密切相关，并通过分子对接初步验证了Cur对靶蛋白的干预效果。进一步利用PD诱导剂Rot^［32］诱导C17.2细胞构建体外PD模型，检测了ROS、亚铁离子、GSH、GPx、SOD等铁死亡相关指标，并对NFE2L2及NOX4两个作用靶标进行了RT-qPCR及WB验证。实验结果显示，Cur能够通过降低ROS及亚铁离子含量，提高GSH水平，恢复GPx及SOD活性，并调节NFE2L2及NOX4的表达。这些结果表明，Cur可能通过调控NFE2L2及NOX4改善C17.2细胞的铁死亡状态，是Cur治疗PD的潜在分子机制。

Cap'n'collar转录因子家族成员Nrf2由NFE2L2基因编码，其表达产物与细胞内氧化应激和铁死亡等关系密切^［33］。当发生铁死亡时，Nrf2从Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）中释放，并转移至细胞核内，进而上调多种抗氧化反应元件的基因表达，从而防止脂质过氧化。Han等^［34］使用MPTP及MPP⁺诱导PD体内外模型，发现激活Nrf2-线粒体自噬轴可降低ROS的产生，改善线粒体功能障碍，减少脂质过氧化，从而减轻铁死亡。此外，GPX4作为生成GSH、减少脂质过氧化以缓解铁死亡的关键介质，与铁代谢相关的蛋白如铁蛋白重链和轻链等均为Nrf2介导的下游基因^［35］。NOX4是NADPH氧化酶NOX家族的一员，其表达产物能够催化生成ROS^［36］。NOX4的过表达会通过减少线粒体电子传递链中的蛋白复合物，抑制线粒体呼吸和ATP的产生，从而加重损害星形胶质细胞线粒体代谢，并导致线粒体破碎及ROS 产生，抑制细胞抗氧化过程，促进脂质过氧化，最终导致铁死亡^［37］。Lin等^［38］通过MPTP诱导的PD模型发现，多巴胺能神经元及星形胶质细胞中NOX4表达显著增加。抑制NOX4可以改善PD模型动物的行为损伤，并减少多巴胺能神经元的铁死亡。同时，NOX4也可介导激活Nrf2的抗氧化作用^［39］。

本研究利用网络药理学初步预测了Cur通过调控铁死亡治疗PD的靶点及通路，并进行了体外实验验证。结果表明，Cur可能通过调控Nrf2及NOX4，改善鱼藤酮诱导的C17.2细胞的氧化应激及铁死亡状态，从而实现保护神经干细胞来改善PD的作用。后续可进一步验证Cur治疗PD的具体作用机制，以期为临床提供新的治疗策略。

作者贡献度说明：

吴春阳：相关文献搜集与整理，文章设计、数据分析、基础实验验证及手稿撰写；欧阳竞锋：写作指导，文章格式校对，项目管理和方法论指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] 陈芝君， 马建， 唐娜， 等. 中国帕金森病疾病负担变化趋势分析及预测［J］. 中国慢性病预防与控制， 2022， 30（9）： 649-654.

[2] Chen Z， Ma J， Tang N， et al. Disease burden trend analysis and prediction of Parkinson’s disease in China［J］. Chin J Prev Control Chron Dis， 2022， 30（9）： 649-654.

[3] 张明悦， 沈晓明， Eailing John， 等. 中医药与miRNA在帕金森病线粒体功能障碍中的调控作用［J］. 中国中西医结合杂志， 2024， 44（8）： 1004-1012.

[4] Zhang M， Shen X， Eailing J， et al. Regulatory role of Chinese medicine and miRNA in mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease［J］. Chin J Integr Tradit Western Med， 2024， 44（8）： 1004-1012.

[5] Li S， Ma S， Wang L， et al. ATF3 as a response factor to regulate Cd-induced reproductive damage by activating the NRF2/HO-1 ferroptosis pathway［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2024， 285： 117114.

[6] Mansour HM， Mohamed AF， El-Khatib AS， et al. Kinases control of regulated cell death revealing druggable targets for Parkinson’s disease［J］. Ageing Res Rev， 2023， 85： 101841.

[7] 林晓敏， 孙万阳， 段文君， 等. 磷脂过氧化： 神经退行性疾病“易感”的关键因素［J］. 药学学报， 2021， 56（8）： 2154-2163.

[8] Lin X， Sun W， Duan W， et al. Phospholipid peroxidation： A key factor in "susceptibility" to neurodegenerative diseases［J］. Acta Pharm Sin， 2021， 56（8）： 2154-2163.

[9] 卢冬磊， 张文玉， 谭思洁， 等. 运动调控铁死亡改善帕金森病的潜在机制［J/OL］. 生物化学与生物物理进展， 1-21 ［2024-10-18］.

[10] Lu D， Zhang W， Tan S， et al. Exercise-induced modulation of ferroptosis： Potential mechanisms for improvement in Parkinson’s disease［J/OL］. Prog Biochem Biophy， 1-21 ［2024-10-18］.

[11] 陆柚宇， 梁健芬， 林平平， 等. 中医药通过调节氧化应激治疗帕金森病机制浅探［J/OL］. 辽宁中医药大学学报， 1-10 ［2024-10-18］.

[12] Lu Y， Liang J， Lin P， et al. A probe into the mechanism of treating Parkinson's disease by regulating oxidative stress with traditional Chinese medicine［J/OL］. J Liaoning Univ Tradit Chin Med， 1-10 ［2024-10-18］.

[13] 朱江， 郭森， 张硕， 等. 姜黄素对帕金森病大鼠学习记忆能力的影响及作用机制［J］. 中国老年学杂志， 2021， 41（22）： 5049-5053.

[14] Zhu J， Guo S， Zhang S， et al. Effects of curcumin on learning and memory ability in rats with Parkinson's disease and its mechanism［J］. Chin J Gerontol， 2021， 41（22）： 5049-5053.

[15] 郭森， 张硕， 付慧霄， 等. 姜黄素对帕金森模型大鼠损伤神经元的修复作用及相关机制研究［J］. 中风与神经疾病杂志， 2021， 38（2）： 128-131.

[16] Guo S， Zhang S， Fu H， et al. Repair effect of curcumin on injured neurons in Parkinson's disease model rats and its related mechanism［J］. J Apopl Nerv Dis， 2021， 38（2）： 128-131.

[17] Turer BY， Sanlier N. Relationship of curcumin with aging and Alzheimer and Parkinson disease， the most prevalent age-related neurodegenerative diseases： A narrative review［J］. Nutr Rev， 2025，83（3）：e1243-e1258.

[18] Živanović N， Lesjak M， Simin N， et al. Beyond mortality： Exploring the influence of plant phenolics on modulating ferroptosis-A systematic review［J］. Antioxidants （Basel）， 2024， 13（3）： 334.

[19] Lei L， Yuan J， Yang Q， et al. Curcumin-polydopamine nanoparticles alleviate ferroptosis by iron chelation and inhibition of oxidative stress damage［J］. RSC Adv， 2024， 14（21）： 14934-14941.

[20] Xu Y， Liu Y， Wu Y， et al. Curcumin alleviates microglia-mediated neuroinflammation and neuronal ferroptosis following experimental subarachnoid hemorrhage by modulating the Nrf2/HO-1 signaling pathway［J/OL］. Mol Neurobiol， 2024， DOI： 10.1007/s12035-024-04443-7 .

[21] Zhou Y， Jia Z， Wang J， et al. Curcumin reverses erastin-induced chondrocyte ferroptosis by upregulating Nrf2［J］. Heliyon， 2023， 9（10）： e20163.

[22] Khan E， Hasan I， Haque ME. Parkinson's disease： Exploring different animal model systems［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（10）： 9088.

[23] Vollstedt EJ， Schaake S， Lohmann K， et al. Embracing monogenic Parkinson's disease： The MJFF global genetic PD cohort［J］. Mov Disord， 2023， 38（2）： 286-303.

[24] Qi R， Sammler E， Gonzalez-Hunt CP， et al. A blood-based marker of mitochondrial DNA damage in Parkinson's disease［J］. Sci Transl Med， 2023， 15（711）： eabo1557.

[25] Guo S， Gao Y， Zhao Y. Neuroprotective microRNA-381 binds to repressed early growth response 1 （EGR1） and alleviates oxidative stress injury in Parkinson's disease［J］. ACS Chem Neurosci， 2023， 14（11）： 1981-1991.

[26] Yao Z， Jiao Q， Du X， et al. Ferroptosis in Parkinson's disease： The iron-related degenerative disease［J］. Ageing Res Rev， 2024， 101： 102477.

[27] Hu C， Jiang H， Yang Y， et al. DL-3-n-butylphthalide alleviates motor disturbance by suppressing ferroptosis in a rat model of Parkinson's disease［J］. Neural Regen Res， 2023， 18（1）： 194-199.

[28] Gu S， Xie Z， Gu M， et al. Myricetin mitigates motor disturbance and decreases neuronal ferroptosis in a rat model of Parkinson’s disease［J］. Sci Rep， 2024， 14（1）： 15107.

[29] Boonpraman N， Yoon S， Kim CY， et al. NOX4 as a critical effector mediating neuroinflammatory cytokines， myeloperoxidase and osteopontin， specifically in astrocytes in the hippocampus in Parkinson's disease［J］. Redox Biol， 2023， 62： 102698.

[30] 孙梦菲， 欧阳竞锋， 丁港. 从阴火理论论治帕金森病［J］. 中医学报， 2024， 39（3）： 494-500.

[31] Sun M， Ouyang J， Ding G. Exploring Parkinson's disease from perspective of Yin fire theory［J］. Acta Chin Med， 2024， 39（3）： 494-500.

[32] 魏丽彦， 韩雪飘， 郭珊珊， 等. 运用风药治疗缓解期溃疡性结肠炎经验［J］. 环球中医药， 2021， 14（8）： 1504-1507.

[33] Wei L， Han X， Guo S， et al. Using the wind medicine treatment experience of remission of ulcerative colitis［J］. Glob Tradit Chin Med， 2021， 14（8）： 1504-1507.

[34] Huang Y， Liu J， He J， et al. Curcumin preconditioning enhances the neuroprotective effects of olfactory mucosa-derived mesenchymal stem cells on experimental intracerebral hemorrhage［J］. Heliyon， 2023， 9（7）： e17874.

[35] Ashrafizadeh M， Ahmadi Z， Mohammadinejad R， et al. Curcumin activates the Nrf2 pathway and induces cellular protection against oxidative injury［J］. Curr Mol Med， 2020， 20（2）： 116-133.

[36] Rathore AS， Singh SS， Birla H， et al. Curcumin modulates p62-Keap1-Nrf2-mediated autophagy in rotenone-induced Parkinson's disease mouse models［J］. ACS Chem Neurosci， 2023， 14（8）： 1412-1423.

[37] Zhai J， Chen Z， Zhu Q， et al. Curcumin inhibits PAT-induced renal ferroptosis via the p62/Keap1/Nrf2 signalling pathway［J］. Toxicology， 2024， 506： 153863.

[38] Asadizade S， Hatami M， Salehipour Bavarsad S， et al. Curcumin modulates NOX gene expression and ROS production via P-Smad3C in TGF-β-activated hepatic stellate cells［J］. Iran Biomed J， 2024， 28（1）： 31-37.

[39] 吴铮， 任志伟， 张国君. 帕金森病神经发生的研究进展［J］. 生命科学研究， 2021， 25（6）： 504-508.

[40] Wu Z， Ren Z， Zhang G. Research progress on neurogenesis in Parkinson's disease［J］. Life Sci Res， 2021， 25（6）： 504-508.

[41] 卢新良. 富氢-钯负载还原氧化石墨烯复合纳米材料拮抗神经干细胞氧化应激损伤的研究［D］. 广西医科大学， 2021.

[42] Lu X. Hydrogen-rich reduced graphene oxide@palladium nanocomposites against oxidative stress damage of neural stem cells［D］. Guangxi Med Univ， 2021.

[43] Tian L， Tang P， Liu J， et al. Microglial gp91phox-mediated neuroinflammation and ferroptosis contributes to learning and memory deficits in rotenone-treated mice［J］. Free Radic Biol Med， 2024， 220： 56-66.

[44] 秦智， 周敏. 丹参酮ⅡA通过Nrf2信号通路抑制肝组织铁死亡对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏的保护作用［J］. 中国中药杂志， 2024， 49（6）： 1611-1620.

[45] Qin Z， Zhou M. Tanshinone ⅡA inhibits ferroptosis via Nrf2 signaling pathway to protect liver in rats of nonalcoholic fatty liver disease［J］. Chin J Chin Mater Med， 2024， 49（6）： 1611-1620.

[46] Han Z， Wang B， Wen Q， et al. Acteoside alleviates lipid peroxidation by enhancing Nrf2-mediated mitophagy to inhibit ferroptosis for neuroprotection in Parkinson's disease［J］. Free Radic Biol Med， 2024， 223： 493-505.

[47] Anandhan A， Dodson M， Schmidlin CJ， et al. Breakdown of an ironclad defense system： The critical role of NRF2 in mediating ferroptosis［J］. Cell Chem Biol， 2020， 27（4）： 436-447.

[48] 李孟恩， 刘云可， 赵欣， 等. N-乙酰半胱氨酸调控NOX4/ROS信号通路对激素性股骨头坏死大鼠的保护作用［J］. 中华实用诊断与治疗杂志， 2024， 38（10）： 986-991.

[49] Li M， Liu Y， Zhao X， et al. Role of N-acetylcysteine in preventing steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by regulating NOX4/ROS pathway in rats［J］. J Chin Pract Diag Ther， 2024， 38（10）： 986-991.

[50] Park MW， Cha HW， Kim J， et al. NOX4 promotes ferroptosis of astrocytes by oxidative stress-induced lipid peroxidation via the impairment of mitochondrial metabolism in Alzheimer's diseases［J］. Redox Biol， 2021， 41： 101947.

[51] Lin Z， Ying C， Si X， et al. NOX4 exacerbates Parkinson's disease pathology by promoting neuronal ferroptosis and neuroinflammation［J］. Neural Regen Res， 2024， 20（7）： 2038-2052.

[52] Palomino-Antolín A， Decouty-Pérez C， Farré-Alins V， et al. Redox regulation of microglial inflammatory response： Fine control of NLRP3 inflammasome through Nrf2 and NOX4［J］. Antioxidants （Basel）， 2023， 12（9）： 1729.

基金资助

中国中医科学院科技创新工程资助项目(CI2021A00602)