调肝活血稳压方对自发性高血压大鼠血压及靶器官损害的影响

Effects of Tiaogan Huoxue Wenya Formula on high blood pressure and target organ injuries in spontaneously hypertensive rats

摘要

目的 通过动物实验观察调肝活血稳压方的降压及靶器官的保护作用。 方法 13周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）24只随机分为4组：模型组、调肝活血稳压方低剂量组（23.2 g/kg）、调肝活血稳压方高剂量组（46.4 g/kg）、苯磺酸氨氯地平对照组，每组6只。6只13周龄雄性WKY大鼠做正常对照，设为正常组。共干预8周，每周测量大鼠尾动脉收缩压、舒张压、平均血压；ELISA测定大鼠血清中血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）、醛固酮（ALD）、血管紧张素转化酶2（ACE2）、内皮素1（ET-1）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）水平；H&E染色观察大鼠心脏、肾脏和腹主动脉病理改变，Masson染色观察腹主动脉的纤维化程度。 结果 调肝活血稳压方低、高剂量组收缩压、舒张压、平均血压较模型组均显著降低（P<0.05），调肝活血稳压方高剂量组较低剂量组显著降低显著（P<0.05）。调肝活血稳压方给药组均较模型组血清中AngⅡ、ALD、ET-1、hs-CRP含量显著降低（P<0.05），ACE2有所升高。与模型组比较，调肝活血稳压方给药组大鼠心肌纤维排列紊乱、融合、纤维化等病理程度均有所改善，肾组织结构有所恢复，肾间质炎性细胞浸润得到改善；与模型组比较，调肝活血稳压方给药组大鼠腹主动脉肌纤维紊乱有所改善，管腔内径增大，中膜变薄，中膜厚度/管腔内径显著减小（P<0.05），腹主动脉纤维化均有改善，胶原容积显著减少（P<0.05）。 结论 调肝活血稳压方具有降血压及改善靶器官心、肾、血管的损害的作用，其作用途径可能是通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的过度激活、改善血管内皮功能、抑制炎症反应实现的。

Abstract

Objective To observe the antihypertensive and target organ protective effects of Tiaogan Huoxue Wenya Formula through animal experiments. Methods A total of 24 13-week-old male SHR rats were randomly divided into 4 groups： the model group， the Tiaogan Huoxue Wenya Formula low-dose group （23.2 g/kg）， the Tiaogan Huoxue Wenya Formula high-dose group （46.4 g/kg）， and the amlodipine benzenesulfonate control group， with 6 rats in each group. A total of 6 13-week-old male WKY rats were set as the normal control group. The rats were treated for a total of 8 weeks with weekly measurement of systolic blood pressure （SBP）， diastolic blood pressure （DBP）， and mean blood pressure （MBP） in the tail artery； ELISA was used to determine the level of angiotensinⅡ （Ang Ⅱ）， aldosterone （ALD）， angiotensin-converting enzyme 2 （ACE2）， endothelin 1 （ET-1）， high-sensitivity C-reactive protein （hs-CRP） in the serum of rats； H&E staining was used to observe the pathological changes in the heart， kidneys， and abdominal aorta of the rats， and Masson staining was used to observe the degree of fibrosis of abdominal aorta. Results SBP， DBP， and MBP were significantly lower in both low- and high- dose Tiaogan Huoxue Wenya Formula groups compared to the model group （P<0.05）， and those in the high-dose Tiaogan Huoxue Wenya Formula group were significantly lower compared to the low-dose group （P<0.05）. The serum levels of AngⅡ， ALD， ET-1， and hs-CRP were significantly lower in both Tiaogan Huoxue Wenya Formula administration groups compared to the model group （P<0.05）， and the ACE2 was elevated. Compared to the model group， the pathological degree of myocardial fiber arrangement disorder， fusion and fibrosis in the Tiaogan Huoxue Wenya Formula administration groups were improved， the renal tissue structure was restored， and the inflammatory cell infiltration in the renal mesenchyme was improved. Compared to the model group， the myocardial fiber disorder in the abdominal aorta in the Tiaogan Huoxue Wenya Formula administration groups were improved， the lumen diameter was increased， the intima-media was thinned， the media thickness/luminal diameter was significantly reduced （P<0.05）. The fibrosis of the abdominal aorta was improved， and the collagen volume was significantly reduced （P<0.05）. Conclusion Tiaogan Huoxue Wenya Formula has the ability to lower blood pressure and improve the injury of target organs such as heart， the kidneys， and blood vessels， and its pathway of action may be achieved by inhibiting the over-activation of the renin-angiotensin-aldosterone system， improving the function of vascular endothelium， and inhibiting the inflammatory response.

Graphical abstract

关键词

调肝活血稳压方 / 高血压 / 自发性高血压大鼠 / 靶器官损伤 / 血管重构

Key words

Tiaogan Huoxue Wenya Formula / Hypertension / Spontaneous hypertensive rats / Target organ damage / Vascular remodeling

高血压病（essential hypertension，EH）是以体循环动脉压增高为主要表现的临床综合征。高血压可导致心脑血管、肾脏和其他目标器官的急慢性损伤，是冠状动脉粥样硬化、缺血性心脏病、慢性肾脏病等高血压靶器官损伤性疾病的病理基础，常伴有全身代谢性改变^［1］。此病目前仍然是全球致死致残的主要因素^［2］，也是引起预期寿命缩短、疾病经济负担加重的主要疾病^［3］。随着医疗技术的进步高血压的致死率显著降低，但致残率显著增高，因此发掘靶器官保护的药物具有重要的意义。

中医药在临床治疗中以整体观念为基础，以辨证论治为向导来确立理法方药，在改善血压的情况下同时改善患者临床症状。调肝活血稳压方源于《杂病证治新义》中的天麻钩藤饮。在临床上治疗1~2级EH患者疗效确切，且无毒副反应^［4］。本研究旨在进一步探究其对心、肾、血管靶器官的保护作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为13周龄雄性无特定病原体（SPF）级自发性高血压大鼠（SHR）24只和同周龄雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠6只，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-0006。体质量200~240 g。饲养条件：清洁级动物房喂养，室内温度：20~26 ℃，湿度40%~70%，光照与黑暗12 h交替，实验大鼠均自由饮食、饮水。饲养于江西中洪博元生物技术有限公司［SCXK（赣）2020-0001］SPF级动物房，实验操作过程中符合实验动物伦理学要求（伦理审批号：LL-202302040001）。

1.2 药物及配制

调肝活血稳压方：天麻10 g、三七6 g、钩藤10 g、石决明10 g、丹参10 g、益母草15 g、桑寄生10 g、杜仲10 g、菟丝子10 g、黄芩10 g、栀子10 g、淡豆豉20 g、茯神10 g、夜交藤15 g、牡丹皮10 g、冬桑叶15 g、生麦芽30 g、怀牛膝10 g。以上中药饮片，均购自江西中医药大学附属医院中药房。苯磺酸氨氯地平片（浙江京新药业股份有限公司，国药准字H20103356），购自江西中医药大学附属医院西药房，药品规格：5 mg/片。

调肝活血稳压低剂量：23.2 g/kg按10 mL/kg计算得2.32 g/mL，1副药221 g（包括三七粉）用纯水熬煮，浓缩成87.76 mL。调肝活血稳压高剂量：46.4 g/kg按20 mL/kg计算得2.32 g/mL，1副药221 g（包括三七粉）用纯水熬煮，浓缩成87.76 mL。苯磺酸氨氯地平：苯磺酸氨氯地平0.525 mg/kg，按10 mL/kg计算得0.052 5 mg/mL，取含药5 mg的苯磺酸氨氯地平片加入纯水95.24 mL。

1.3 动物分组及给药

13周龄SPF级雄性大鼠适应性饲养1周，WKY大鼠6只设为正常组，24只SHR大鼠称体重、编号，随机分为4组：模型组、调肝活血稳压方低剂量组、调肝活血稳压方高剂量组、苯磺酸氨氯地平对照组，每组6只，各组大鼠进行血压检测后，WKY对照组、模型组给予生理盐水灌胃，调肝活血稳压方低剂量组按23.2 g·kg^-1·d^-1（临床成人用药量换算后的等效剂量）的药物浓度灌胃给药，调肝活血稳压方高剂量组按46.4 g·kg^-1·d^-1（临床成人用量等效剂量的2倍）的药物浓度灌胃给药，苯磺酸氨氯地平片0.525 mg·kg^-1·d^-1（临床成人用药量换算后的等效剂量）的药物浓度灌胃给药，共干预8周。

1.4 主要仪器及试剂

智能无创血压计鼠仪，北京软隆生物技术有限公司提供，型号：BP-2010A；石蜡包埋机，Leica公司提供，型号：HistoCore Arcadia；光学显微镜，OLYMPUS提供，型号：BX43；酶联免疫检测仪，北京六一生物科技有限公司，型号：WD-2012B；冷藏冷冻箱，美的集团股份有限公司提供，型号BD/BC-415DKEM；高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机有限公司提供，型号：TGL-16.5M。大鼠高敏C反应蛋白（hs-CRP）ELISA试剂盒，货号：E-EL-R3002；大鼠血管紧张素转化酶2（ACE2）ELISA试剂盒，货号：E-EL-R2453c；大鼠内皮素1（ET-1）ELISA试剂盒，货号：E-EL-R1458c；大鼠血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）ELISA试剂盒，货号：E-EL-R1430c；醛固酮（ALD）ELISA试剂盒，货号：E-EL-0070c，以上ELISA试剂盒均由伊莱瑞特生物科技有限公司提供；Masson三色染色液，货号：G1006，由Servicebio提供。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 血压测量

运用无创伤血压测定系统测定每只大鼠的尾动脉血压。具体方法如下：排除各类光源干扰，在大鼠安静的状态下进行测量，每只大鼠的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均血压（MBP）重复测量3次，其平均值作为当次测量结果。

1.5.2 生化指标检测

给药8周后，大鼠在1%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉后，心脏采血，将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2 h，然后1 000×g离心20 min，取上层清液。根据ELISA试剂盒说明书操作步骤，分别用对应的试剂盒进行Ang-Ⅱ、ALD、ACE2、ET-1、hs-CRP检测。

1.5.3 组织病理学分析

心脏取血后取材，将腹主动脉主动脉剥离，生理盐水清洗，固定于10%福尔马林中。（1）H&E染色：大鼠腹主动脉、心脏、肾脏组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用苏木素染液染色3~5 min，流水冲洗后，用1%盐酸酒精分化，返蓝液返蓝，伊红染色液染色3~5 min后，切片脱水，封片，显微镜下观察，留图。（2）Masson染色：大鼠腹主动脉组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，采用Masson三色染色液进行染色，依次经重铬酸钾媒染液染色室温过夜、65 ℃孵育30 min，苏木素染色1 min，1%盐酸酒精分化后，丽春红酸性品红染色6 min，磷钼酸处理1 min后，苯胺蓝染色30 s，切片脱水后用二甲苯透明切片，封片，显微镜下观察，留图。

1.6 统计学处理

采用SPSS26.0进行统计学分析，多组之间数值采用ANOVA单因素方差分析。所有结果均采用均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 调肝活血稳压方对SHR血压的影响

正常组及模型组大鼠SBP、DBP、MBP随时点无明显变化，模型组在2、4、6、8个周时SBP、DBP、MBP均明显高于同时间WKY组（P<0.05）。与模型组同时间点比较，调肝活血稳压方给药组SBP、DBP、MBP从第1周开始显著降低（P<0.05）；与低剂量组相比较，高剂量组和对照组SBP、DBP、MBP在给药第2周开始有统计学差异（P<0.05）；与高剂量组相比较，对照组SBP、DBP、MBP在给药第7周开始有统计学差异（P<0.05），其余时间点无统计学差异（P>0.05），见表1。

2.2 调肝活血稳压方对SHR血清AngⅡ、ALD、ACE2、ET‑1、hs‑CRP的影响

2.2.1 调肝活血稳压方对血清AngⅡ、ALD、ACE2的影响

与正常组比较，模型组血清AngⅡ升高（P<0.05）；与模型组比较，调肝活血稳压方低剂量组及对照组血清AngⅡ降低（P<0.05）；另外，与低剂量组比较，对照组亦无统计学差异（P>0.05）。与正常组比较模型组血清ALD升高（P<0.05）；与模型组比较，低、高剂量组及对照组血清ALD均降低（P<0.05）。与正常组比较模型组、低、高剂量组和苯磺胺氨氯地平组血清ACE2均降低、其中模型组及高剂量组显著降低（P<0.05）；与模型组比较，调肝活血稳压方低、高剂量组及对照组血清ACE2均有所升高，其中对照组显著升高（P<0.05），见表2。

2.2.2 调肝活血稳压方对SHR血清ET‑1、hs‑CRP的影响

与正常组比较模型组血清ET-1升高（P<0.05），调肝活血稳压方低、高剂量组无统计学差异（P>0.05）；另外，与模型组比较，调肝活血稳压方低、高剂量组及对照组血清ET-1降低（P<0.05）。与正常组比较，模型组血清hs-CRP无统计学差异（P>0.05）；而与模型组比较，调肝活血稳压方低、高剂量组组血清hs-CRP均显著下降（P<0.05），见表3。

2.3 调肝活血稳压方对SHR靶器官的影响

2.3.1 心、肾及腹主动脉组织H&E染色结果

心脏H&E染色结果：镜下显示，正常组大鼠心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐。与正常组比较，模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，可见断裂、融合、纤维化改变，细胞间隙增宽以及炎症细胞浸润明显；与模型组比较，调肝活血稳压方治疗后心肌排列紊乱、融合、纤维化及心肌细胞之间炎症细胞浸润病理现象等病理程度均有所改善，高剂量调肝活血稳压方治疗效果更佳；苯磺酸氨氯地平治疗后，心肌纤维排列明显得到改善，心肌细胞之间炎性细胞浸润得到明显改善（图1）。

肾脏H&E染色结果：镜下显示，正常组的大鼠肾脏结构正常，无明显病变。与正常组比较，模型组的大鼠肾组织结构紊乱，肾小球萎缩，肾小管扩张及肾小管上皮细胞脱落至管腔，可见蛋白管型及肾间质炎性细胞浸润明显；与模型组比较，调肝活血稳压方治疗后，肾组织结构有所恢复，肾间质炎性细胞浸润得到改善，高剂量调肝活血稳压治疗效果更佳，苯磺酸氨氯地平治疗后，肾组织结构有所恢复，肾间质炎性细胞浸润得到改善（图2）。

腹主动脉H&E染色结果：镜下显示，正常组大鼠腹主动脉血管结构正常，未见动脉管壁增生，无明显纤维化改变；与正常组比较，模型组大鼠腹主动脉血管壁增厚，中膜明显增厚，肌纤维排列极不整齐，管腔内径明显缩小，中膜厚度与管腔内径（MT/LD）显著增加（P<0.05）；与模型组相比较，调肝活血稳压方低、高剂量组及对照组上述病理改变均有所改善，其中调肝活血稳压方低、高剂量组MT/LD显著减小（P<0.05），改善情况较对照组更优，见表4、图3。

2.3.2 腹主动脉组织Masson染色结果

正常组大鼠腹主动脉肌纤维排列整齐，胶原纤维含量较少；与正常组比较，模型组大鼠腹主动脉肌纤维排列紊乱，胶原纤维容积显著增加（P<0.05）；与模型组比较，各干预组腹主动脉纤维化均有改善，胶原纤维容积减少，其中调肝活血稳压方高剂量组及对照组纤维化明显改善，胶原容积显著减少（P<0.05），见表4、图4。

3 讨论

高血压是世界范围内最常见慢性病之一，是严重影响人口健康的重大公共卫生问题，可导致心脑血管、肾脏和其他目标器官的急慢性损伤^［3］。因此，治疗高血压不仅要着眼于控制血压，同时也要预防和改善靶器官的损害^［5］。本研究利用SHR高血压模型，探讨调肝活血稳压方对高血压大鼠血压及心、肾、血管组织损害的保护作用及其可能机制。研究结果显示，调肝活血稳压方能够降低血压，且能减轻心、肾、血管的炎症反应及纤维化，对高血压所引起的靶器官损害具有保护作用。另外，机制研究表明，调肝活血稳压方对高血压大鼠的降压及心、肾、血管损害的保护作用可能与抑制肾素‑血管紧张素‑醛固酮（RAAS）系统、抑制炎症及纤维化有关。

高血压在祖国医学中归属于“眩晕”“头痛”等疾病的范畴。在一项老年EH中医证候特征的研究中发现，老年EH证候构成比例中阴虚阳亢证占比高达23%，是老年EH最常见的证候类型^［6］。肝阳上亢根于气机不畅，久之肝郁乘脾，脾虚不能运行水饮血液，滋生痰瘀，停聚脉中，损伤脉管，日久伤及心肾。年老之体，肾气阴阳均有所耗，母病及子，水不涵木，肝气逆乱，郁化阳热，耗伤阴津，发为阴虚阳亢^［7］。国医大师邓铁涛、李士懋均认为高血压发病以肝为本^［8，9］，徐凤芹教授提出肝肾亏虚为老年EH重要发病基础，肝阳上亢与脾失健运在老年EH的病机演变过程中起着关键作用^［10］，且两者相互影响，能进一步影响气血运行，加重EH的病情。

老年高血压的病变部位涉及肝、心、脾、肾，肝失条达是本病的核心病机，瘀血是本病的常见病理产物^［4］，因此在平肝潜阳的同时应兼顾活血化瘀。调肝活血稳压方由古方天麻钩藤饮化裁而来，针对肝阳上亢型高血压所制^［11］。由于老年高血压患者多肝阳上亢、血瘀阻络、肾精亏虚，故调肝活血稳压方在君臣佐使配伍上有所变动，其中天麻、三七为君药，旨在平肝潜阳、活血化瘀；钩藤、石决明、丹参、益母草、桑寄生、杜仲能滋水涵木、补益肝肾，为臣药，再以清肝降火、宁心安神之黄芩、栀子、淡豆豉、生麦芽、茯神、夜交藤、丹皮、冬桑叶、菟丝子、怀牛膝为佐使，诸药合用，能平上亢之肝阳，化血脉之瘀阻，契合高血压“肝阳上亢”之病机。本研究发现，在SHR大鼠中，调肝活血稳压方给药组的大鼠血压比模型组显著下降，说明调肝活血稳压方具有降血压作用。炎症与纤维化是器官损伤的常见病理改变，故抑制其发生发展在治疗高血压靶器官损害中起着至关重要的作用。本研究发现，调肝活血稳压方可以改善SHR大鼠心脏、肾脏及血管炎症反应及纤维化，扩大管腔内径，改善中膜厚度，提示调肝活血稳压方对高血压伴有靶器官损害的患者来说，是具有重要作用的降压类复方。

高血压及其靶器官损害的病理发生机制与RAAS系统的过度激活和炎症关系密切，有研究提示抑制RAAS系统的过度激活和抗炎可能对高血压伴有靶器官损害患者具有关键治疗作用^［12-15］。RAAS是调节血压、体液以及电解质平衡的主要生理系统，在高血压的发生、心肌重塑、肾脏等疾病的发生发展中起关键作用^［16-20］。RAAS中AngⅡ可引起小动脉血管收缩，并促进肾上腺皮质合成和分泌ALD。ALD可以通过保钠排钾，刺激交感神经递质分泌，进而特异性受体的活性升高，则血压增高^［21］。本研究发现，调肝活血稳压方能显著降低RAAS系统中AngⅡ、ALD的含量，从而抑制RAAS系统的过度激活。调肝活血稳压方低剂量组中AngⅡ与ALD同步降低，可推测AngⅡ在用药后无法合成亦或是被裂解，导致无法促进ALD的合成，而调肝活血稳压方对于拮抗RAAS系统的ACE2的上调无显著影响，故调肝活血稳压方其下调RAAS系统可能是通过降低ACE水平^［22］，从而抑制AngⅡ的合成，此需进一步的实验验证，可通过测定血清ACE含量进行观察。此外，ET-1具有强效血管收缩作用，而hs-CRP是心血管事件的预测因子之一，同时也是炎症反应的指标，调肝活血稳压方能显著降低ET-1和hs-CRP的含量，提示本方能通过扩张血管、改善内皮功能降低血压并抑制炎症反应。综上研究结果，高剂量中药与西药对高血压的整体治疗效果差异不大，而低剂量降压效果较缓慢，降压效果与用药剂量及时间呈正相关，但从其降压趋势及血压调节因子水平可推测持续服用低剂量调肝活血稳压方亦可达到理想的血压状态。

综上所述，调肝活血稳压方能够降低SHR大鼠血压，同时对高血压所引发的心脏、肾脏以及血管组织损害具有良好的保护作用，其机制可能与调肝活血稳压方抑制RAAS系统的过度激活、改善血管内皮功能、抑制炎症反应有关。

作者贡献度说明：

唐娜娜：实验设计，提供经费支持，论文撰写。缪慧慧：论文撰写，实验操作。徐媛媛：实验操作，理论分析。刘中勇：修改手稿，提供经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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