基于网络药理学和动物实验探讨六味补气方对慢性阻塞性肺疾病的干预作用

Intervention effect of compound traditional Chineses medicine Liuwei Buqi decoction in treatment of COPD based on network pharmacology and animal experiments

摘要

目的 基于网络药理学并通过动物实验和分子对接技术验证，初步探讨六味补气方干预COPD的作用及其机制。 方法 采用在线数据库筛选六味补气方的主要活性成分及其对应靶点蛋白和COPD基因，并选取交集基因；通过STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络分析；利用David数据库对交叉靶点进行基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。采用AutodockTools和PyMOL进行分子对接并进行可视化处理。使用脂多糖（LPS）联合烟熏法建立SD雄性大鼠COPD模型，给予六味补气方进行干预后进行样本采集。通过检测大鼠肺功能指标，HE染色观察肺组织病理变化及ELISA法检测肺组织匀浆中白介素10（IL‑10）水平对网络药理学预测结果进行验证。 结果 网络药理学分析得到复方有效成分76个，潜在靶点768个。GO富集分析得到884个GO条目；KEGG富集分析得到139条信号通路。分子对接显示：六味补气方治疗COPD的主要活性成分为山奈酚、槲皮素、油酸、β‑谷甾醇和川陈皮素等。六味补气方与COPD的核心靶点肿瘤坏死因子（TNF）、RAC‑α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、白介素6（IL‑6）和IL‑10有较好的结合能。实验研究发现，与正常组比较，模型组大鼠肺功能降低（P<0.01），肺组织中出现慢性支气管炎和肺气肿病理变化，肺组织匀浆中IL‑10水平下降（P<0.01）。与模型组比较，各用药组肺功能改善（P<0.01），支气管肺组织炎症反应和病理变化改善，肺组织匀浆中IL‑10水平上升（P<0.01）。 结论 六味补气方通过多成分，多靶点及多信号通路的作用，增强肺功能，减轻支气管与肺组织的病理特征并抑制炎症反应，其中抑炎因子IL‑10可能发挥主要作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of the compound Chinese medicine of Liuwei Buqi decoction in the treatment of chronic obstructive pulmonary disease（COPD） based on network pharmacology，molecular docking and animal experiments. Methods Using the online databases to obtain the relevant chemical ingredients，target proteins of Liuwei Buqi decoction and related disease genes， to choose the intersection genes，and to build protein interaction （PPI） network analysis by STRING databases， relating targets for gene ontology （GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） analysis by David databases.Using the AutodockTools and PyMOL to achive the molecular docking and visual process.Establishing the COPD model by lipopolysaccharide （LPS） combined with cigarette smoking.Givig Liuwei Buqi decoction to intervent and collecting samples after drug intervention.The prediction results of network pharmacology were verified by detecting the lung function，and the pathological changes of lung tissue by H&E staining and detecting the level of interleukin‑10 （IL‑10） in lung tissue homogenate were by ELISA. Results Network pharmacology analysis identified 76 active components and 768 potential targets.GO enrichment analysis obtained 884 GO entries. KEGG enrichment analysis obtained 139 signaling pathways.The molecular docking results showed that the main active ingredients of Liuwei Buqi decoction in the treatment of COPD are kaempferol，quercetin，oleic acid，β‑sitosterol and nobiletin.Liuwei Buqi decoction has a good binding energy with TNF，AKT1，IL‑6and IL‑10，which are the core targets of COPD.Experimental results discoverd that compared with the normal control group， the lung function of the model group was decreased （P<0.01）. Chronic bronchitis and pulmonary emphysema occured in the lung tissue.The level of IL‑10 was decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the lung function of each medication group was improved （P<0.01， P<0.05）. The pathological changes of bronchopulmonary tissues were improved. The level of IL‑10 in lung tissue was increased （P<0.01）. Conclusion Liuwei Buqi decoction can increase lung function，relieve the pathological changes of COPD bronchial and lung tissue and inhibit the inflammatory response by multiple components， targets and signaling pathways.The suppression of inflammation factor IL‑10 may play an significant role.

Graphical abstract

关键词

六味补气方 / 慢性阻塞性肺疾病 / 网络药理学 / 动物实验 / 炎症

Key words

Liuwei Buqi decoction / Chronic obstructive pulmonary disease / Network pharmacology / Animal experiments / Inflammation

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）目前已经成为全球第3大死亡原因，大约有近4亿人患病^［1］。COPD是以气流受限不完全可逆且呈进行性发展为特征的异质性肺部疾病^［2］。临床上通常以支气管扩张剂、β2受体激动剂和茶碱类等西药进行治疗^［3］。但长期使用上述类型药物可能会导致心率失常、电解质紊乱等副作用，严重时甚至会导致认知功能障碍^［4］。COPD归属中医学中“肺胀”“喘证”或“喘病”等范畴，“肺胀者，虚满而喘咳”记载于《黄帝内经》，其证候的复杂性可由体质、气候和环境等因素决定，虚、痰、瘀等基本病理因素随之产生。长期吸烟、气道慢性炎症、蛋白酶与抗蛋白酶失衡及氧化剂和抗氧化剂失衡都是加重COPD的重要因素^［5］。安徽中医药大学第一附属医院的特色中药制剂六味补气方，由黄芪、人参、益智仁、玉竹、陈皮和肉桂组成，全方通过阴阳平衡，补通施治相结合及寒温互调的方法达到正邪兼顾的效果，在临床运用取得了良好的疗效。前期研究表明，六味补气方可以增强患者的肺功能和运动耐力，改善呼吸活动症状，同时还能降低外周血C反应蛋白水平，对急性期COPD患者的临床症状改善具有重要作用^［6，7］。

网络药理学于2007年被首次提出，其系统地阐述复方中药的靶点基因和生物学功能，近年来已成为揭示中药方剂药理作用机制的一种有效途径^［8，9］。六味补气方药物成分较多，作用机制尚不清晰。因此，本研究凭借网络药理学，分子对接技术及动物实验验证初步探讨六味补气方治疗COPD的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 六味补气方的有效成分及靶标筛选

以黄芪、人参、玉竹、陈皮和肉桂为关键词检索TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库，设置口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为标准^［10］。由于肉桂各成分的DL值均未高于0.18，根据文献，可将其DL值设定≥0.12^［11］。以益智仁为关键词检索TCM‑ID（https：//bidd.group/TCMID/index.html）数据库，获取益智仁的化学成分，再利用SwissADME（http：//www.swissadme.ch/）及SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库获取其作用靶点，将肠胃吸收（GIabsortion）结果为“High”和5种毒理性中“Yes”≥2作为判定条件，筛选益智仁的活性化合物。在Uniprot（https：//www.uniprot.org）和Drugbank（https：//go.drugbank.com）平台规范基因名称。

1.1.2 六味补气方核心成分筛选

将规范过后的基因名称导入软件Cytoscape3.7.2，并构建“药物‑有效成分‑作用靶点”网络。根据“network analyzer”获取相关拓扑分析参数，将度值（Degree）从大到小排序，筛选排名靠前的化合物作为六味补气方的核心成分。

1.1.3 COPD靶点预测与“疾病‑药物”交集靶点获取

利用Genecard（https：//www.genecards.org/）及OMIM（https：//omim.org/）数据库对关键词“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”和“COPD”进行检索，收集并剔除重复靶点；再利用Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）网站绘制六味补气方作用靶点和COPD疾病靶点的韦恩图。

1.1.4 蛋白互作网络构建与核心靶标筛选

将中药与疾病的交集靶点输入STRING（www.string-db.org），设定人类“Homo sapiens”，置信度>0.4，获取蛋白互作网络（PPI）信息。将PPI网络信息导入Cytoscape3.7.2，采用度值、介数中心性（BC）和紧密中心度（CC）三种算法分析排名前15的核心靶点，并绘制PPI蛋白网络互作图^［12］。

1.1.5 GO及KEGG通路的富集分析

以“Homo sapiens”为限定物种条件，对导入David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）的六味补气方各成分靶点与COPD疾病的交集基因进行GO分类富集分析和KEGG通路富集分析。设定P<0.05，根据富集基因数从多到少的顺序，选取排名前20的GO分类和排名前30的KEGG通路，利用微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）制作富集气泡图。

1.2 分子对接验证

1.2.1 建立核心蛋白受体和小分子配体

通过Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子配体的2D结构，利用Pymol2.6.0对小分子配体进行最小结合能的设置，并以mol2格式保存。在Uniprot数据库找到蛋白受体的对应ID，并在PBD（https：//rcsb.org）数据库下载蛋白的PDB格式文件。筛选原则：人源蛋白；较高分辨率；具备原始配体^［13］。

1.2.2 分子对接验证

通过AutodockTools对核心蛋白受体去除水分子并加氢，以pdbqt格式保存，再导入小分子配体处理为pdbqt格式。运用Autodock1.5.6和Pymol2.6.0进行分子对接和可视化处理，输出三维图。

1.3 实验验证

1.3.1 动物及分组

购自河南斯贝克斯生物科技有限公司的60只SPF级SD雄性大鼠，体质量（180±20） g，生产许可证号为：SCXK（豫）2020‑0005。无菌环境，恒温送风，温度22 ℃~24 ℃，适度55%~60%，普通饲料进食，自由饮水，适应性饲养一周。动物实验得到安徽中医药大学动物伦理委员会的批准，动物伦理号为AHUCM‑rats‑2024002。把60只大鼠依照随机数字表法随机分成6组，每组10只，分别为正常组、模型组、六味补气方低剂量组、中剂量组和高剂量组及桂龙咳喘宁组。

1.3.2 药物与试剂

于安徽中医药大学第一附属医院中药房购入六味补气方组方中药（黄芪15 g、玉竹10 g、人参10 g、陈皮6 g、益智仁6 g、和肉桂3 g）。将600 mL水倒入组方中药中并浸泡半小时，大火煮沸转小火慢炖1 h。后将药汤倒至1 000 mL量筒，置于水浴锅中持续浓缩，配置成浓度梯度为0.265、0.53、1.06 g/mL的六味补气方低、中、高剂量悬液。桂龙咳喘宁片购自桂龙药业（安徽）有限公司，按0.82 g/mL配置成混悬液。IL‑10试剂盒购自上海赛培森生物科技有限公司，货号SPS‑30796；脂多糖（LPS）购自合肥禾曼生物科技有限公司，货号：BS904；黄山牌香烟购自安徽中烟工业有限责任公司；PBS购自Servicebio。

1.3.3 仪器

烟熏箱（自制）；动物肺功能检测仪（型号：Ani Rws 2005，北京贝兰博公司）；切片机（型号：KH‑Q330，湖北孝感海阔科技有限公司）；生物组织脱水机（型号：KH‑TS，湖北孝感海阔科技有限公司）；生物组织包埋机（型号：YD‑6L，金华益迪医疗设备有限公司）；光学显微镜（型号：BX53，OLYMPUS）；酶标仪（型号：318C+，上海沛欧分析仪器有限公司）。

1.3.4 COPD大鼠模型构建

香烟烟雾（CS）吸入是目前医学领域最常见的制备COPD模型的方法，本实验根据前期COPD模型构建方法^{［14，15］}，通过气道内滴入脂多糖（LPS）和CS吸入，对分组后的60只大鼠建立COPD 实验动物模型。LPS滴注：各组大鼠（除正常组）在实验第1天和第15天腹腔注射3%的戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉，气管内滴入脂多糖200 μL（标准：1 mL/1 mg）。CS吸入（非滴注日）：各组大鼠（除正常组）置于自制烟熏箱中，一次性点燃20只香烟进行烟熏。每天2次，每次半小时，造模4周。将大鼠肺功能指标及肺组织病理学变化作为判断模型是否构建成功的标准^［14］。

1.3.5 药物干预

根据前期课题组的有效实验量，正常组和模型组大鼠以成人等效剂量的10倍，灌服0.9%生理盐水10 mL·kg^-1·d^-1；六味补气方低、中、高剂量组大鼠分别以成人等效剂量的5、10和15倍，灌服以浓度梯度为0.265、0.53、1.06 g/kg的六味补气方混悬液；桂龙咳喘宁组大鼠以成人等效剂量的10倍，灌服以0.9%生理盐水制成的桂龙咳喘宁片混悬液0.82 g·kg^-1·d^-1［14］。按1 mL/100 g灌服量计算^［16］。于造模第5周第1天进行干预，每天1次，共计4周。

1.3.6 肺功能检测

动物肺功能检测仪检测各组大鼠肺活量（FVC）、第三秒用力呼气容积（FEV0.3）和FEV0.3/FVC比值。

1.3.7 H&E染色检测支气管肺组织的病理学变化

将4%多聚甲醛固定后的各组大鼠支气管肺组织进行梯度浓度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续5 μm厚切片后进行H&E染色，染色结束后用二甲苯封片后光镜观察肺组织病理学变化并摄片。

1.3.8 ELISA法检测肺组织匀浆中IL‑10水平

每组大鼠取0.1 g肺组织，加入0.9 mLPBS（缓冲液）进行超声震碎研磨，离心取上清。依照ELISA试剂盒的说明进行检测，在450 nm处检测吸光度值，绘制标准曲线，计算各组IL‑10水平。

1.3.9 统计学处理

采用SPSS 25.0进行数据分析，GraphPad Prism 10.1.2进行绘图，资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析检验进行多组间比较，采用最小显著性差异法进行两两比较；不符合正态分布，采用非参数检验秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1 六味补气方有效成分及作用靶点

通过TCMSP、TCM‑ID和SwissTargetPrediction数据库筛选出目标中药的有效成分对应靶点。结果显示，六味补气方的有效成分76个，数据整合去重后得到潜在作用靶点856个，见表1及表2。

2.1.2 “药物‑有效成分‑作用靶点”网络及核心成分

利用Cytoscape3.7.2对六味补气方的76个有效成分构建“药物‑有效成分‑作用靶点”网络图并进行拓扑分析，网络图中节点的大小和颜色深浅变化与度值成正比，见图1和表3。拓扑分析结果显示：六味补气方中Degree值排名较前化合物有：kaempferol（山奈酚）、quercetin（槲皮素）、oleic acid（油酸）、beta‑sitosterol（β‑谷甾醇）和nobiletin（川陈皮素）等。

2.1.3 COPD疾病相关靶点及六味补气方治疗COPD的潜在靶点

将Genecard和OMIM数据库获取的COPD疾病靶点与六味补气方的潜在靶点进行映射，得到86个交集基因，再通过Venny2.1.0进行可视化，见图2。

2.1.4 PPI网络构建及核心靶点获取

将86个交集基因上传至STRING数据库并下载tsv格式文件，文件导入Cytoscape3.7.2进行拓扑分析，得到84个节点（去除2个游离节点）和1 644条边的PPI网络图，网络中节点的大小，颜色深浅变化对应度值的大小，度值越大代表与其他靶点的联系越强，见图3A。再通过cytoNCA的算法获取排名前15的核心靶点，绘制PPI网络图和拓扑分析参数表格，结果显示：TNF、AKT1、IL‑6、细胞肿瘤抗原 P53（TP53）和IL‑10可能为六味补气方药治疗 COPD的核心靶点，见图3B和表4。

2.1.5 GO和KEGG通路富集分析

以P≤0.01为筛选条件，对剔除2个游离节点后的84个交集基因进行GO富集分析，共得到884个GO富集条目，其中包括724条生物过程（BP）、85个分子功能（MF）和75个细胞组成（CC）。BP主要与脂多糖的应答、炎症反应、MAP激活酶调节和氧化反应等有关；MF主要与蛋白质结合、细胞因子活性和蛋白酶结合等有关；CC主要与细胞外基质、细胞膜、细胞质和膜筏等有关。通过KEGG通路分析，共得到139条信号通路，KEGG通路富集分析显示主要与PI3K‑Akt信号通路、JAK‑STAT信号通路和IL‑17信号通路等有关，见图4。

2.2 分子对接结果

将PPI蛋白互作图中度值排名前15的核心蛋白（TNF、IL‑6、ALB、INS、AKT1、BCL2、IL‑1B、IFNG、HIF1A、TP53、TGFB1、MMP9、EGFR、IL‑10、STAT3）与六味补气方度值排名前5的核心成分（山奈酚、槲皮素、油酸、β‑谷甾醇、川陈皮素）利用Autodock1.5.6进行分子对接。小分子配体和蛋白受体的结合能≤-5.0 kcal/mol，表示可以结合，结合能数值越小，结合能越稳定^［17］。见表5。将IL‑6和IL‑10的对接结果导入PyMol2.6.0进行可视化处理并输出三维图，见图5。

2.3 动物实验结果

2.3.1 肺功能检测

与正常组比较，模型组的肺功能参数显著下降（P<0.01）；与模型组比较，用药组的肺功能参数显著上升（P<0.01，P<0.05）；与桂龙咳喘宁组比较，六味补气方高剂量组的肺功能参数升高，六味补气方低、中剂量组的肺功能参数下降（P<0.01，P<0.05），见图6。

2.3.2 肺组织支气管的病理学改变

正常组大鼠的肺泡壁和气管壁完整；肺泡形态规则，无炎性物质渗出。与正常组比较，模型组大鼠肺泡壁和气管壁增厚，肺泡形态不规则，有大量炎性物质渗出。与模型组相比，桂龙咳喘宁组和六味补气方低、中、高剂量组大鼠的支气管、气管壁、肺泡壁等肺组织的病理变化都得到了不同程度的改善，明显特征为肺组织和支气管周围的炎性物质渗出减少，改善最为明显的组是六味补气方高剂量组，见图7。

2.3.3 肺组织匀浆中IL‑10的水平

与正常组比较，模型组肺组织中IL‑10水平下降（P<0.01）；与模型组比较，各用药组IL‑10水平上升（P<0.01）；与桂龙咳喘宁组比较，六味补气方低剂量组IL‑10下降（P<0.01），六味补气方中剂量组IL‑10水平下降（P<0.01），六味补气方高剂量组IL‑10水平上升。见图8。

3 讨论

本研究通过网络药理学预测及分子对接与动物实验的验证，探索了六味补气方治疗COPD的潜在作用机制。六味补气方是基于新安医学“固本培元”理论而创制的，全方由黄芪、益智仁、人参、玉竹、陈皮、肉桂组成，具有益气化痰祛瘀之功^［18］。《本草经集注》中记载黄芪有补气固表、敛疮生肌之功效，黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，可抑制气道炎症反应，而黄芪多糖可调节免疫失衡^{［19‑21］}。益智仁性温，味辛，多用于脾肾虚寒不固所致诸症^［22］。人参可大补元气，温补脾肺，其中人参中含有皂苷类、糖类等多种化学成分，在调节免疫和抗炎抗菌等多方面发挥显著作用，也可改善COPD短气喘促，咳喘、咳痰等症状^{［23，24］}。玉竹对于肺胃阴伤，燥热咳嗽，内热消渴等症状具有较好的功效，其主要成分玉竹多糖具有免疫调节^［25］。《中国药典》中记录了川陈皮素、橙皮苷、橘皮素为陈皮的主要化学成分，具有疏理气机，祛湿化痰的作用^［26］。肉桂性辛、大热，可祛风散寒，又善补火助阳^［27］。肺为娇脏，需用甘凉、甘平、甘温等手段，将脏腑机能进行调补，达到补脾益肺的效果^［28］。六味补气方全方以参芪为君，益智为臣，陈皮、玉竹、肉桂为辅，通过脏腑间的生克制化，达到补益肺气，缓解肺功能障碍，改善肺部病理改变和减轻免疫炎症反应的作用，是治疗COPD的重要方剂。既往临床研究显示，六味补气方能够明显改善COPD稳定期患者的生存质量，增强患者的肺功能，降低患者的发病率^［6］。桂龙咳喘宁片由“龙骨、牡蛎、桂枝、法半夏、黄连、芍药、生姜、杏仁、炙甘草、瓜蒌皮”组成^［14］。有研究表明，桂龙咳喘宁片具有改善肺通气，降低炎症反应及平喘镇咳的作用，因此本研究选取具有扶正祛邪，宣肺，止咳化痰功效的桂龙咳喘宁片作为阳性对照药物以增强实验的客观性和可行性^{［29，30］}。

在本研究中，根据“药物‑有效成分‑作用靶点图”发现六味补气方的有效成分主要为山奈酚、槲皮素、油酸、川陈皮素和β‑谷甾醇等。其中，六味补气方可治疗COPD的活性成分有76个，相关作用靶点有778个，相互作用网络图显示各成分均对应多个靶点，各靶点又受多个成分调控，其中黄芪和人参的有效成分各含2个，由此推测黄芪和人参在六味补气方在发挥重要作用，符合六味补气方中参芪为君的地位。既往研究表明，山奈酚、槲皮素、川陈皮素都属于天然植物中的黄酮类化合物，具有低毒性、高活性的特点，能够抑制炎症和氧化应激^{［31，32］}。山奈酚可以使AKT1蛋白的磷酸化失活，阻断PI3K‑Akt信号通路，发挥抗炎作用，同时可以抑制LPS介导的炎症反应^{［33，34］}。槲皮素能够减少肺部炎症以及炎症和氧化介质的释放，有研究结果表明，槲皮素可以缓解由香烟烟雾引起的肺气肿，减轻肺损伤，改善肺功能，是预防COPD的潜在替代品^［35］。川陈皮素不仅具有抗炎和抗氧化应激作用，此外还起到抗肺纤维化的作用^［36］。β‑谷甾醇对降低急性肺损伤大鼠促炎因子TNF‑α和IL‑1β含量及升高抑炎因子IL‑10和IL‑4含量的作用非常显著，同时还具有抗肿瘤及免疫调节作用^{［37，38］}。

通过PPI网络图，发现治疗COPD的核心靶点有TNF、IL‑6、AKT1和IL‑10等。根据分子对接验证的结果可知：六味补气方的核心成分与PPI网络中核心靶点的结合能基本≤-5 kcal/mol，说明六味补气方中的核心成分与核心蛋白结合较稳定，可以起到干预COPD的作用，其中结合能较稳定的有IL‑6、AKT1等。COPD的发生、发展与气道炎症因子和细胞之间相互作用有着重要关联，甚至加重COPD的患病程度^［39］。IL‑6作为炎症水平标志物，与可溶性受体集合后可活化免疫细胞，加强机体释放大量促炎细胞因子和趋化因子，使机体正常组织细胞损坏及免疫系统失衡^［40］。Bian等^［34］研究结果表明，LPS能够诱导炎症因子TNF‑α、IL‑1β和IL‑6的过度表达。李学斌研究发现Foxp3 mRNA与IL‑10在COPD患者肺组织的含量明显下降，与此同时COPD的发生、发展还与Treg细胞数目的减少密切相关^［41］。

通过GO富集分析结果显示，生物过程主要集中于脂多糖应答、炎症反应、MAP激活酶的调节和氧化反应等；分子功能主要与蛋白质结合、细胞因子活性和蛋白酶结合等有关；核心蛋白主要集中于细胞外基质、细胞膜、细胞质和膜筏等位置。KEGG富集结果表明，六味补气方可介导PI3K‑Akt、JAK‑STAT和IL‑17等信号通路对COPD发挥治疗作用。炎症细胞因子和下游靶点可由PI3K/Akt 信号通路通过参与慢阻肺气道炎症反应进行调控^［42］。有研究表明，JAK‑STAT通路的激活与炎症因子的表达密切相关，通过激活JAK‑STAT通路，扰乱Th17/Treg平衡，从而加重COPD病程^［43］。IL‑17信号通路可以精确调控炎症转录过程中白细胞介素的含量，对自身免疫性疾病与炎症反应中的调节作用极其关键^［44］。基于上述论断，六味补气方干预COPD的过程可能与炎症、免疫等通路相关。

本课题组前期研究发现六味补气方可以下调IL‑4水平，上调INF‑γ水平并纠正Th1/Th2的平衡^［45］。课题组前期研究涉及Th1/Th2免疫平衡关系。Th1和Th2细胞均由Th细胞分化而来，同时Th细胞还能分化Th17细胞，Th17细胞介导的炎症反应可以通过IL‑10及其受体的分泌和信号转导抑制^［46］。因此，本研究将围绕IL‑10展开系列体内验证。依据前法，通过LPS滴注联合烟熏的造模方法建立COPD大鼠模型，检测肺功能参数和观察支气管肺组织病理变化，根据上述两种指标判断本研究的COPD模型成功建立与否。同时选取与六味补气方有效成分结合能较高的抑炎因子IL‑10，通过ELISA法检测COPD大鼠肺组织匀浆中IL‑10水平。实验结果表明，六味补气方各给药组呈现明显量效关系，量效关系最为明显的组为六味补气方高剂量组，说明六味补气方能够显著增强大鼠肺功能，改善支气管肺组织病理变化和抑制炎症反应，进一步验证了网络药理学预测的结果。

综上所述，六味补气方治疗COPD具有多成分、多靶点和多通路的作用特点。联合网络药理学与体内验证发现，六味补气方可增强肺功能，改善组织病理变化和上调IL‑10水平，初步探究了复方治疗COPD的作用机制与核心靶点IL‑10密切相关。另外，通过网络药理学和分子对接技术，初步探究六味补气方治疗COPD的作用机制，通过山奈酚、槲皮素、川陈皮素等有效成分，作用于TNF、AKT1、IL‑6、和IL‑10等多个核心靶点，影响PI3K‑Akt、JAK‑STAT和IL‑17等多条信号通路实现，可为下一步研究提供参考。此外，本研究采取的实验研究方法较简单，尚未对预测中可治疗COPD的有效成分进行体内验证，后续有必要开展更深入的分子生物学实验，为本研究所预测结果提供更加精准的实验依据。

作者贡献度说明：

赵晶燕：设计文章的框架与思路，撰写论文初稿；赵晶燕，栾雪婧：绘制图表和论文结果的可视化呈现；赵晶燕，吴柏合，蒋庆要和方远：动物实验设计和实施；刘向国：论文终稿审定、文章质量控制及审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

安徽省自然科学基金资助项目(1708085MH222)