雷藤舒通过p53/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡在类风湿关节炎小鼠模型中的治疗作用及其分子机制研究

Exploration of the therapeutic efficacy and molecular mechanisms of (5R)‑5‑Hydroxytriptolide in modulating ferroptosis via the p53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway in a murine model of rheumatoid arthritis

摘要

目的 观察雷藤舒对类风湿关节炎小鼠铁死亡的影响及治疗作用，并基于肿瘤蛋白53（p53）/溶质载体家族7成员11（SLC7A11）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）通路探究其可能机制。 方法 将40只雄性DBA小鼠，分为Control组、Model组、雷藤舒（LLDT‑8）组（0.5 mg/kg）和铁死亡抑制剂（Fer‑1）组（1 mg/kg），每组10只。除Control组外，采用Ⅱ型胶原诱导法制备类风湿关节炎（CIA）模型。造模成功后，各给药组进行相应药物干预，Control组和Model组灌胃等体积生理盐水，干预周期为4周。主要观察指标包括：小鼠足趾厚度及关节炎临床评分；微计算机断层扫描评估骨破坏；苏木素‑伊红染色和番红O‑固绿染色法评估关节组织病理学变化；酶联免疫吸附测定法检测血清中MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β和IL‑6；比色法检测关节组织中MDA、GSH和NADPH含量；免疫荧光检测关节组织中的ROS；免疫组化法及实时荧光定量PCR检测SLC7A11、GPX4、p53蛋白及mRNA表达。 结果 与Control组比较，Model组小鼠关节红肿畸形，关节炎临床评分明显升高，关节组织骨破坏、滑膜增生及炎性细胞浸润，血清MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6水平明显上升；关节组织GSH、NADPH水平明显升高，ROS、MDA含量明显降低；SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达均明显上调，p53蛋白及mRNA表达下调，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。与Model组比较，LLDT‑8组可显著改善小鼠关节肿胀变形，降低关节炎临床积分，减轻小鼠关节骨破坏以及减少炎症细胞浸润和滑膜增生，血清MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6表达水平明显降低，关节组织GSH、NADPH水平明显降低，ROS、MDA含量明显升高，SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达均明显下调，p53蛋白及mRNA表达上调，组间差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 雷藤舒可有效减轻CIA小鼠滑膜增生及炎性浸润，缓解关节组织病理损伤，其机制或与调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路，增加铁死亡敏感性有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of （5R）‑5‑Hydroxytriptolide （LLDT‑8） on ferroptosis in a murine model of rheumatoid arthritis （RA） and to elucidate its underlying mechanisms via the tumor protein 53 （p53）/solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11）/glutathione peroxidase 4 （GPX4） signaling pathway. Methods A total of 40 male DBA mice were allocated into the Control， the Model，the LLDT‑8 （0.5 mg/kg）， and the Ferroptosis inhibitor （Fer‑1） （1 mg/kg）groups， with 10 mice per group. All groups except the Control received collagen type Ⅱ to induce collagen‑induced arthritis （CIA）. Following the successful modeling， the treatment groups were administered their respective drugs， while the Control and Model groups were gavaged with an equal volume of saline for 4 weeks. The key observation metrics included： the thickness of the mice's toes and clinical scores for arthritis； assessment of bone damage using micro‑computed tomography； examination of pathological changes in joint tissues via hematoxylin‑eosin staining and Sirius Red‑O green staining； measurement of serum levels of MMP‑3， TNF‑α， IL‑1β， and IL‑6 using enzyme‑linked immunosorbent assay； evaluation of MDA， GSH， and NADPH contents in joint tissues through colorimetric methods； detection of reactive oxygen species （ROS） in joint tissues via immunofluorescence； and analysis of SLC7A11， GPX4， and p53 protein and mRNA expression using immunohistochemistry and real‑time quantitative polymerase chain reaction. Results The Model group exhibited significant joint swelling， deformities， and increased clinical scores， along with pronounced bone destruction， synovial hyperplasia， and inflammatory cell infiltration compared to the Control group. Serum levels of MMP‑3， TNF‑α， IL‑1β， and IL‑6 were significantly elevated， while GSH and NADPH levels in joint tissues were markedly increased， and ROS and MDA content were significantly reduced. Notably， SLC7A11 and GPX4 protein and mRNA expressions were significantly upregulated， whereas p53 protein and mRNA expressions were notably downregulated （P<0.05）.Compared to the Model group treatment with LLDT‑8 led to significant improvements in joint swelling and deformities， a reduction in clinical scores， mitigation of bone destruction， and a decrease in inflammatory cell infiltration and synovial hyperplasia. Additionally， serum levels of MMP‑3， TNF‑α， IL‑1β， and IL‑6 were significantly lowered， while GSH and NADPH levels in joint tissues decreased， and ROS and MDA content significantly increased. The protein and mRNA expressions of SLC7A11 and GPX4 were significantly downregulated， whereas p53 protein and mRNA expressions were upregulated （P<0.05）. Conclusion LLDT‑8 effectively reduces synovial hyperplasia and inflammatory infiltration in CIA mice， alleviating pathological damage to joint tissues. Its mechanism may involve the modulation of the p53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway， thereby enhancing sensitivity to ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

类风湿关节炎 / 铁死亡 / 雷藤舒 / 炎症

Key words

Rheumatoid arthritis / Ferroptosis / （5R）‑5‑Hydroxytriptolide / Inflammation

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种以持续性滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病，可导致骨破坏甚至关节畸形，严重影响患者的生活质量，给患者带来极大的精神、经济负担^［1］。目前临床上治疗RA主要通过非甾体抗炎药、改善病情抗风湿药、激素、生物制剂等，虽然这些治疗手段在缓解关节炎症和延缓疾病进展方面具有一定的效果，但高昂的费用和副作用多等问题限制了它们的临床应用^［2］。因此，开发更为高效和可靠的治疗策略显得尤为重要。

RA的发病机制极为复杂，涉及免疫系统、遗传因素、环境因素等多个层面^［3］。在这些因素中，成纤维样滑膜细胞（fibroblast‑like synoviocytes， FLS）的异常增殖和炎症反应的失调被认为是RA发病的关键因素^［4］。因此，促进FLS的程序性死亡并抑制其异常增殖，已成为RA研究领域的一个热点问题。铁死亡作为一种新型的细胞死亡方式，其特征是在铁离子的催化下，细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）的累积导致多不饱和脂肪酸的过氧化，进而引发细胞膜的损伤和细胞死亡^［5，6］。这一过程与RA‑FLS的异常表型密切相关，因此，铁死亡的调控机制可能为RA的治疗提供新的靶点。

在中医学中，RA被归类为“痹症”，其治疗有着深厚的历史积淀，积累了大量宝贵的经验。据《本草汇言》记载，藤类药物以其“藤蔓之属，皆可通经入络”的特性，擅长游走经络，具有祛风湿、解筋挛、舒筋活络的功效^［7］。在这些药物中，雷公藤以其显著的治疗效果在RA治疗中占据代表性地位^［8，9］。然而，雷公藤的毒副作用也限制了其在临床上的广泛应用。因此，研究和开发减毒增效的新型雷公藤制剂，对于提高RA治疗效果、减少不良反应具有重要意义。雷藤舒［（5R）‑5‑Hydroxytriptolide，LLDT‑8）］，作为雷公藤内酯醇的结构修饰优化产物，与原始化合物相比，LLDT‑8在显著降低体内外毒性的同时，保留了较强的免疫抑制活性^{［10‑12］}，显示出作为RA治疗新型免疫抑制剂的潜力。本研究的目的是利用Ⅱ型胶原诱导的关节炎（collagen‑induced arthritis， CIA）小鼠模型，探讨LLDT‑8对RA中铁死亡的影响及其作用机制，从而为LLDT‑8在临床应用及后续研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级DBA／１雄性小鼠40只，8周龄，体质量（25±3）g，由上海斯莱克实验动物中心提供，饲养于上海中医药大学动物房。实验动物生产许可证：SCXK（沪）2022‑0004。饲养条件：室温21~25 ℃，湿度：36%~46%，自由摄食饮水，给予光照昼夜交替。所有动物实验得到本院动物伦理委员会的批准。实验研究伦理审批号：2021‑K‑12。

1.2 主要试剂与仪器

LLDT‑8（批号：235‑95，上海医药集团）；Fer‑1（批号：HY‑100579，美国MCE公司）；GSH检测试剂盒、MDA检测试剂盒（南京建成生物，货号分别为A007‑1‑1、A003‑1‑2）、NADPH检测试剂盒（上海Beyotime公司，货号：ST360）；Trizol、RIPA裂解液、BCA蛋白试剂盒、PBS缓冲液（上海Beyotime公司，货号分别为R0016、P0013c、P0010s、C0221a）；ROS染液（南京建成生物，货号：E004‑1‑1）；兔单抗SLC7A11（美国MCE公司，货号：HY‑P80935）；鼠单抗GPX4（武汉proteintech公司，货号：67763‑1‑Ig）；兔多抗p53（武汉proteintech公司，货号：10442‑1‑AP）；GAPDH、HRP标记羊抗兔二抗及HRP标记羊抗小鼠二抗（武汉BOSTER生物有限公司，货号分别为BA2913、BA1051、BA1054）；基质金属蛋白酶3（MMP‑3）、肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）、白细胞介素‑1β（IL‑1β）、白细胞介素‑6（IL‑6）测定试剂盒（武汉elabscience公司，货号分别为E‑EL‑M0626、E‑EL‑M3063、E‑EL‑M0037、E‑EL‑M0044）；苏木素‑伊红（H&E）染色试剂盒、番红O‑固绿染色试剂盒（北京索莱宝公司，货号分别为G1120、G1371）；TRIzol™Plus RNA纯化试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（日本Takara Bio公司，货号分别为12183555、A45003、1176102K）；不完全弗氏佐剂（美国Chrondex公司，货号：7002）；牛Ⅱ型胶原（美国Chrondex公司，货号：2002）。SPECT/CT型微计算机断层扫描（Micro CT）仪（美国GE Healthcare公司）；Olympus BX53型显微镜（日本Olympus公司）； RT‑6100型酶标仪（美国Rayto公司）；StepOne Plus实时定量PCR仪（美国Thermo公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 实验药物的配置

LLDT‑8由上海医药集团股份有限公司合成并提供，其配制方法为：称取10 mg的T8溶解于 1 mL的DMSO中，充分混匀后，再取2 μL该溶液加入到2 656.7 μL的PBS中，充分混合，最终得到浓度为2×10⁴ nmol/L的LLDT‑8溶液，分装备用。

1.3.2 动物分组及给药

DBA小鼠适应性饲养３ d，随机分为4组：Control组、Model组、LLDT‑8组（0.5 mg/kg）、LLDT‑8+Fer‑1组（1 mg/kg），每组10只。初次免疫21 d起，各给药组相应剂量药物灌胃，LLDT‑8组剂量参考既往研究确定^［13］。Control组、Model组等量生理盐水灌胃，每天1次，共4周。

1.3.3 CIA小鼠模型的建立

将适量的牛Ⅱ型胶原乙酸溶液少量多次加入等体积的不完全弗氏佐剂中，在冰浴条件下充分混合乳化，直至乳液在水中不扩散。除Control组外，每只小鼠尾根部皮内注射0.2 mL（1 g/L）乳液。第7天进行二次免疫，每只小鼠尾根部注射0.1 mL乳液。Model组小鼠关节出现红肿畸形等变化视为造模成功^［14］。

1.3.4 关节炎临床评分

自第1次免疫的第7天开始，每3天进行1次评分，每足4分制，共16分。积分标准^［15］：小鼠四肢每肢评分为0~4分，0分为无肿胀，1分为小趾关节红肿，2分为趾关节和足跖肿胀，3分为踝关节以下的足爪肿胀，4分为包括踝关节在内的全部足爪肿胀。

1.3.5 踝关节炎形态微计算机断层扫描（Micro CT）扫描观察和骨计量学指标

将小鼠右踝关节在组织固定液中固定72 h，随后进行Micro CT扫描，并用GEHC Microview进行测量，分析踝关节的骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）。

1.3.6 H&E染色观察小鼠关节组织形态变化

小鼠踝关节组织固定24 h后进行脱钙、梯度乙醇脱水、二甲苯透明化处理，然后石蜡包埋切片。脱蜡、水化后采用H&E染色，封片，光学显微镜下观察关节滑膜组织病理改变并采集图像。

1.3.7 番红O‑固绿染色法观察软骨形态改变

将小鼠踝关节标本在4%多聚甲醛中常温固定24 h后，用10%EDTA脱钙液脱钙，在37 ℃、转速70 r/min的恒温振荡器中进行。脱钙后用清水冲洗，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片。烤制后在二甲苯中溶解石蜡，依次放入番红O染液和固绿染液染色后快速吹干并封片。最后在光学显微镜下观察软骨变化情况并摄像。

1.3.8 酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6水平

取血清，实验步骤按照试剂盒操作说明进行，检测血清中MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的水平。

1.3.9 免疫荧光检测小鼠关节组织ROS水平

取冰冻关节组织切片，滴加ROS染液（1∶400），湿盒中孵育过夜，次日滴加荧光二抗，室温避光孵育20 min，DAPI复染细胞核，避光孵育10 min，封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3.10 比色法检测关节组织GSH、MDA、NADPH水平

取小鼠关节组织，RIPA裂解，冰上玻璃匀浆，预冷PBS洗涤，制备10%组织匀浆，离心后取上清提取总蛋白。根据试剂盒要求，利用酶标仪在532 nm测定MDA水平，以及在410和450 nm测定GSH和NADPH水平。

1.3.11 免疫组织化学法检测小鼠关节组织p53、SLC7A11、GPX4蛋白表达

石蜡包埋切片、烤片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡，枸橼酸盐修复液高压热修复，分别滴加p53、SLC7A11、GPX4抗体（浓度分别为1∶150，1∶200，1∶200），4 ℃孵育过夜。次日滴加二抗反应，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察拍照，利用ImagePro Plus6.0软件进行定量分析。

1.3.12 实时荧光定量聚合酶链式反应检测小鼠关节组织p53、SLC7A11、GPX4表达

取-80 ℃保存的小鼠关节组织，TRIzol法提取样本总RNA，逆转录后取cDNA。引物由上海生工股份有限公司设计并合成（表1）。实验数据采用2^-△△CT法进行分析，以GAPDH作为参考标准，计算p53、SLC7A11、GPX4 mRNA的相对表达水平。

1.4 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0对实验数据进行统计分析，所有数据经过Shapiro‑Wilk正态性检验。如果数据符合正态分布，采用Student's t检验比较两组差异，多组差异使用单因素方差分析（One‑way ANOVA）。不符合正态分布的数据则使用非参数检验，两个组之间使用Mann‑Whitney秩和检验，多组使用Kruskal‑Wallis检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雷藤舒对 CIA小鼠关节肿胀和临床评分的影响

Control组小鼠足及关节未见红肿，关节炎评分为0分。与Control组相比，二次免疫后Model组小鼠后肢出现足垫增厚和足趾红肿，踝关节逐渐僵硬、肿胀，关节炎评分及足跖肿胀显著升高（P<0.001）。药物干预后，LLDT‑8组明显减轻CIA小鼠的关节红肿和畸形，关节炎评分及足跖肿胀显著降低（P<0.01，P<0.05）。而LLDT‑8+Fer‑1组的小鼠关节红肿加重，足跖肿胀程度增加，与LLDT‑8组差异显著（P<0.05），见图1，提示LLDT‑8可有效缓解CIA小鼠关节炎病情。

2.2 雷藤舒对CIA小鼠关节骨破坏的影响

Micro CT扫描结果显示，Control组小鼠踝关节完整光滑；Model组则表面凹凸不平，关节软骨有一定破损，差异显著（P<0.001）。与Model组相比，LLDT‑8组关节骨侵蚀较轻，破损改善，BMD和BV/TV显著升高（P<0.01，P<0.05）。而LLDT‑8+Fer‑1组的关节骨侵蚀加重，破损明显，BMD和BV/TV显著下降（P<0.001，P<0.01），见图2。

2.3 雷藤舒对CIA小鼠关节组织病理的影响

H&E染色结果显示，Control组小鼠踝关节滑膜组织正常，Model组滑膜组织增生，炎症细胞浸润明显。LLDT‑8组滑膜组织病理损伤减轻，炎症细胞浸润减少，差异显著（P<0.01）。与LLDT‑8组相比，LLDT‑8+Fer‑1组滑膜损伤加重，增生和炎症细胞浸润明显，差异显著（P<0.01），见图3。此外，番红O‑固绿染色显示，Control组软骨表层光滑且染色均匀；Model组软骨表层不光滑，表面损伤明显，染色浅，裂纹多，潮线不清。LLDT‑8组软骨相对光滑，染色均匀，潮线较完整，差异显著（P<0.05）。LLDT‑8+Fer‑1组软骨病变有所加重，但无明显统计学差异（P>0.05），见图3。

2.4 雷藤舒对CIA小鼠血清中炎症因子表达的影响

与Control组相比，Model组小鼠血清中IL‑6、TNF‑α和MMP‑3水平显著升高（P<0.001，P<0.01，P<0.001）。与Model组相比，LLDT‑8组小鼠这3种指标显著降低（P<0.001，P<0.05）。而与LLDT‑8组相比，LLDT‑8+Fer‑1组小鼠血清中IL‑6和TNF‑α水平显著升高，见图4。

2.5 雷藤舒对CIA小鼠关节滑膜中ROS表达的影响

与Control组相比，Model组小鼠关节组织的ROS荧光强度降低。与Model组相比，LLDT‑8组的关节组织ROS表达范围增大，荧光强度增强。而LLDT‑8+Fer‑1组与LLDT‑8组相比，ROS荧光表达范围和强度均减少，见图5。

2.6 雷藤舒对CIA小鼠关节组织GSH、MDA、NADPH水平的影响

与Control组相比，Model组小鼠关节组织中GSH和NADPH水平上升（P<0.001），而MDA水平明显降低（P<0.001）。与Model组相比，LLDT‑8组中GSH和NADPH水平明显降低（P<0.001），MDA水平明显升高（P<0.001）。与LLDT‑8组相比，LLDT‑8+Fer‑1组的指标变化趋势相反（P<0.001，P<0.01），见图6。

2.7 雷藤舒对CIA小鼠关节滑膜中p53/SLC7A11/GPX4通路关键蛋白表达的影响

与Control组比较，Model组小鼠关节组织中GPX4、SLC7A11表达显著增强（P<0.001），p53表达降低（P<0.001）。与Model组相比，LLDT‑8组小鼠关节组织GPX4、SLC7A11表达明显减弱（P<0.001，P<0.01），p53表达增强（P<0.01）。与LLDT‑8组比较，LLDT‑8+Fer‑1组对应指标变化趋势与上述相反（P<0.01，P<0.05），见图7。

2.8 雷藤舒对CIA小鼠关节组织p53、SLC7A11及GPX4 mRNA表达的影响

与Control组相比，Model组小鼠关节组织中SLC7A11和GPX4的mRNA表达显著增加（P<0.001），而p53的mRNA表达降低（P<0.001）。与Model组相比，LLDT‑8组的小鼠关节组织中SLC7A11和GPX4的mRNA表达明显减少（P<0.001，P<0.01），而p53的mRNA表达则增加（P<0.01）。与LLDT‑8组相比，LLDT‑8+Fer‑1组的GPX4 mRNA表达明显增加（P<0.01），而SLC7A11和p53的变化差异无统计学意义（P>0.05），见图8。

3 讨论

RA是一种慢性系统性疾病，其特征性病理改变包括持续性滑膜炎、滑膜血管翳的增生以及骨和软骨的破坏^［1］。RA的发病率较高，且可能导致关节畸形和功能障碍，这些不可逆的损伤已构成全球性的公共卫生挑战^［16］。在中医学中，RA被归类为“痹证”，其发病机制涉及外感风寒湿邪以及内因肝肾亏虚、气血不足等因素，病理特点主要表现为本虚标实^［17］。中医药在RA的治疗上展现出多靶点干预、经济性、较低的副作用以及明确的疗效等优势^［18］。LLDT‑8作为对雷公藤内酯醇进行结构优化的衍生物，已证实具有抗炎、抗氧化和免疫调节等多重药理作用^［8‑12］。研究表明，LLDT‑8能够显著改善RA患者的关节炎症和免疫失衡状态^［19］，显示出作为RA治疗候选药物的潜力。本研究通过Ⅱ型胶原诱导法成功构建了RA的小鼠模型，该模型模拟了RA的典型临床表现，包括前肢、后肢关节及踝关节的红肿与畸形。在RA的发病机制中，体内炎症微环境的失衡及炎症因子的异常分泌起着关键作用。在本实验中，Model组小鼠的足部肿胀度和关节炎临床评分显著高于Control组，关节组织病理学检查显示滑膜显著增生和炎性细胞的大量浸润。血清学分析发现，Model组小鼠的MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6水平显著升高。这些变化与RA的病理过程密切相关。此外，足部肿胀度、关节炎临床评分和关节病理变化是评估RA治疗效果的重要指标。实验结果表明，经过LLDT‑8干预后，CIA小鼠的足跖肿胀度和关节炎临床评分显著降低，关节滑膜组织的增生和炎症病理改变得到明显改善。血清学分析显示，MMP‑3、TNF‑α、IL‑1β、IL‑6水平均显著下降。这些结果表明LLDT‑8能够显著改善CIA小鼠的关节组织损伤和功能障碍，从而验证了其作为RA潜在治疗药物的疗效。

滑膜内膜层被认为是RA炎症的主要发生区域，其中FLS和滑膜巨噬细胞作为关键细胞成分，发挥着重要作用。这些细胞通过分泌软骨基质酶和细胞因子，促进免疫细胞的浸润，参与了RA炎症的发生与进展^［4，20］。因此，针对FLS过度活化的抑制策略被视为RA治疗的一种潜在方法，旨在减缓关节破坏的进程。近年来，铁死亡作为一种新型的细胞程序性死亡机制，因其铁依赖性的脂质过氧化特征而备受关注。研究表明，铁死亡可能通过影响铁代谢、GSH代谢、GPX4活性、脂质过氧化等途径参与RA的发病过程^{［21‑26］}。研究发现，RA患者的FLS细胞中，抗氧化水平高于氧化水平。此外，与健康对照组相比，RA患者FLS中铁死亡的发生率较低，表明RA‑FLS的抗氧化剂系统高度激活，能够抵御铁死亡并异常增殖活化^［22］。在众多抗氧化剂系统中，System Xc‑/GSH/GPX4是最主要的一个。抑制System Xc‑的功能会导致半胱氨酸依赖性GSH合成的减少，从而影响细胞膜内半胱氨酸的氧化还原状态。这一变化会削弱细胞的抗氧化防御能力，导致ROS的积累^［27］。在调控铁死亡的过程中，p53/SLC7A11/GPX4信号通路发挥着重要作用。作为一个重要的抑癌基因，p53通过与特定蛋白质的相互作用及对靶基因的选择性转录调控，影响铁死亡相关代谢产物的动态平衡^{［28，29］}。SLC7A11是System Xc‑的关键组成部分，也是p53调控铁死亡信号通路的重要下游分子。具体而言，p53通过抑制SLC7A11的转录，减少胱氨酸的摄取，从而干扰GSH的合成，影响System Xc‑/GSH/GPX4的抗氧化作用。这一系列变化导致脂质ROS的积累，使细胞对铁死亡变得更加敏感，最终诱发铁死亡的发生^{［28，30］}，见图9。这些发现为RA的治疗提供了新的分子靶点。本次实验结果显示，与Control组相比，Model组小鼠血清炎症因子与关节组织GSH、NADPH水平明显升高，ROS、MDA含量明显降低，SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达均明显上调，p53蛋白及mRNA表达下调，表明CIA小鼠存在铁死亡紊乱。而在LLDT‑8组中，血清中炎症因子与关节组织中GSH、NADPH表达水平明显降低，ROS、MDA含量升高，SLC7A11、GPX4蛋白及mRNA表达均明显下调，p53蛋白及mRNA表达上调。而LLDT‑8+Fer‑1组则逆转了上述现象。以上结果提示，LLDT‑8可有效减轻CIA小鼠滑膜增生及炎性浸润，缓解关节组织病理损伤，其机制或与调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路，抑制高度激活的抗氧化系统，增加滑膜组织铁死亡敏感性有关。

本研究通过对CIA小鼠模型的分析，揭示了p53/SLC7A11/GPX4信号通路在RA发病机制中的重要作用。研究发现，Model组小鼠关节组织中p53、SLC7A11、GPX4关键蛋白表达显著上调，这与已有文献报道相一致^{［21，23］}。LLDT‑8作为雷公藤内酯醇的结构优化产物，能够显著降低这些关键蛋白的表达，表明其可能通过调节p53/SLC7A11/GPX4信号通路，诱导铁死亡，从而缓解RA的炎症反应。在CIA小鼠模型中，LLDT‑8不仅有效减轻了小鼠关节的红肿、畸形等临床症状，还显著改善了骨质破坏，显示出改善RA病情的潜力。这些发现为LLDT‑8治疗RA提供了实验依据，也为临床合理用药及进一步的药物研发提供了指导。

作者贡献度说明：

范鋆钰：论文选题、实验操作、论文撰写与修改；姜婷：论文审阅与修改；何东仪：指导老师。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82104634)

上海市卫生健康委员会科研项目(20214Y0165)

中华中医药学会青年培英计划资助项目(XH2024‑591)

上海市长宁区卫健委星云计划资助项目(CNWJXY011)