LncRNA MIAT/miR‑150‑5p/NEGR1分子轴在大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的表达

Expression of the LncRNA MIAT/miR‑150‑5p/NEGR1 axis in rat spinal cord ischemia‑reperfusion injury

摘要

目的 探讨lncRNA MIAT/miR-150-5p/NEGR1分子轴在大鼠脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI）中的表达及其可能的机制。 方法 建立SCIRI大鼠模型，将18只SD大鼠分为假手术（Sham）组和SCIRI模型（I/R）组，每组9只。神经功能评分评估大鼠后肢运动活动情况，H&E染色和尼氏染色观察脊髓组织病理变化及神经元尼氏体形态结构，qRT-PCR检测脊髓组织中lncRNA MIAT、miR‑150‑5p和NEGR1的mRNA表达，利用Starbase数据库、TargetScan7.2靶基因预测网站及双荧光素酶报告基因检测验证lncRNA MIAT与miR‑150‑5p、miR‑150‑5p与NEGR1靶向调控关系。 结果 与Sham组相比，I/R组大鼠Basso-Beattie-Bresnahan评分显著降低（P<0.05），脊髓组织可见神经元损伤，尼氏体数量减少，lncRNA MIAT和NEGR1的表达显著上调（P<0.05），miR-150-5p的表达显著下调（P<0.05）。双荧光素酶报告基因检测结果显示，lncRNA MIAT与miR-150-5p、miR-150-5p与NEGR1之间均存在靶向调控关系。 结论 LncRNA MIAT在SCIRI模型大鼠中高表达，其可能通过调控miR-150-5p/NEGR1分子轴参与SCIRI发生、发展。

Abstract

Objective To investigate the expression and possible mechanisms of lncRNA MIAT/miR-150-5p/NEGR1 axis in rat spinal cord ischemia-reperfusion injury （SCIRI）. Methods A SCIRI rat model was established， and 18 SD rats were divided into the Sham group and the SCIRI model （I/R） group， with 9 rats in each group. Neurological function score was used to evaluate hind limb motor activity in rats. H&E staining and Nissl staining were used to observe the pathological changes of spinal cord tissue and the morphology and structure of neuron Nissl bodies. qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of lncRNA MIAT， miR‑150‑5p， and NEGR1 in spinal cord tissue. The targeted regulatory relationship between lncRNA MIAT and miR-150-5p as well as miR-150-5p and NEGR1 was verified by Starbase database， TargetScan7.2 target gene prediction website， and double luciferase reporter gene assay. Results Compared to the Sham group， the Basso-Beattie-Bresnahan score was significantly lower （P<0.05）， neuronal injury was observed in spinal cord tissue， the number of Nissl bodies decreased， the expression of lncRNA MIAT and NEGR1 were significantly up-regulated （P<0.05）， and the expression of miR-150-5p was significantly down-regulated （P<0.05） in I/R group. Dual luciferase reporter gene detection results showed that there were targeted regulatory relationships between lncRNA MIAT and miR-150-5p as well as miR-150-5p and NEGR1. Conclusion LncRNA MIAT is highly expressed in SCIRI model rats， which may be involved in the occurrence and development of SCIRI by regulating miR-150-5p/NEGR1 axis.

Graphical abstract

关键词

脊髓缺血再灌注损伤 / lncRNA MIAT / miR-150-5p / NEGR1

Key words

Spinal cord ischemia-reperfusion injury / lncRNA MIAT / miR-150-5p / NEGR1

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI）是严重的继发性脊髓损伤之一，常见于脊柱、胸腹主动脉瘤术后，会诱发一系列损伤（如神经元损伤），导致功能丧失和行为障碍，严重者可导致截瘫，给患者及其家属带来巨大经济和精神负担^［1，2］。SCIRI机制复杂，其发生可能与细胞凋亡、炎症、兴奋性氨基酸毒性、活性氧的过量产生等有关^［3］。目前临床上仍无有效药物及治疗措施，因此迫切需要寻找早期诊断及治疗SCIRI的分子靶点。从分子生物学层面解释疾病的发生、发展的原因，可以将疾病的发生发展归因于信号调控网络系统中具有特殊功能的基因发生异常表达并以调控网络的形式，从整体上影响了整个机体的稳态，进而引起机体为应对不同刺激而选择的急性应激反应。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的异常表达往往伴随着每种疾病的发生发展^［3］。多项研究表明lncRNA在SCIRI的发病机制中发挥了重要作用，但lncRNA在SCIRI中的功能和机制仍未完全阐明^［4，5］。大量研究证实，lncRNA和miRNA均与SCIRI的发展密切相关。作为小型且进化保守的非编码RNA系列，微小RNA（miRNA）能够通过抑制靶标mRNA的翻译或促进mRNA的降解来调节生理和病理过程^［6］。研究表明lncRNA-mRNA竞争性内源RNA网络在缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，I/R）的转录调控中发挥作用，内源性竞争RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）可与miRNA结合，调节具有相同反应元件的RNA的表达^［7］。其中lncRNA和mRNA可以通过共享至少一个miRNA反应元件，作为miRNA海绵与miRNA竞争，来抑制其他RNA的功能^［8，9］。LncRNA MIAT是一种与缺血、低氧疾病相关的lncRNA，Li等^［10］研究显示lncRNA MIAT过表达降低缺氧缺血性损伤中神经元的凋亡。但目前，关于lncRNA MIAT在SCIRI中的研究相对较少，因此，本研究旨在揭示lncRNA MIAT在SCIRI中的作用及其可能的机制，为SCIRI的潜在新型诊断标记和治疗靶点提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

18只健康雄性SPF级SD大鼠，8周龄，体重（260±20） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0104，动物实验伦理号：HLK-20200305-001。

1.2 主要试剂

戊巴比妥钠购自Sigma公司，伊红和中性树脂购自Solarbio公司，苏木精染液和尼氏体染色液购自Servicebio公司，Trizol购自Ambion公司，SYBR™ FAST qPCR Master Mix购自KAPA Biosystems公司，反转录试剂盒购自TAKARA公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 SCIRI大鼠模型构建

参考文献［11］进行SCIRI大鼠模型构建：大鼠称重后经腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，剃毛备皮，取仰卧位，无菌条件下选取腹部正中切口，钝性分离周围软组织后，用动脉夹夹闭左肾下方腹主动脉，45 min后恢复血供，逐层关闭腹腔。术后12、24、48 h进行神经功能评分。造模48 h后，处死大鼠，取腰椎段脊髓。

1.4 实验分组

采用随机数字表法将18只大鼠分为假手术（Sham）组和SCIRI模型（I/R）组，每组9只。Sham组仅切开腹腔，不夹闭腹主动脉。I/R组按“1.3 SCIRI大鼠模型构建”项进行造模。

1.5 神经功能评分

根据Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分标准表从0（完全麻痹）到21（正常运动）评估术后12、24、48 h大鼠后肢运动活动情况^［12］。

1.6 H&E染色

将大鼠脊髓组织样本从固定液中取出，脱水浸蜡包埋，包埋完成的组织样本于-20 ℃冷冻至适当硬度后切成厚度为3 µm的切片，水浴展片使切片无气泡、烤片。将脊髓组织切片进行常规脱蜡至水处理，水洗1 min后加入苏木精染液然后3 min，水洗后加入利用促蓝液处理10 s返蓝，流水冲洗30 s，伊红染液染色3 min，梯度乙醇（85%、90%、100%）分别处理30、30、10 s，脱水后二甲苯透明3 s。最后用中性树脂封片，显微镜下观察组织病理变化，并拍照。

1.7 尼氏染色

将大鼠脊髓组织样本从固定液中取出，按“1.6 H&E染色”项步骤脱水浸蜡并包埋，切成厚度为3 µm的切片，展片、烤片，脱蜡至水。然后加入尼氏体染色液染色5 min，去离子水冲洗，甩干切片上多余水分，烘箱65 ℃烤干，中性树脂封片，显微镜下观察神经元尼氏体形态结构。

1.8 qRT‑PCR检测

取大鼠脊髓组织样本约100 mg，Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行扩增。扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s，共40个循环。PCR引物由武汉天一华煜基因科技有限公司合成。引物序列见表1。反应结束后获取CT值，以GAPDH和U6为内参，采用2^-∆∆CT法进行统计分析。

1.9 双荧光素酶报告基因检测

将荧光素酶报告载体（pmirGLO-lncRNA MIAT-野生型和pmirGLO-lncRNA MIAT-突变型）分别与miR-150-5p-mimics和miR-150-5p-NC用脂质体法转染HEK-293细胞，转染4 h后换新鲜培养基，转染24 h。严格按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行实验操作，结果以萤火虫荧光素酶活性值与海肾荧光素酶活性值的比值表示。

将荧光素酶报告载体（pmirGLO-NEGR1-野生型和pmirGLO-NEGR1-突变型）分别与miR-150-5p-mimics和miR-150-5p-NC用脂质体法转染HEK-293细胞，转染4 h后换新鲜培养基，转染24 h。严格按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行实验操作，结果以萤火虫荧光素酶活性值与海肾荧光素酶活性值的比值表示。

1.10 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，实验结果均以平均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BBB评分

I/R组大鼠在造模后12、24、48 h时的BBB评分均显著低于Sham组（P<0.05），随着时间的推移，I/R大鼠BBB评分有所下降，但无显著性差异（P>0.05）。综上所述，表明I/R组大鼠后肢运动功能明显受损，造模成功，见图1。

2.2 各组大鼠脊髓组织H&E染色

大鼠脊髓组织横断面中脊髓前角部位的神经元结构见图2，Sham组大鼠脊髓组织神经元结构完整，轮廓清晰，可见细胞浆中尼氏体，细胞核圆形，核仁清晰可见。I/R组大鼠脊髓组织可见神经元损伤，细胞核溶解，核仁模糊，尼氏体减少。

2.3 各组大鼠脊髓组织尼氏染色

Sham组大鼠脊髓组织尼氏体结构清楚，分布均匀，数量较多。I/R组大鼠脊髓组织部分尼氏体结构受损，与Sham组相比数量显著减少（P<0.05），见图3。

2.4 大鼠脊髓组织中lncRNA MIAT的表达

与Sham组相比，I/R组大鼠脊髓组织中lncRNA MIAT的表达显著上升（P<0.05），见图4。

2.5 大鼠脊髓组织中候选miRNA和mRNA的表达

通过前期文献总结，发现14个与lncRNA MIAT相关miRNAs。qRT-PCR检测其在SCIRI大鼠脊髓组织中的mRNA表达，见图5。9个（miR‑181b‑5p、miR‑00a、miR‑141、miR‑29c、miR‑132‑3p、miR‑133、miR‑214、miR‑34a、miR‑29a‑3p）miRNA在SCIRI大鼠脊髓组织中显著上调（P<0.05），1个（miR‑150‑5p）miRNA在SCIRI大鼠脊髓组织中显著下调（P<0.05）。

后续选取下调的miR-150-5p做进一步深入研究。进一步采用miRNA靶基因预测工具（miRDB、miRTarBase、TargetScan）预测上述miRNAs靶基因，取交集后采用DAVID在线工具进一步分析预测靶基因的GO及KEGG通路，选取与神经、血管、水肿等SCIRI病理变化过程相关的基因，共10个靶基因，分别为：VEGFA、VEGFC、CDH5、VEZF1、VCAM1、NEGR1、NREP、NYAP2、HAND2、HEG1。GO富集分析结果显示涉及到自主神经系统发育、神经元投射发育的正向调节、细胞对生长因子刺激反应的调控、细胞投射组织的正向调节、细胞对转化生长因子β刺激的反应等生物调节过程；黏连结点、神经元胞体、突触前膜、突触后密度、突触后特化等细胞组成；细胞黏附介质活性、生长因子受体结合、Smad绑定、小分子GTP酶结合、核苷三磷酸酶调节活性等分子功能。KEGG富集通路中排名前20条可视化显示靶基因与PI3K-Akt和MAPK信号通路密切相关，见图6。

qRT-PCR检测候选基因在SCIRI大鼠脊髓组织中的表达，结果见图7，1个（NEGR1）mRNA在SCIRI大鼠脊髓组织中显著上调（P<0.05），8个（VEGFA、VEGFC、CDH5、VCAM1、NREP、NYAP2、HAND2、EG1） mRNA在SCIRI大鼠脊髓组织中显著下调（P<0.05）。

2.6 双荧光素酶报告基因验证lncRNA MIAT和miR‑150‑5p相关关系

与miR-150-5p-NC组相比，miR-150-5p-mimics可显著降低lncRNA MIAT野生型3'UTR荧光素酶活性（P<0.05），而对lncRNA MIAT突变型3'UTR荧光素酶活性无显著影响（P>0.05），表明lncRNA MIAT与miR-150-5p存在靶向调控关系，见图8。

2.7 双荧光素酶报告基因验证miR‑150‑5p和NEGR1相关关系

与miR-150-5p-NC组相比，miR-150-5p-mimics可显著降低NEGR1野生型3'UTR荧光素酶活性（P<0.05），而对NEGR1突变型3'UTR荧光素酶活性无显著影响（P>0.05），表明miR-150-5p与NEGR1存在靶向调控关系，见图9。

3 讨论

SCIRI是指消除引起脊髓缺血的因素后，脊髓的血供恢复，但神经功能并未得到改善，反而因原有的缺血损伤而进一步受损，甚至出现脊髓神经元不可逆的迟发性死亡的现象^［13］。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，细胞质中的lncRNA主要是通过调控目标mRNA的分解、翻译或与miRNA的竞争性结合来影响转录后的基因表达，进而实现竞争性内源RNA网络ceRNA的功能^［14］。例如，包括转移相关肺腺癌转录物1（MALAT1）在内的lncRNA已被证明在SCIRI中具有关键作用。Jin等^［15］发现抑制大脑中动脉闭塞模型和氧-葡萄糖剥夺/复氧模型中LncRNA MALAT1的表达，可以通过调节水通道蛋白4表达从而减轻I/R。在脑I/R中，lncRNA MIAT可以充当miR-142-3p的ceRNA介导SIRT1表达，抑制氧-葡萄糖剥夺/复氧诱导的细胞坏死和凋亡并促进细胞增殖，改善脑I/R和认知功能障碍^［16］。

lncRNA MIAT是一种高度保守的哺乳动物lncRNA，参与神经元发育、核小体形成、微血管功能障碍、心肌梗死等多种生理病理过程^［17］。MIAT在中枢神经系统大脑中表达水平最高，其他的部位表达水平较低或极低^［18］，可以调控多种miRNA，如miR-22-3p^［19］、miR-29a-3p^［20］。此外，MIAT还能调控在SCIRI中表达异常的miR-181b^［21］、miR-200a^［22］、miR-132^［23］、miR-133^［24］、miR-34a^［25］。

MIAT在转录和转录后水平上调节基因。在转录水平上，MIAT通过与核因子相互作用在细胞核中发挥调节作用，而在转录后水平上，它通过ceRNA在细胞质中发挥调节作用。Zhang等^［26］证明MIAT通过miR-150促进非小细胞肺癌的细胞侵袭。此外，MIAT/miR-29a-3p/HDAC4之间的调节被认为参与细胞生物学行为和胃癌的发展^［27］。然而，MIAT及其所介导的ceRNA网络在SCIRI发病机制的相关研究较少。因此，本研究通过建立SCIRI大鼠模型，发现lncRNA MIAT在SCIRI大鼠脊髓组织中表达上调，证实了SCIRI会导致lncRNA MIAT异常表达。基于此，本项目将利用生物信息学分析lncRNA MIAT-miRNA-mRNA网络，深入研究其在急性SCIRI中的表达规律，以期揭示其在SCIRI发病机制中的具体作用。

本研究发现，lncRNA MIAT与miR-150-5p存在结合位点，miR-150-5p与NEGR1存在结合位点。且在SCIRI大鼠脊髓组织中，miR-150-5p表达下调，lncRNA MIAT和NEGR1的表达上调，这证明了miR-150-5p在多种器官I/R过程中起重要作用。Zhou等^［28］研究发现，在单侧肾I/R中，肾小管上皮细胞分泌富含miR-150-5p的外泌体，通过细胞因子信号抑制物SOCS1促进成纤维细胞的激活，加重肾纤维化。Ou等^［29］研究表明，miR-150-5p在心肌I/R大鼠的心脏组织中低表达，注射携带miR-150-5p的外泌体或过表达miR-150-5p的间充质干细胞通过下调硫氧还蛋白互作蛋白TXNIP缓解心肌I/R。NEGR1是一种膜蛋白，能编码神经细胞黏附和生长分子，在神经元发育过程中发挥重要作用^［30］。NEGR1的表达可能受到lncRNA和microRNA的严格调控，从而维持神经元的结构和功能。Yan等^［31］研究表明，lncRNA SNHG12通过miR-181a-5p/NEGR1轴抑制氧糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，提示上调SNHG12和NEGR1表达，抑制miR-181a-5p表达可能是治疗缺血性脑卒中的潜在方式。本研究中双荧光素酶报告基因检验结果证明，lncRNA MIAT与miR-150-5p存在靶向调控关系，miR-150-5p与NEGR1存在靶向调控关系。因此，本课题组推测lncRNA MIAT参与了SCIRI的发生发展，其机制可能与调控miR-150-5p/NEGR1分子轴有关。

综上所述，本研究发现lncRNA MIAT在SCIRI模型大鼠中高表达，其可能通过调控miR-150-5p/NEGR1分子轴参与SCIRI发生、发展。这为揭示MIAT对SCIRI及其药物干预的作用及ceRNA机制，临床防治SCIRI寻找新型靶点与探索合适的针对失调的非编码RNA的天然或合成产物提供了理论基础。

作者贡献度说明：

马梦洁：实验操作、论文撰写；王峥： 数据整理、经费支持；刘建光：统计学分析、文献查询；杨秋香：研究指导、论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

湖北省自然科学基金资助项目(2019CFB762)