高血浆蛋白结合率药物对千金藤素血浆蛋白结合率的影响

Effects of drugs with high plasma protein binding rate on plasma protein binding rate of cepharanthine

摘要

目的 考察高血浆蛋白结合率药物对千金藤素血浆蛋白结合率的影响。 方法 采用分子对接方法观察千金藤素与血浆蛋白之间的结合效应，使用Discovery Studio 2021筛选上市药物分子库中与千金藤素竞争结合药物，建立千金藤素在犬血浆及透析外液中含量测定方法。血浆样品和磷酸盐缓冲溶液样品经液-液萃取法处理后，采用液相色谱串联质谱联用仪进行测定。采用平衡透析法测定利奥西胍、迪拉马尼、孟鲁司特和安倍生坦合用时千金藤素的血浆蛋白结合率。 结果 通过分子对接，从上市药物分子库中筛选与千金藤素具有相同结合位点的高血浆蛋白结合候选药物，这些药物可能与千金藤素竞争结合血浆蛋白。选择利奥西胍、迪拉马尼、孟鲁司特和安倍生坦4种药物进行体外竞争结合试验。结果表明，千金藤素与犬血浆的蛋白结合率很高，达到（99.47±0.13）%。在测试浓度下，合并利奥西胍、孟鲁司特和安倍生坦对千金藤素的血浆蛋白结合率没有显著影响。合并低浓度（200 ng/mL）的迪拉马尼对千金藤素的血浆蛋白结合率也没有显著影响，而合并高浓度（500 ng/mL）的迪拉马尼则显著增加血浆中游离千金藤素的浓度。 结论 利奥西胍、孟鲁司特、安倍生坦和低浓度迪拉马尼与千金藤素不存在明显的竞争关系，而高浓度迪拉马尼能够使千金藤素的血浆蛋白结合率降低。

Abstract

Objective To investigate the impact of drugs with high plasma protein binding rate on the plasma protein binding rate of cepharanthine. Methods The molecular docking method was employed to investigate the binding interactions between cepharanthine and plasma proteins. Discovery Studio 2021 was utilized to screen for drugs that compete with cepharanthine within a molecular drug library. A method was established for the determination of cepharanthine in dog plasma and dialysis fluid. Plasma samples and phosphate buffer solution samples underwent liquid‑liquid extraction and were analyzed using liquid chromatography‑tandem mass spectrometry. The effects of riociguat， delamanid， montelukast， and racambrisentan on the plasma protein binding rate of cepharanthine were assessed through equilibrium dialysis. Results Through molecular docking， candidate drugs with high plasma protein binding that have the same binding site as cepharanthine were screened from the marketed drug molecule library. These drugs may compete with cepharanthine for binding to plasma proteins. A total of 4 drugs， riociguat， delamanid， montelukast， and racambrisentan， were selected for in vitro competitive binding experiments. The results showed that the protein binding rate of cepharanthine to dog plasma was very high， reaching （99.47±0.13）%. Combining riociguat， montelukast， and racambrisentan had no significant effect on the plasma protein binding of cepharanthine at the concentrations tested. Combining low‑concentration delamanid （200 ng/mL） also had no significant effect on the plasma protein binding rate of cepharanthine， while combining high-concentration delamanid （500 ng/mL） significantly increased the concentration of free cepharanthine in plasma. Conclusion Riociguat， montelukast， and ambrisentan do not have any obvious competitive relationship with cepharanthine， but delamanid can reduce the plasma protein binding rate of cepharanthine.

Graphical abstract

关键词

血浆蛋白结合率 / 竞争性 / 药物相互作用 / 千金藤素 / 联合用药 / 药物代谢动力学

Key words

Plasma protein binding rate / Competitive / Drug interaction / Cepharanthine / Combined medication / Pharmacokinetics

自2019年年末以来，新型冠状病毒肺炎（COVID‑19）疫情已在全球蔓延，给多国医疗系统带来沉重压力，并造成严重的经济和生命损失。截至2024年1月9日，世界卫生组织统计数据显示，全球累计确诊病例超过1.7亿，死亡病例逾698万，对全球公共卫生构成严重威胁^［1，2］。鉴于严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS‑CoV‑2）持续变异的特性，可能出现更具致病性的新变种。因此，为了有效控制COVID‑19的全球传播，迫切需要深入研究并开发针对新型冠状病毒的治疗药物，以期获得更佳的临床效果。

千金藤素已有超过70年治疗急性和慢性疾病的历史。近年来，研究揭示了千金藤素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗寄生虫、抗病毒和免疫调节等多重生物活性^［3-5］。最新研究表明，千金藤素在1 900种临床药物中展现出最强的体外抑制SARS‑CoV‑2的能力，能有效抑制病毒并减轻感染引起的肺部炎症，显示出良好的抗新型冠状病毒潜力^［6，7］。目前，千金藤素已完成Ⅱ期临床试验，显示出良好的疗效和安全性^［8］。

千金藤素的高血浆蛋白结合率约为99.5%，导致其游离药物浓度不足，限制了其临床药效^［9-11］。本研究旨在通过分子对接筛选竞争药物，并进行体外平衡透析实验，以探讨高血浆蛋白结合率药物对千金藤素结合率的影响。研究目标是利用药物间的竞争结合特性，降低千金藤素的血浆蛋白结合率，提高其游离浓度，为增强其体内药效提供基础。

1 资料与方法

1.1 主要仪器

Waters Acquity H型高效液相色谱‑Xevo TQ‑XS串联质谱联用仪（美国Waters公司）、色谱柱：Inertsil ODS‑3 2.1 mm×100 mm，3 μm（日本GL Sciences公司）、Single‑Use RED Plate with Inserts快速平衡透析装置（美国赛默飞世尔科技公司）、电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、Vortex geniu‑2涡旋仪（美国Scientific Industries公司）、101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）、RVC‑223离心浓缩仪（德国Christ公司）。

1.2 试剂

利奥西胍（纯度：98%，批号：CTW368）、迪拉马尼（纯度：99.88%，批号：DMX791）、孟鲁司特（纯度：99%，批号：BSU253）、安倍生坦（纯度：98%，批号：DLZ238）购自上海毕得医药科技股份有限公司，盐酸维拉帕米（标准品批号：100223‑200102）、克林霉素（标准品批号：130422‑201807）购自中国食品药品检定研究院，千金藤素（纯度：98%，批号：E12202）购自萨恩化学技术（上海）有限公司，甲基叔丁基醚（纯度：99%，批号：20200808）购自现代东方（北京）科技发展有限公司，二甲亚砜（分析纯批号：20221201）购自国药集团化学试剂公司，磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2，批号：2522711）购自美国赛默飞世尔科技公司，纯净水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司，甲醇为色谱级。

1.3 分子对接研究

血浆蛋白与千金藤素的结合位点采用Discovery Studio 2021软件进行分子对接，研究千金藤素与血浆蛋白之间的相互作用。从Uniprot数据库和PDB蛋白质数据库中检索白蛋白结构（ID：7vr0）和α1‑酸性糖蛋白结构（ID：3kq0和7oub）。利用Discovery Studio 2021软件分析血浆蛋白中千金藤素的结合位点。

1.4 竞争结合药物筛选研究

使用Discovery Studio 2021软件对L1010数据库和血浆蛋白进行分子对接，筛选与千金藤素竞争结合药物。

1.5 对照品溶液和内标的配制

千金藤素标准溶液配制：精密称取千金藤素适量，用甲醇溶解并定量稀释成100 μg/mL的储备液。精密量取千金藤素储备液适量，用纯甲醇稀释成质量浓度分别为2.5、5、10、50、200、1 000、2 000 ng/mL的系列标准对照品溶液。内标液配制：精密称量盐酸维拉帕米适量，加入纯甲醇溶解并稀释至10 ng/mL的溶液，作为内标液。

1.6 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS‑3 2.1 mm×100 mm，3 μm（GL Sciences，日本）；柱温：35 ℃；流速：0.30 mL/min，进样体积：5 μL；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）、甲醇（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱（0 min 80% A→2.5 min 10% A→3.5 min 10% A→3.51 min 80% A→7.5 min 80% A）。

1.7 质谱条件

采用电喷雾电离源；正离子模式扫描；毛细管电离电压：1 230 V；干燥气体：N₂；干燥气体流速：900 L/h，干燥气体温度：500 ℃；碰撞气体：氩气；扫描方式为多反应离子监测，质谱数据采集及处理软件为Masslynx质谱工作站。千金藤素及内标用于定量分析的监测离子见表1。

1.8 样品处理方法

分别量取血浆样品或PBS样品各100 μL，置1.5 mL洁净EP管中，加入10 μL盐酸维拉帕米内标溶液（10 ng/mL），混合均匀。加入900 μL甲基叔丁基醚，涡旋混合3 min，14 000 r/min离心5 min。转移上层有机相至洁净EP管中，于离心浓缩仪上40 ℃挥干有机溶剂。残渣加入100 μL甲醇/水80/20（v/v）的溶媒复溶，涡旋混合1 min，14 000 r/min离心5 min，取上清进样分析。

1.9 线性范围考察

分别量取100 μL空白PBS溶液与空白犬血浆至EP管中，分别加入2.5、5、10、50、200、1 000、2 000 ng/mL的千金藤素系列标准溶液10 μL，混合均匀，即得浓度分别为0.25、0.5、1、5、20、100、200 ng/mL的模拟PBS溶液或模拟血浆，按照“1.8”项下的方法对PBS样品和血浆样品进行处理后，记录各个浓度样品的峰面积比值。

1.10 血浆蛋白结合率测定

根据竞争药物血药浓度确定试验药物浓度^［12-15］。利奥西胍的试验浓度为：100、200 ng/mL，迪拉马尼的试验浓度为：200、500 ng/mL，孟鲁司特的试验浓度为：500、1 000 ng/mL，安倍生坦的试验浓度为：200、500 ng/mL。在一次性平衡透析板的红色和白色孔中分别加入蛋白结合率检测样本或待测血浆样本300 μL、PBS 550 μL，用密封带覆盖装置，置于37 ℃烘箱中孵育6 h，从血浆室和缓冲室中取出样品，并使用质谱分析，通过下方公式计算样本浓度和蛋白结合率：

血浆蛋白结合率(%)=(血浆中样品浓度-PBS中样品浓度)/血浆中样品浓度×100

游离药物分数率(%)=100%-血浆蛋白结合率(%)

1.11 统计学处理

实验数据采用GraphPad Prism 9.5统计软件进行分析，结果用（\overline{x}\pm s）表示，不同组别与对照组比较用one‑way ANOVA方法对数据进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 千金藤素对血浆蛋白结构的影响

通过Discovery Studio 2021获得千金藤素与3种蛋白质的结合位置和相互作用，并计算了每次相互作用的结合能。使用半柔性对接过程中，千金藤素成功占据了2个α1‑酸性糖蛋白的疏水口袋，但与白蛋白的半柔性对接没有成功，而全柔性对接则成功实现，说明千金藤素与α1‑酸性糖蛋白亲和力强于白蛋白。α1‑酸性糖蛋白1和2的对接得分为-26.7和-103.0 kcal/mol，结合能越低则稳定性越高，说明千金藤素与α1‑酸性糖蛋白2亲和力强于α1‑酸性糖蛋白1。千金藤素与血浆蛋白可视化结果见图1、2。

2.2 竞争药物分子筛选研究

在确定千金藤素与α1‑酸性糖蛋白结合位点的基础上，将FDA已批准上市的小分子药物数据库L1010数据库导入Discovery Studio 2021，筛选可能与千金藤素竞争结合相同血浆蛋白位点的竞争药物分子。结合考虑其自身的血浆蛋白结合率、结构特征及临床适应症，确定迪拉马尼、利奥西胍、孟鲁司特、安倍生坦4个高血浆蛋白结合率作为候选竞争药物分子。

2.3 专属性及基质效应

磷酸盐缓冲溶液和血浆的前处理选择了液‑液萃取法。在磷酸盐缓冲溶液和血浆中，内源性物质不会干扰各个成分的测定。在空白生物基质中，内标盐酸维拉帕米（保留时间4.03 min）和药物千金藤素（保留时间3.82 min）均未显示出干扰。上述处理方法表明，生物基质对药物和内标的信号基本未产生抑制或增强作用，基质影响因子为（95.33±4.30）%。

2.4 线性关系

按“1.8”项下方法操作，记录各检测成分及内标的峰面积。以千金藤素的质量浓度（X）为横坐标，以待测物峰面积与内标峰面积之比（Y）为纵坐标，分别拟合千金藤素回归方程。千金藤素定量分析的回归方程结果见表2。结果显示，千金藤素在不同介质的质量浓度范围内线性良好，线性范围为0.25~200 ng/mL。

2.5 各组血浆蛋白结合率

千金藤素与犬血浆蛋白的结合率高达（99.47±0.13）%，表明体内绝大部分千金藤素与血浆蛋白结合，千金藤素游离药物浓度极低。合并不同浓度的利奥西胍、孟鲁司特和安倍生坦后，千金藤素的血浆蛋白结合率没有明显变化。合并低浓度（200 ng/mL）的迪拉马尼对千金藤素的血浆蛋白结合率也没有显著影响，而合并高浓度（500 ng/mL）的迪拉马尼则显著增加血浆中游离千金藤素的浓度（P<0.05）。

上述结果表明，某些高血浆蛋白结合率药物（如迪拉马尼）可能与千金藤素具有相同的血浆蛋白结合位点，可通过竞争结合的方式置换与血浆蛋白结合的千金藤素，从而增加千金藤素游离药物浓度。但本研究中，即使合并高浓度的迪拉马尼对千金藤素游离药物浓度的提升效果仍有限。利奥西胍、迪拉马尼、孟鲁司特、安倍生坦和千金藤素血浆蛋白结合率见表3、图3。

3 讨论

COVID‑19是一种由SARS‑CoV‑2引起的传染病，其主要特征是肺部炎症和肺组织的损伤。目前，全球范围内仍在寻求治疗效果好、毒副作用低的抗新冠肺炎药物。从传统中草药中寻找更为安全有效的抗新冠肺炎药物越来越受到科学家的青睐。千金藤素是从千金藤属植物中提取的一种生物碱，它拥有众多的药理活性，如抗炎、抗氧化、免疫调节、对抗肿瘤和对抗病毒等，尤其在治疗新冠肺炎方面，千金藤素显示出巨大的潜力。目前的研究主要集中在千金藤素的体内外抗病毒效果，但尚未充分考虑其99.5%的高血浆蛋白结合率，这可能导致游离药物浓度不足以实现有效治疗。

药物与血浆蛋白的结合变化会影响血液中游离药物浓度，进而影响药物的体内分布、代谢、排泄和靶点结合，最终影响药理效应^{［16，17］}。药理效应主要取决于游离药物，因为血浆蛋白结合后不具药理活性，而游离药物浓度与其生物活性直接相关^{［18，19］}。血浆中重要的结合蛋白是白蛋白、α1‑酸性糖蛋白、脂蛋白和其他蛋白。白蛋白约占血浆总蛋白60%，主要与酸性药物结合，α1‑酸性糖蛋白占3%，能够与中性和碱性药物结合^{［20，21］}。药物与血浆蛋白结合具有差异性、暂时失活、可逆性、饱和性、竞争性等特点。高血浆蛋白结合率可能导致游离药物浓度过低，会导致游离药物浓度达不到有效治疗浓度，限制了这些药物的临床应用^［9-11］。例如，伊维菌素的血浆结合率为93%，导致只有少量游离药物被靶细胞摄取^［22］。游离伊维菌素的血浆浓度远低于体外抑制新型冠状病毒复制所需的浓度^［23］。即使单剂量伊维菌素120 mg（比美国食品药品监督管理局批准的剂量高10倍）的C_max值为250 ng/mL，也低于体外有效浓度（IC₅₀：2.5 μmol/L）。血浆蛋白结合率约为99.5%的千金藤素与伊维菌素存在相似问题：游离药物浓度太低，靶器官中药物浓度达不到有效浓度。增加体内肺部有效浓度需要提高剂量，但这会增加毒性，如大剂量伊维菌素可能引发共济失调或癫痫发作等严重副反应^［24］。为提高体内肺部有效药物浓度，可采取以下措施：（1）改进肺部给药途径，使药物在呼吸道和肺部沉降，但需考虑药代动力学参数限制，如高细胞毒性和低溶解性^［25］；（2）联合用药，降低血浆结合率，提高血药浓度。例如，长期服用华法林的患者，在用氯唑西林进行抗炎治疗后抗凝效果可能急剧增加，这可能是因为氯唑西林的高血浆蛋白结合率与华法林竞争血浆蛋白结合位点，使游离华法林浓度增高，增强其抗凝作用^［26］。

作为生物碱，千金藤素优先与α1‑酸性糖蛋白结合，这与分子对接的结果一致。迪拉马尼能与千金藤素发生置换反应，可能是因为它们具有相同的结合位点^［19］。其他药物未能与千金藤素发生置换，可能是因为它们与不同血浆蛋白的亲和力及结合口袋位置不同，无法产生竞争性置换。高浓度迪拉马尼可引发置换反应，而低浓度则不能，这可能是因为药物浓度不足以引起置换反应。

依据上述结果，发现以迪拉马尼为代表的高血浆蛋白结合率药物与千金藤素合用，可通过竞争结合的方式置换与血浆蛋白结合的千金藤素，从而增加千金藤素游离药物浓度。通过此途径提高千金藤素游离药物浓度，提高其疗效是否可行仍需进一步的筛选和实验证实。

作者贡献度说明：

苑硕：论文撰写，实验操作，数据整理与分析；冯君豪：数据整理，辅助实验操作；董静：辅助实验操作；龚伟：实验设计，提供经费支持；高春生：实验设计，提供经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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