应用网络药理学和实验验证方法探讨原儿茶酸抗抑郁症的作用机制

The study on the mechanism of protocatechuic acid against depression by network pharmacology and experimental verification

摘要

目的 研究原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）抗抑郁症的作用，运用网络药理学和实验验证等方法探究其治疗抑郁症的潜在作用。 方法 本研究通过使用SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库获得PCA的靶点基因；利用GeneCards、OMIM和DisGenet数据库获取与抑郁症相关的疾病靶点基因。运用R-studio对共有靶点进行基因本体（GO）和信号通路（KEGG）富集分析，应用STRING 12.0在线数据库构建共有靶点蛋白互作网络。运用分子对接观察PCA（配体）与核心靶点（受体）的结合能力。利用动物实验来检测其行为学变化，评价PCA改善抑郁症的功效。 结果 网络药理学分析结果显示，ALB、AKT1、HSP90AA1、MMP9、MAPK8等因子作为PCA改善抑郁症的核心靶点，KEGG主要富集在与代谢性疾病、脂质与动脉粥样硬化相关的信号通路上。分子对接结果也显示PCA与抑郁症的核心靶点有较高的结合能力。动物实验显示PCA可以有效改善动物的行为学来治疗抑郁症。 结论 PCA可能通过调节ALB、AKT1、HSP90AA1、MMP9、MAPK8等因子和与代谢性疾病、脂质与动脉粥样硬化信号通路来改善抑郁症，对抑郁症具有明显效果。

Abstract

Objective To study the anti-depression effect of protocatechuic acid （PCA） and explore its potential role in the treatment of depression by network pharmacology and experimental verification. Methods PCA target gene were obtained by using SwissTargetPrediction and PharmMapper database. Disease target genes associated with depression were obtained from GeneCards， OMIM， and DisGenet databases. R-studio was used to enrich gene ontology （GO） and signaling pathway （KEGG） for common targets， and STRING 12.0 online database was used to construct common target protein interaction network. Molecular docking was used to observe the binding ability of PCA （ligand） to the core target （receptor）. Animal experiments were used to detect behavioral changes and evaluate the efficacy of PCA in improving depression. Results The results of network pharmacological analysis showed that ALB， AKT1， HSP90AA1， MMP9， MAPK8， and other factors were the core targets of PCA to improve depression， and KEGG was mainly concentrated in the signaling pathways related to metabolic diseases， lipids， and atherosclerosis. Molecular docking results also showed that PCA has a high binding ability to the core targets of depression. Animal experiments have shown that PCA can effectively improve the behavior of animals to treat depression. Conclusion PCA may ameliorate depression by regulating ALB， AKT1， HSP90AA1， MMP9， MAPK8， and metabolic disease， lipid， and atherosclerotic signaling pathways， and has obvious effect on depression.

Graphical abstract

关键词

原儿茶酸 / 抑郁症 / 网络药理学

Key words

Protocatechuic acid / Depression / Network pharmacology

抑郁症是目前严重的精神疾病之一，其主要的4个广泛的症状维度包括负面认知、功能障碍、失眠和其他不典型的症状，由于社会压力和其他多种因素的增加，抑郁症患者的患病率在逐年升高，从而导致自杀率、致残率等恶性事件发生也在逐年升高^［1，2］。抑郁症导致的自杀、致残等事件对社会产生了许多重大的影响，临床上对其研究也在不断的深入，但因其病因病机过于复杂，故目前仍没有明确的病因病机及治疗原则。其中导致抑郁症的原因是多个因素相互重叠的结果，包括遗传和表观遗传因素、环境条件、压力因素、营养物质缺乏以及各种儿童时期的过度压力和虐待等^［3］。实验研究中也发现抑郁症的主要病因病机与小胶质细胞调节的神经炎症、突触可塑性和神经网络形成相关，且可能与单胺缺乏（中枢神经系统中的血清素、去甲肾上腺素、多巴胺水平降低）、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、神经兴奋性、神经传递、线粒体功能障碍、阿片系统、髓鞘化、脑-肠轴调节等有关，同时海马神经可塑性降低与抑郁症互相影响^［4-6］。抑郁症的病理生理学研究发现其与遗传易感性、大脑结构和功能改变、神经元可塑性降低、额叶皮层和海马体体积减少、大脑中单胺合成减少均有密切关系^［7，8］。同时，HPA轴功能障碍、炎症、氧化应激增强和神经递质异常等因素的相互作用，对大脑中海马体和内侧额叶皮层产生影响，进一步促进了抑郁症的进展^［8］。其中，氧化应激在正常脑功能和神经系统疾病的发病机制中发挥着关键的作用，并且与线粒体功能障碍、神经毒性、炎症等机制密切相关^［9］。实验研究发现，在抑郁的动物模型中，氧化应激会调节HPA轴的反馈，HPA轴的过度激活导致活性氧的增加，然而抗抑郁药物治疗抑郁症会抑制HPA轴，其可能是通过减轻机体氧化应激来起到对抗抑郁症的作用^［10］。故通过哪些药物抗氧化应激来预防和治疗抑郁症将成为一个重要的研究方向。

原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）是益智仁的活性成分之一，其具有高渗透性，是一种水溶性的多酚类化合物^［11］。关于PCA的研究报告显示，其可以激活Nrf-2信号通路来减少活性氧产生，并提高抗氧化参数水平，同时降低炎症介质水平，显著防止H₂O₂诱导的的细胞凋亡，并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，并增强老年大鼠的认知能力，降低脂质过氧化物水平，增加谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，进而起到抗氧化应激的作用^［12］。多年的研究显示，中药益智仁具有抗抑郁的作用，而其中的PCA在大鼠模型中也明确具有减轻抑郁行为和调节神经递质的作用^{［13，14］}。目前关于抑郁症的治疗多是心理治疗结合抗抑郁药物治疗，临床效果欠佳，故结合中医中药治疗将可能增强其临床疗效性^［15］。然而PCA为中药提取物，其有效性仍需要进一步验证与研究，故本文通过网络药理学及体内实验的方式进行进一步的探究，以期为临床用药及新药开发提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 网络药理学研究

1.1.1 PCA靶点及疾病靶点获取

通过SwissTargetPrediction（http：//swisstargetprediction.ch/）和PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）数据库对PCA的靶点基因进行筛选，限定研究对象为人类“homo sapiens”，probability≥0为界值，去除其他无关混杂基因，得到PCA发挥作用的主要基因靶点。以关键词“depression”分别在GeneCards（https：//www.Genecards.org/）、DisGenet（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/search）和OMIM（https：//omim.org）数据库中进行搜索，选取relevance score≥10的基因靶点（Relevance score值越大，基因与疾病的相关性越大），并将3个数据库获得的疾病基因靶点去除重复项得到全部基因。

1.1.2 成分‑靶点‑疾病网络构建及分析

借助JVenn网站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）将得到的PCA的靶点基因与疾病靶点基因取交集。以PCA、作用靶点基因、疾病为节点，通过Cytoscape 3.9.1软件构建“成分-靶点-疾病”网络图。其中节点代表PCA（有效活性成分）、疾病、作用靶点，连线代表两节点之间存在关联性，以此建立网络，以期更加系统的对PCA治疗抑郁症的潜在靶点进行预测分析。

1.1.3 蛋白互作PPI网络构建

将PCA的靶点基因与抑郁症相关基因的交集基因数据导入STRING 12.0数据库（https：//string-db.org/）中，用来构建（protein-protein interaction，PPI）网络，前提选择多种蛋白“Multiple protein”，物种选择人类“homo sapiens”，用PPI网络图来可视化蛋白间的相互作用，置信度选项中选取0.7（高置信度），将游离蛋白以及无相互联系的蛋白网络隐藏，将PPI网络图导出，再进行靶点蛋白间相互作用分析。将PPI网络中下载的数据导入到Cytoscape 3.9.1软件进行相关性分析，应用Cytoscape 3.9.1软件中Centiscape 2.2插件对核心靶点进行筛选，得到核心靶点。

1.1.4 GO功能富集及KEGG通路富集

为了更明确地表现出各交集靶点基因的生物学功能以及在各信号通路中的影响，需要进一步对靶点蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析的可视化处理。登陆David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）再将交集靶基因分别导入David数据库，选择物种为人类“homo sapiens”，选择list设置为“gene list”，进行生物过程（Biological Process， BP）、细胞组成（Cellular Component， CC）、分子功能（Molecular Function， MF）3方面的富集，提取出相应的数据。运用Rstudio 2023.6.2.0软件结合packages（“ggplot2”）packages（“ggpubr”）R包再结合相应的代码对数据进行可视化分析，按照基因比例分别对BP、CC、MF进行排序，最终得到相应的柱状图，分析PCA对治疗抑郁症潜在的生物过程、细胞组成及分子功能。

运用Rstudio2023.6.2.0软件结合packages（“ggplot2”）packages（“ggpubr”）R包再结合相应的代码对共同靶点基因进行KEGG可视化，得到相应的气泡图及柱形图，分析PCA治疗抑郁症潜在的信号通路。将富集后的信号通路的原始数据导入Pathview网页（https：//pathview.uncc.edu/）中进行数据的整合，并对KEGG通路图进行渲染，得到个性化的KEGG路径图，使得药物作用于疾病的信号通路图展示的信息更加的丰富，有助于对整体的网络进行深入研究。

1.2 分子对接

为进一步阐明PCA治疗抑郁症的作用机制，将PCA与PPI网络中筛选出的核心靶点蛋白进行分子对接。利用UniProt数据库搜索得到蛋白的完整信息，再选取分辨率小于2.0，长度大于400，物种选择“homo sapiens”得到蛋白结构的PDB DOI。从RCSB PDB数据库（http：//www'rcsb.org/）中获取核心蛋白的晶体结构，同时下载靶点蛋白的3D结构的PDB格式文件，利用PyMol删除水分子和小分子配体，得到干净的蛋白。利用AutoDock Tools 1.5.6软件进行去水加氢处理后转化成pdbqt格式文件。利用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索得到PCA的3D结构图的SDF格式，导入OpenBabel中得到mol2格式文件，再将mol2格式文件导入AutoDock Tools 1.5.6软件中，将配体平衡电荷、加氢处理得到pdbqt格式文件，设置配体受体结合的Grid Box参数，为与核心靶点蛋白（受体）进行分子对接做准备。最后应用AutoDockVina1.5.6对配体和受体进行模拟分子对接，利用PyMol软件将结果进行可视化处理。

1.3 实验仪器和实验耗材

1.3.1 实验仪器

洁净工作台（苏州净化设备有限公司SW-CJ-2F）；电热鼓风恒温干燥箱（上海力辰邦西仪器科技有限公司101-1s）；恒温水浴锅（金坛区西城新瑞仪器厂XR 52455）；倒置显微镜（深圳市奥斯微光学仪器有限公司BX53）；分析电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司AE100S）；BIOTEK SYNERGYHTX酶标仪（美国伯腾仪器有限公司SynergyHTX）；多管漩涡混合器（泰州诺米医疗科技有限公司NMSG-12）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司ABLX5）。超声波提取器（武汉嘉鹏电子有限公司 JP300G）；小鼠行为学实验摄像头（成都泰盟软件有限公司TM-Vision）；旷场箱（50 cm×50 cm×40 cm，不透明塑料板组成）；小鼠高架十字迷宫（成都泰盟软件有限公司PMT-100）；大小鼠开场活动实验系统（成都泰盟软件有限公司OFT-100）。

1.3.2 实验耗材

PCA（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；葡萄糖（西陇化工有限公司）；一次性无菌注射器（江苏治宇医疗器材有限公司）；注射器过滤器（0.22 µm兰杰柯科技有限公司）；离心管15 mL/50 mL、25T培养瓶、6孔板、96孔板（康宁）；蔗糖（天津市大茂化学试剂厂）；3 000 mL烧杯（宝美施化工上海有限公司）。

1.4 体内实验方法

1.4.1 实验动物

实验所用小鼠为雄性健康成年昆明种SCXK（京2007-0001），6~8周龄，体重为18~22 g，购买于北京华通利维。小鼠的饲养与实验均严格按照《医学实验动物管理实施细则》相关规定进行，以确保实验的安全性。动物房与行为室温度保持在（23±2）℃，相对湿度40%~60%，昼夜节律按12 h∶12 h进行，提供充足的食物与饮水供其自由采食和饮水。实验动物的手术与处理严格按照空军军医大学实验动物福利与伦理委员会规定及国际疼痛研究协会的规定进行，实验过程中尽量减轻动物的痛苦。本研究涉及的动物实验所有操作均获得海南医科大学伦理委员会审核批准，审批编号：HYLL-2024-141。

1.4.2 实验动物分组及慢性束缚抑郁模型建造

所有实验小鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法，将小鼠分为6组，每组6只。对照组、模型组（慢性束缚应激组，灌胃给予羧甲基纤维素钠CMC-Na）；阳性组（盐酸舍曲林组，灌胃给予盐酸取舍林片12 mg/kg）；低剂量组（灌胃给予PCA 150 mg/kg）；高剂量组（灌胃给予PCA 300 mg/kg）。除对照组小鼠外，均在每天10：00将所有小鼠置于打好小孔的50 mL离心管中，拧紧后盖，确保小鼠无法逃离。每日束缚4 h后将其放回原鼠笼内，恢复正常饮水与进食，持续21 d。

1.4.3 蔗糖偏好试验

将小鼠进行单笼饲养，自由进食。在实验的第1天，每个笼子放2瓶饮用水。第2天，将其中1瓶水换成1%的蔗糖水。第3天互换2瓶位置，让小鼠适应蔗糖水的味道。第4天小鼠禁食禁水。第5天将称取好的1瓶糖水和1瓶饮用水放置每笼。第6天再称取剩余水的量，2次差值即为饮用水与蔗糖水的量，最后根据计算公式［蔗糖水/（饮用水+蔗糖水）×100%］来得出蔗糖水的偏好程度。

1.4.4 旷场试验

在抑郁症的造模研究中，旷场实验是作为评价其造模是否成功的关键实验。实验前1 h将小鼠放入行为室适应，提前调节好旷场录制光照强度、录像设备，清洁旷场底部。旷场装置为50 cm×50 cm×40 cm无盖箱体，其中箱内壁及底面为灰色。实验开始时将小鼠轻轻放入箱内底面中央区，拉好四周围帘，同时进行视频采集，观察5 min内小鼠的活动情况，保持录制期间处于安静环境。在2次测试之间，用75%酒精彻底清洁箱体内壁和底部，目的是清理上1只小鼠残排泄物和留气味，待酒精完全挥发后，测试下1只小鼠。旷场测试完毕后，使用SMART 3.0和GraphPad Prism Version 8.3.0软件进行视频分析，主要测量参数为小鼠在旷场中央区活动的距离和时间及活动总距离和时间。

1.4.5 高架十字迷宫实验

实验前1 h将小鼠放入行为室适应，提前调节好高架录制光照强度、录像设备，清洁高架十字臂。高架装置是由1个中央区（10 cm×10 cm）和2个相互垂直的开臂（50 cm×10 cm）和2个闭臂（50 cm×10 cm×35 cm）组成的迷宫，距离地面高60 cm。实验开始时将小鼠轻轻放置在中央区，确保小鼠头部朝向开臂，拉好四周围帘，同时进行视频采集，观察5 min内小鼠的活动情况，保持测试一直处于安静环境。在2次测试之间，用酒精彻底清洁高架十字臂内部，去除上只小鼠残留排泄物和气味，待酒精完全挥发后，再测试下1只小鼠。高架测试完毕后，使用SMART 3.0和GraphPad Prism Version 8.3.0软件进行视频分析，主要测量参数为小鼠在开臂活动的距离和时间及活动的总距离和时间。

1.4.6 强迫游泳试验

将小鼠放进装有水的3 000 mL烧杯中（烧杯高 25 cm，直径14 cm，水深15 cm），水温控制在24~26 ℃，防止动物用尾巴触底，用摄像机记录行为。每次实验进行6 min，小鼠适应时间为2 min，观察记录小鼠后 4 min的游泳情况。主要测量参数为小鼠在保持静止不动的时间（小鼠静止不动的标志是只做基本的保持头部不下沉的运动）。

1.5 统计学处理

所有数据使用平均数±标准差（\overline{x}\pm s）的形式进行展示，每组实验至少进行3次独立重复。使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。两组间差异分析使用t检验，3组及3组以上之间的差异分析使用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 PCA靶点及疾病靶点预测

通过SwissTargetPrediction数据库和PharmMapper数据库得到PCA对应的靶点基因有255个。通过DisGenet等3个数据库分别以“depression”为关键词搜索得到靶点基因为2 131个（Relevance score≥10）。通过Venn图分析，将疾病靶点与PCA对应的基因靶标进行取交集，得到PCA治疗抑郁症的共同靶点为89个，见图1A。目前研究表明，抑郁症的发病机制主要与氧化应激、海马神经可塑性失调、神经小胶质细胞、炎症、单胺缺乏等相关，与抑郁症相关的3个主要的致病基因包括儿茶酚氧位甲基转移酶（catechol-O-methyltransferase，COMT）、核受体亚家族3 C群成员1（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase，CBS）及许多相关性的变异体^［4，5］。其中，COMT是位于22号染色体上的基因，这些与抑郁症相关的靶点基因可以直接影响与抑郁症相关的激素神经递质，进而导致抑郁症的发生与发展^［3］。同时，抑郁症水平的高低与紧张的生活存在密切关系，而COMT基因的等位基因的纯合性与二者相关，故COMT的纯合性和严重的生活压力对抑郁症的严重程度起到重要的影响^［16］。NR3C1是位于5号染色体上的基因，与单胺缺乏相关，故与抑郁症的关系密切，同时经过临床研究发现，NR3C1 DNA甲基化水平升高与抑郁症患者发病率升高具有强相关性，并且NR3C1 DNA甲基化调节HPA轴在抑郁症发病和治疗中起到重要的作用^［17］。目前经Venn图分析显示PCA对应的靶点与抑郁症发生发展密切相关的基因有89个，需要通过进一步研究寻找这些基因与抑郁症发病之间的关系，为临床治疗抑郁症提供新的治疗思路与方法。

2.1.2 活性成分‑靶点‑疾病网络

为得到“活性成分-靶点-疾病”网络图，使用Cytoscape 3.9.1软件进行分析及绘图。在“活性成分-靶点-疾病”网络中对网络进行分析，网络由1个主要活性成分PCA，89个药物-疾病交集靶点，1个疾病组成，可以清晰直观地展现出PCA拥有多个靶点治疗抑郁症的作用网络，见图1B。该图充分说明PCA通过多靶点作用于疾病，此复杂的网络足以证明PCA治疗抑郁症的潜在作用。

2.1.3 PPI网络分析

经Venn图获得PCA治疗抑郁症的共同靶点为89个，将这些靶点分别导入string数据库，得到PPI网络，见图1C，图中节点代表蛋白，节点颜色越深说明度值（degree）越大；连线代表蛋白之间的关系，连线越多表明与疾病的相关性越强。通过数据库原始数据分析得到PCA治疗抑郁症靶点的PPI网络中有154个节点。按照界值大小对基因（前10）进行排序，见表1。再应用Cytoscape 3.9.1中Centiscape 2.2插件对核心靶点进行筛选得到核心节点20个，见图1D。其中关键蛋白AKT1、HSP90AA1、STAT1、ALB、MMP9是排名前5的靶点。其中，AKT家族的3个异构体（AKT1、AKT2、AKT3）是精神分裂症和双向情感障碍的顶级候选基因，它们具有共同的激活机制，而双向情感障碍包括了抑郁症和躁狂两个方面的表现^［18］。同时，氧化应激在双向情感障碍发生发展的病理生理中起到了重要的作用，然而非酶性抗氧化剂是内源性抗氧化剂的子集，是血浆和脑脊液产物中的化合物，包括ALB、尿酸、胆红素等，这些物质可以消除自由基来抗氧化应激，故ALB可能与双向情感障碍具有密切的关联^［19］。HSP90AA1蛋白是HSP90家族的重要成员，在慢性压力作用下的抑郁症动物模型中会出现过度表达，同时它会进一步影响下游蛋白的折叠、组装和重构^［20］。这些靶点可能是PCA治疗抑郁症的关键靶点，也可能为PCA治疗抑郁症提供新的治疗思路。

2.1.4 GO功能富集分析

为了深入探究PCA治疗抑郁症在网络药理学中的应用，将PCA治疗抑郁症的89个共同靶点通过Rstudio 2023.6.2.0进行GO功能富集分析，并绘制成气泡图。其中气泡越大代表富集到的基因越多，气泡颜色越深代表P值越小，可信度越高。结果表明，PCA治疗抑郁症的靶点主要富集在信号转导、磷酸化（、凋亡过程负向调控等生物学过程，见图2A。PCA治疗抑郁症的靶点主要富集在细胞质、细胞质溶胶、质膜等细胞组成中，见图2B。PCA治疗抑郁症的靶点主要富集在蛋白结合等分子功能中，见图2C。三者结合见图2D。

2.1.5 KEGG富集分析

为了探究PCA治疗抑郁症作用于哪些信号通路，将PCA治疗抑郁症的共同靶点89个通过Rstudio 2023.6.2.0进行KEGG通路富集分析。将KEGG分析结果绘制称气泡图及柱状图（P<0.05），见图3A、B。结果显示，PCA治疗抑郁症的靶点主要富集在与代谢性疾病、脂质与动脉粥样硬化及HIF-1等相关的信号通路上，见图3C。经分析和查阅相关文献发现，二十碳五烯酸（EPA）与二十二碳六烯酸（DHA）补充剂都与代谢、脂质、动脉粥样硬化等相关，且二者都可有效改善应激诱导的大鼠抑郁症行为，这可能与抑制星形胶质细胞激活、抗炎及补充神经营养素有关，故它们在神经保护和抗抑郁症方法发挥重要的作用^［21］。同时，EPA和DHA对大脑的结构和功能方面也起到重要的作用，它们可以构建和维护大脑功能、改善脑灌注、降低炎症程度等，对抑郁症、自闭症、脑血管意外等严重的脑损伤疾病有较好的疗效^［22］。

2.2 分子对接

PCA为配体，其治疗抑郁症的5个核心靶点ALB、AKT1、HSP90AA1、MMP9、MAPK8作为蛋白受体，进行分子对接，结果表明PCA有效活性成分与疾病靶点有较高的结合能力，见表2，图4。

2.3 体内实验

2.3.1 PCA对抑郁症模型小鼠的重量的影响

根据实验结果显示，经过21 d连续给药后，对照组小鼠的体重呈现上升趋势，模型组小鼠体重未见显著增加；其余3组小鼠的体重在整个实验期间呈现缓慢上升趋势。对照组与模型组小鼠比较，二者体重差异较大（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，阳性组、PCA低剂量组和高剂量组治疗后小鼠体重显著增加（P<0.05），见图5A。这个结果表明，PCA在一定程度上可以增加小鼠的进食欲望增长小鼠的体重，进而缓解小鼠的抑郁症状。

2.3.2 蔗糖偏好实验分析

经过21 d连续给药后，实验结果显示模型组小鼠的糖水偏好指数明显低于对照组，且其余3组的小鼠在治疗后糖水偏好均有一定程度的上升。与对照组比较，模型组小鼠对蔗糖的偏好显著降低（P<0.05）；与模型组比较，给予PCA高剂量组治疗后小鼠的蔗糖偏好显著增加（P<0.05）。对蔗糖偏好的影响顺序为阳性药物组>高剂量组>低剂量组。由上述结果可知，PCA可以增强抑郁症模型小鼠对蔗糖水的偏好，从而改善小鼠的抑郁状态，见图5B。

2.3.3 旷场实验分析

旷场实验主要通过对比小鼠在中心区域停留的时间和运动距离在总距离的占比情况判断小鼠的抑郁症状，见图6A、B。根据实验结果显示，与对照组比较，模型组小鼠的中央区活动时间及中央区活动总路程显著减少（P<0.01），与此相反停留在边缘区时间显著延长（P<0.01）；与模型组相比，PCA低剂量组与高剂量组小鼠的中央区活动时间及中央区活动总路程均显著增加（P<0.01），各组药物干预组之间无显著差异（P>0.05）。由上述结果显示，PCA高剂量组可以显著增强抑郁症小鼠活动能力。

2.3.4 高架十字迷宫实验分析

高架十字迷宫实验主要通过对比小鼠在开臂的时间和距离与总时间、距离的比值来判断小鼠的抑郁情况，结果见表3，图6C、6D。与对照组相比较，模型组小鼠在进入开臂时间、进入开臂运动距离显著降低（P<0.01）；与模型组相比，PCA低剂量组与高剂量组小鼠进入开臂时间、进入开臂运动距离均显著升高（P<0.01），然而，各个药物治疗干预组之间无显著差异（P>0.05）。

2.3.5 强迫游泳实验分析

强迫游泳实验通过比较小鼠在水中后4 min的静止时间来评估抑郁情况，见图7。实验结果显示，与对照组比较，模型组小鼠静止时间显著增加（P<0.01）；与模型组比较，PCA低剂量组和高剂量组小鼠静止时间均显著减少（P<0.01）。由上述结果显示，PCA可以显著减少抑郁症小鼠的静止时间，改善抑郁症小鼠的游泳状态。

3 讨论

本研究通过数据库筛出PCA的核心靶点255个，通过DisGenet等数据库获得2 131个与抑郁症相关的靶点基因，通过Venn分析筛选出PCA治疗抑郁症的共同靶点基因89个。通过构建PCA治疗抑郁症的PPI靶点网络图，发现PCA可能是通过ALB、AKT1、HSP90AA1、MMP9、MAPK8等核心靶基因起到治疗抑郁症的作用，这些基因主要与脂质代谢、动脉粥样硬化等相关，且发现PCA治疗抑郁症的潜在机制主要与氧化应激、炎症、线粒体功能障碍、脂质代谢紊乱等密切相关^［6］。GO分析中，BP富集结果显示PCA对抑郁症的治疗与信号转导、磷酸化、凋亡过程负向调控等生物过程密切相关。CC主要富集在细胞质、质膜等细胞组成中，MF主要富集在蛋白质聚集上。KEGG通路富集的结果显示，代谢、脂质与动脉粥样硬化等信号通路是PCA治疗抑郁症的重要信号传导通路。动物实验研究显示PCA对抑郁症小鼠的体重具有改善作用；蔗糖偏好实验显示PCA增强抑郁症模型小鼠对蔗糖水的偏好；旷场实验显示给予PCA的小鼠中央区活动总路程及中央区进入时间显著增加；高架十字迷宫实验显示给予PCA的小鼠进入开臂时间及进入开臂运动距离显著升高；强迫游泳实验显示PCA治疗组小鼠静止时间显著减少，小鼠更加活跃。以上动物实验均证明PCA对抑郁症具有治疗效果，故其可能会成为未来治疗抑郁症的新药特药。

近年来，抑郁症的患病率呈现逐年上升趋势，但是抑郁症的发病机制目前尚不明确，主要有六项假说，包括单胺缺乏、HPA轴障碍、神经营养因子和神经兴奋性及抑制性神经传递、细胞因子、线粒体功能障碍和氧化应激、微生物-肠-脑轴^［6］。同时随着研究的不断深入，爱尔兰科克大学Cryan教授提出了压力调节不良、免疫和肠道微生物这3个方面可能是引起抑郁症的3大主要病因，并针对性的详细阐述了此3个方面的发病机制和治疗措施^［23］。

在人体中，压力调节不良分为内部和外部两种，内部主要是由下丘脑轴介导的，这是一种调节应激心理反应的负反馈系统，并引起HPA轴反应，促进糖皮质激素、皮质醇等压力激素的产生，进而促使抑郁症的发生和发展；外部压力是由环境因素导致的平衡失调，如炎症反应、感染、缺氧等；无论内部压力还是外部压力均可诱导神经胶质细胞数量、形态和功能发生变化，进而导致神经内分泌系统、去甲肾上腺素系统、肠-脑轴等发生变化，从而出现一系列严重的抑郁症症状^［24］。目前研究发现长期的压力反应会引起大脑中海马体的形态和电生理改变，海马体是认知和记忆的中枢，在抑郁症的病理过程中也起着重要作用^［25］。压力引起的抑郁症也导致几种大脑记忆系统的损伤，这与大脑的颞叶内侧区域、海马体、杏仁核等脑部实质性损伤密切相关^［26］。

随着对抑郁症研究的不断深入，科学家逐渐发现抑郁症导致的上述脑部损伤与人体各种慢性炎症和自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、克罗恩病等）也相关，其中神经免疫补体、免疫细胞和分子会进一步驱动抑郁症的发生和发展^［27］。并且在重度抑郁症患者的血液和脑脊液中观察到免疫细胞的类型和促炎因子释放具有巨大差异性，这些都与神经免疫功能障碍密切相关，因此，临床上具有主要免疫靶点的药物均有改善抑郁症状的作用，新的免疫疗法也会有更好的临床疗效^{［28，29］}。越来越多的证据表明，T细胞（免疫细胞）通过神经保护和抗炎的作用在抑郁症的治疗中发挥着重要的作用，CD4⁺T细胞（免疫细胞）缺乏可以保护小鼠免受躯体压力诱导的焦虑和抑郁行为的发生，同时身体压力诱导的炎症因子在CD4⁺T细胞中会引发严重的线粒体裂变，而这种持续的线粒体裂变会导致系统性嘌呤代谢紊乱，其中黄嘌呤主要作用在大脑杏仁核中的少突胶质细胞，会引起细胞的增殖，从而进一步导致小鼠的焦虑、抑郁等行为学异常^［30］。

同时，上述的免疫反应与肠道菌群也有着密切的关系。近年来一些研究显示，胃肠道内的肠道相关淋巴组织（人体中70%~80%免疫细胞的来源）以及肠道对细菌脂多糖和食物源性抗原的通透性增加有助于激活低度炎症反应，并随后出现精神症状，同时神经胶质细胞介导全身炎症反应，当心理压力发生时，神经胶质细胞可能成为中枢神经炎症反应的起源，即“微生物-肠道-免疫-神经胶质”轴的反馈调节，从而导致了抑郁症等精神疾病的发生发展^［31］。然而肠道微生物及其代谢产物的变化属于生物功能障碍，它们通过调节肠-脑轴与抑郁症发生关系，同时研究表明抑郁症患者的肠道菌群与正常人的肠道菌群存在明显差异，并且将患者粪便中分离出来的分节丝状细菌、分歧杆菌等给大鼠口服后诱发了类似的抑郁行为，进一步证明了肠道菌群通过微生物-肠-脑轴来调控抑郁行为^［32］。目前临床上对于抑郁症病因病机的研究仍在继续，随着研究的不断深入，研究者们对抑郁症的认识在不断的更新，故对抑郁症的治疗方法也在不断的进步。

目前临床上对于抑郁症的治疗方法主要包括3种，心理疗法、药物疗法和体外刺激疗法。心理疗法因其安全性强、可长期治疗等优势在抑郁症治疗中具有重要地位，但是由于心理咨询师的经验不同、心理疗法的学科种类不同、心理疗法的疗效具有不稳定性等因素，故治疗水平存在着明显的差异，但是目前研究显示心理治疗方式与药物疗法相结合，可以增强大脑神经可塑性，并改善抑郁等情绪障碍的长期不良结果^［33］。在过去的二十年的心理治疗方面，临床上主要以正念认知疗法、接受和承诺疗法以及积极心理疗法为主来治疗重度抑郁症，并且经过研究表明，它们三者均侧重思维过程，而非问题的结果和想法，进而促进“心理灵活性”，故这3者心理疗法在改善认知方面均有明显疗效^［34］。然而，部分难治性重度抑郁症患者，心理疗法根本不能改变他们的思维过程，他们完全听不进去心理咨询师的开导，故需要运用药物进行治疗。目前新一代的抗抑郁药物包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、去甲肾上素再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺再摄取抑制剂、去甲肾上腺素多巴胺抑制剂和四环抗抑郁药，这些药物在服药几周内有明显疗效，但是一段时间后药物的疗效会下降，如果想停药还会出现一系列的戒断反应，故对人体产生的伤害性较为严重^［35］。当抑郁症患者药物耐药且药物副作用明显时，刺激疗法将进一步被运用，刺激疗法主要是通过刺激大脑的不同区域进行治疗，如胼胝体下扣带、腹侧被膜/腹侧纹状体等，刺激疗法的副作用较多，在临床运用中产生了许多不良事件，且患者常出现头晕、视物模糊，甚至产生更严重的自杀想法，故目前未得到广泛应用^{［36，37］}。由于目前对于抑郁症的治疗无安全性强、副作用小的治疗手段，故研制新药、寻找有效的治疗方法更为重要。中医中药是我国独特的传统治疗手段，中医针对患者症状进行辨证论治，给予相应的理法方药，在治疗抑郁症方面拥有丰富的临床经验，故通过对中药的挖掘，可发现一些治疗抑郁症的特色药物^［38］。

中药益智仁可以安神益智，临床医生常用来治疗抑郁症，并且实验研究也发现，益智提取物可以调节M1型和M2型小胶质细胞的表型转化，改善神经炎症，从而可以逆转抑郁症患者的神经炎症发生，进而延缓病情的进展^［39］。同时一项动物实验也显示，益智醇提取物能够同时作用于炎症和氧化应激通路发挥抗炎抗氧化作用，进而改善小鼠的抑郁行为^［40］。经研究发现，PCA是益智的主要活性成分之一，它是一种天然的酚酸，也是一种多酚类的代谢产物，具有抗炎、神经保护、改善认知功能等药理作用^［41］。经过此次网络药理学结合实验研究发现，PCA可能是通过ALB、AKT1等核心靶点基因及与脂质代谢相关信号通路起到治疗抑郁症的作用，同时动物实验也发现它可以改善小鼠的抑郁行为，二者说明PCA在抗抑郁症方面具有一定的疗效。并且本研究具有显著的创新性，前期并无类似的实验研究证实PCA具有抗抑郁症的作用，这也为后期的深入研究提供更加广阔的思路。因此，PCA将可能成为治疗抑郁症的一项新的活性成分，为中药治疗抑郁症提供了分子生物学依据。

同时本研究仍具有局限性。PCA治疗抑郁症是通过哪些关键的靶点基因和重要的信号通路起作用仍需要进一步机制验证。本研究目前是基于网络药理学结合动物实验为支撑，然而，PCA改善小鼠抑郁行为的机制仍需要进一步的论证。

作者贡献度说明：

高振杰、张晶：执笔撰写和部分实验设计；张大伟、邹坤坤、陈安、尹德辉：进行体内实验设计及操作实验；杨卫丽、陈安：进行统计学分析；张大伟、刘颖：审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南医科大学创新创业项目(X202211810077)

海南省自然科学基金高层次人才项目(820RC624)