基于线粒体自噬探索卡格列净对糖尿病小鼠肾脏损伤的改善作用

Mechanisms of canagliflozin alleviating kidney injury in diabetic mice via mitophagy

摘要

目的 观察卡格列净对糖尿病小鼠肾脏损伤的改善作用，并探讨其通过线粒体自噬调节机制的潜在保护效应，为糖尿病肾病的防治积累科学依据。 方法 选用24只7周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成空白组、模型组、空白给药组和模型给药组，每组6只；模型组连续5 d腹腔注射55 mg·kg^-1·d^-1链脲菌素建立糖尿病肾脏损伤模型，给药组连续12周灌胃40 mg·kg^-1·d^-1卡格列净；观察记录各组小鼠的血糖和体重变化；用H&E染色法观察肾脏组织形态与结构，TUNEL染色和Caspase3免疫组化来判定肾脏细胞凋亡情况，DHE染色法判定肾脏氧化应激程度；通过Western blot和荧光染色观察肾脏线粒体自噬相关蛋白变化。 结果 卡格列净能明显降低糖尿病小鼠的血糖（P<0.01），恢复体重（P<0.01），减少肾脏组织损伤（包括肿胀、变性及坏死），抑制肾脏细胞凋亡（P<0.01）和氧化应激水平（P<0.01），调节LC3、p62等线粒体自噬标记物的表达（P<0.01）。 结论 卡格列净通过调节线粒体自噬机制发挥了对糖尿病肾脏损伤的保护作用。

Abstract

Objective To observe the protective effects of canagliflozin on kidney injury in diabetic mice and to explore the regulatory role of mitophagy， thereby accumulating scientific evidence for the prevention and treatment of diabetic nephropathy. Methods A total of 24 male C57BL/6J mice， 7 weeks old， were randomly divided into the control group， the model group， the control treatment group， and the model treatment group， with 6 mice in each group. The model group received intraperitoneal injections of 55 mg·kg^-1·d^-1 streptozotocin for 5 consecutive days to establish a diabetic kidney injury model， and the treatment group received 40 mg·kg^-1·d^-1 canagliflozin via gavage for 12 weeks. Blood glucose levels and body weight changes were recorded for each group. H&E staining was used to observe renal tissue morphology and structure， TUNEL staining and Caspase3 immunohistochemistry were employed to assess renal cell apoptosis， and DHE staining was used to determine the level of renal oxidative stress. Western blot and fluorescence staining were used to observe changes in mitophagy‑related proteins in the kidneys. Results Canagliflozin effectively reduced blood glucose levels （P<0.01）， restored body weight （P<0.01）， reduced renal tissue damage （including swelling， degeneration， and necrosis） （P<0.01）， inhibited renal cell apoptosis （P<0.01） and oxidative stress levels （P<0.01）， as well as regulated the expression of mitophagy markers LC3 and p62 in renal cells （P<0.01）. Conclusion The protective effects of canagliflozin on diabetic kidney injury involve the regulation of mitophagy.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 线粒体 / 钠‑葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂 / 卡格列净 / 线粒体自噬

Key words

Diabetic nephropathy / Mitochondria / SGLT‑2 inhibitor / Canagliflozin / Mitophagy

糖尿病肾病是糖尿病患者常见的并发症之一，主要临床表现为蛋白尿、高血压、肾小球滤过率持续降低直至肾功能衰竭^［1］。国际糖尿病联盟预测到2045年全球有近6.93亿的糖尿病患者，其中高达40%的患者最终罹患糖尿病肾病，糖尿病肾病的发病率及致死率逐年上升，给社会带来了沉重的负担^［2］。近年来的临床实践发现，钠‑葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂类（SGLT‑2i）药物具有独立于降糖药效以外的肾脏保护作用^［3］。作为首个获批上市的SGLT‑2i品种，卡格列净的肾脏获益情况得到了多个大型临床试验的确认：它不仅可以明显降低肌酐水平，更能有效预防终末期肾病的发生^［4-6］。虽然卡格列净具有确切的肾脏保护作用，但是其确切的药理机制仍不清楚。

糖尿病肾病的发生、发展涉及糖脂代谢紊乱、氧化应激、炎症等多种信号通路，作为细胞能量代谢与氧化应激的主要场所，线粒体在糖尿病肾病的病理过程中具有非常重要的作用^［7，8］。当线粒体的形态及功能受到损伤时，就会触发线粒体自噬机制将衰老或受损的线粒体及时清除。线粒体自噬是调控线粒体质量的关键，可以决定细胞命运^［9］。有研究指出，糖尿病肾病患者中存在线粒体自噬调节紊乱，这一现象在糖尿病肾病的动物模型中也被多次报道^［10-12］。还有研究发现，破坏肾小管上皮细胞中线粒体自噬可以加重糖尿病肾脏损伤^［13］。据此，本课题组推测卡格列净的肾脏保护作用可能是通过调节线粒体自噬实现的。本研究拟建立糖尿病肾病小鼠肾脏损伤模型，探索卡格列净治疗过程中对肾脏细胞线粒体自噬相关调节信号的影响。本研究不仅有助于多角度地认识SGLT‑2i药物的药理机制，还能为糖尿病肾病的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

卡格列净（上海阿拉丁，货号：C126191）；链脲佐菌素（上海西格玛奥德里奇，货号：V900890）；组织固定液、脱蜡液、H&E染液、DAB显色试剂盒（武汉赛维尔生物，货号：G1101、G1128、G1076、G1212）；RIPA裂解液、蛋白酶/磷酸酶抑制剂、一步法快速凝胶制备试剂盒、上样缓冲液、化学发光检测试剂盒、三色预染蛋白marker（上海雅酶生物，货号：PC101、GRF101/102、PG213、LT101、SQ101、WJ103）；电泳缓冲液、快速转膜液、快速蛋白封闭液、杂交膜清洗液、抗体稀释液、PBS缓冲液（苏州新赛美生物，货号：WB52001、WB4600、P30500、WB20500、WB500D、N1013）；Caspase3 monoclonal antibody、LC3 polyclonal antibody、p62 polyclonal antibody、TOM20 polyclonal antibody、beta actin polyclonal antibody、HRP‑conjugated affinipure goat anti‑mouse IgG（H+L）、HRP‑conjugated affinipure goat anti‑rabbit IgG（H+L）、CoraLite488‑conjugated goat anti‑mouse IgG（H+L）、CoraLite647‑conjugated mouse anti‑heavy chain of rabbit IgG（武汉三鹰生物，货号：66470、14600、18420、11802、20536、SA00001‑1、SA00001‑2、SA00013‑1、SA00014‑6）；一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（江苏凯基生物，货号：KGA7073）；BCA蛋白定量试剂盒、DHE荧光探针（上海碧云天生物，货号：P0012、S0063）；PVDF膜（德国密里博，货号：IPVH00010）。

1.2 仪器设备

便携式血糖仪（德国罗氏）；超低温冰箱（青岛海尔）；台式高速冷冻离心机（德国艾本德）；电泳仪与电泳槽（上海勤翔）；化学发光成像系统（上海天能）；多功能酶标仪（美国伯腾）；组织脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、冷冻切片机、烤片台（德国徕卡）；倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯）；全景多光谱成像及定量分析系统（奥地利缇基）。

1.3 动物造模与分组

SPF级7周龄雄性C57BL/6J小鼠，购于苏州赛业生物科技有限公司（动物合格证号：SCXK苏2022‑0016）。适应性饲养1周后随机分成空白组（Control）、模型组（STZ）、空白给药组（Control+Cana）和模型给药组（STZ+Cana）：STZ组为连续5 d腹腔注射链脲佐菌素（55 mg·kg^-1·d^-1），其空腹血糖值高于16.7 mmol/L视为造模成功；Control组即平行操作腹腔注射等量生理盐水；当小鼠达14周龄时，分别在STZ组与Control组中连续12周灌胃卡格列净（40 mg·kg^-1·d^-1），即为STZ+Cana组和Control+Cana组。本实验方案已通过海南医科大学伦理委员会审批（编号：HYLL‑2023‑185号）。

1.4 小鼠肾脏H&E染色

小鼠饲养至26周龄时脱颈椎处死，剪开股动脉后经心脏缓慢注射生理盐水，直至股动脉流出液体澄清。取出肾脏后放入固定液中固定48 h以上，随后进行石蜡包埋和脱水，切片备用。切片经过烘烤后，依次浸泡于脱蜡液、无水乙醇、75%乙醇和超纯水进行前处理。然后用高清恒染预处理液、苏木素染液、超纯水、恒染分化液、超纯水、恒染返蓝液、超纯水、95%乙醇、伊红染液、无水乙醇和脱蜡液处理，最后用中性树胶封片。通过全景多光谱成像及定量分析系统评分：0分为正常，1分为受损肾小管占比不超过5%，2分为5%~25%，3分为25%~75%，4分为75%以上。

1.5 小鼠肾脏TUNEL染色

肾脏石蜡切片经过烘烤后，依次浸于脱蜡液、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、75%乙醇和PBS缓冲液。每片滴加100 µL Proteinase K工作液，于37 ℃孵育30 min，再用PBS漂洗；再滴加50 µL TdT酶反应液，于37 ℃避光孵育60 min，再次用PBS漂洗；再滴加50 µL Streptavidin‑TRITC标记液，置于37 ℃避光孵育30 min，用PBS漂洗；最后滴加DAPI染液于室温避光反应10 min后封片。用荧光显微镜进行拍照分析，设置激发波长543 nm，发射波长571 nm。

1.6 小鼠肾脏免疫组化染色

肾脏石蜡切片依次浸泡于脱蜡液、无水乙醇、75%乙醇和超纯水进行前处理，然后进行抗原修复。将切片置于3%双氧水溶液中避光室温孵育25 min，随后用PBS漂洗。用组化笔圈画切片组织，在圈内滴加封闭液，室温孵育60 min。拭去封闭液后，在圈内滴加一抗（稀释比例均为1∶500），置于湿盒内4 ℃孵育过夜。用PBS漂洗，甩干后在圈内滴加二抗，室温孵育60 min；再用PBS漂洗，甩干后在圈内滴加DAB显色剂，室温孵育50 min；用超纯水冲洗后置于苏木素染液中复染3 min，超纯水冲洗后置于苏木素分化液5 s，用超纯水冲洗后置于苏木素返蓝液中5 s；再依次置于75%乙醇、85%乙醇、无水乙醇、脱蜡液，最后晾干封片。用全景多光谱成像及定量分析系统进行扫描分析。

1.7 小鼠肾脏免疫荧光染色

肾脏石蜡切片依次浸泡于脱蜡液、无水乙醇、超纯水完成前处理后进行抗原修复；用组化笔圈画切片组织，在圈内滴加封闭液，室温孵育60 min；拭去封闭液后在圈内滴加新鲜混合的一抗（稀释比例均为1∶500），置于湿盒内4 ℃孵育过夜；用PBS漂洗，甩干后在圈内滴加新鲜混合的荧光二抗覆盖组织，室温孵育60 min；用PBS漂洗，甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。用荧光显微镜进行拍照分析，通道一设置激发波长488 nm，发射波长515 nm；通道二设置激发波长642 nm，发射波长662 nm。

1.8 小鼠肾脏DHE染色

冻存的肾脏组织用OCT包埋后，冷冻切片；切片先用PBS漂洗，置于20 µmol/L的DHE工作液中37 ℃避光孵育20 min；PBS漂洗；甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。用荧光显微镜进行拍照分析，设置激发波长520 nm，发射波长605 nm。

1.9 小鼠肾脏组织Western blot检测

肾脏置于冰上剪碎后加入RIPA裂解液匀浆处理，4 ℃下1 000×g离心10 min，取上清液用BCA法测定其中蛋白浓度。制备分离胶浓度为12.5%的凝胶，每孔上样30 µg，电泳后转膜，室温下用封闭液封闭30 min，洗膜后置于含有稀释后一抗（稀释比例均为1∶1 000）的孵育盒中4 ℃过夜，次日洗膜后加入稀释好的二抗，室温孵育60 min，用化学发光法显影条带，分析蛋白表达差异。

1.10 统计学处理

数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行分析处理，结果以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，两样本间比较采用LSD法进行检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卡格列净对糖尿病小鼠体重和血糖的影响

饲养至第12周龄时，相比于Control组，STZ组小鼠的体重明显减轻（P<0.01），而空腹血糖明显升高（P<0.01）。继续饲养至第14周龄时给予卡格列净，STZ+Cana组小鼠的体重在22周龄起恢复至与Control组相当（P>0.05），见图1A；而STZ+Cana组小鼠的空腹血糖值在20周龄起即与Control组趋同（P>0.05），见图1B。

2.2 卡格列净对糖尿病小鼠肾脏组织形态的影响

各组小鼠饲养至第26周龄时，取肾脏进行H&E染色，见图2A；相比于Control组，STZ组小鼠肾小管出现明显的肾小管上皮细胞肿胀、空泡、变性及坏死，肾小管损伤分级评分为3分；卡格列净能够有效改善STZ组小鼠的肾脏损伤，使损伤分级评分恢复正常（P<0.01），见图2B。

2.3 卡格列净对小鼠肾脏细胞凋亡水平的影响

各组小鼠饲养至第26周龄时，取肾脏进行TUNEL染色，见图3A；相比于Control组，STZ组小鼠肾脏细胞凋亡比率明显增加（P<0.01）；卡格列净能够明显减少模STZ组细胞凋亡的发生（P<0.01），见图3B。本研究同时还检测了细胞凋亡信号的重要标志物Caspase3，见图4A，再次验证卡格列净可以改善糖尿病小鼠的肾脏细胞凋亡。相比于Control组，STZ组小鼠肾脏细胞Caspase3表达明显增加（P<0.01）；卡格列净能够明显减少STZ组Caspase3表达（P<0.01），见图4B。

2.4 卡格列净对糖尿病小鼠肾脏氧化应激水平的影响

各组小鼠饲养至第26周龄时，取肾脏进行DHE染色，见图5A；相比于Control组，STZ组小鼠肾脏氧化应激信号明显增强（P<0.01）；卡格列净能够有效减少STZ组肾脏氧化应激水平（P<0.01），见图5B。

2.5 卡格列净对小鼠肾脏细胞线粒体自噬的影响

各组小鼠饲养至第26周龄时，取肾脏组织进行匀浆，测定其中线粒体自噬标志物p62及LC3的蛋白表达水平，见图6。相比于Control组，STZ组小鼠肾脏p62、LC3的表达量明显减少（P<0.01）；卡格列净能够使STZ组中p62和LC3的表达恢复正常（P<0.01）。本研究又进一步对线粒体外膜蛋白TOM20和线粒体自噬标志物LC3进行了荧光共定位分析，见图7。卡格列净能够明显降低STZ组中TOM20与LC3的共定位信号（P<0.01），该结果确证了卡格列净可修复STZ组小鼠肾脏中的线粒体自噬。

3 讨论

近年来的研究发现，线粒体数量减少与功能受损可引起肾小管、肾血管及肾间质的损伤，这提示线粒体自噬作为控制线粒体质量的重要机制，与糖尿病肾病的发生、发展存在密切关系^{［14，15］}。在糖尿病肾病的病理过程中，线粒体自噬被认为是应对细胞内损伤和维持线粒体稳态的关键过程，但不同类型肾脏细胞中的线粒体自噬调节存在明显差异。Chen等^［16］的研究表明，在线粒体自噬受损时，肾小管上皮细胞会加剧损伤，而Li等^［17］发现在线粒体自噬受抑的足细胞中，细胞凋亡明显增加。这些研究为本课题组选择线粒体自噬作为切入点提供了理论依据。在本研究中，卡格列净治疗明显降低了糖尿病模型小鼠的血糖、恢复了体重，并通过调节氧化应激、细胞凋亡以及线粒体自噬，有效改善了肾脏损伤。这表明线粒体自噬在糖尿病肾病中的作用至关重要。本研究发现卡格列净通过调节线粒体自噬机制发挥肾脏保护作用，不仅为其独立于降糖作用的肾脏保护效果提供了证据，也为糖尿病肾病的治疗开辟了新的研究方向。

线粒体自噬是一种由细胞自主执行的调控机制，旨在精准清除衰老或受损的线粒体。这一过程对于预防有害物质积累、保持细胞内部环境的稳定至关重要。简而言之，线粒体自噬可划分为以下4个关键阶段^{［18，19］}：（1）标记去极化的线粒体。当线粒体处于缺氧或应激状态时，线粒体膜电位下降，PINK1聚集在线粒体外膜上，招募E3连接酶Parkin，使线粒体外膜蛋白泛素化，标记受损线粒体触发线粒体自噬^［20］；（2）形成吞噬泡早期自噬相关蛋白，如ULK1等参与了受损线粒体周边吞噬泡的形成及延展；（3）形成线粒体自噬小体吞噬泡上的LC3可与前述中受损线粒体上的标记物结合，使吞噬泡逐渐完成对受损线粒体的包合，最终形成线粒体自噬小体；（4）降解线粒体自噬小体。线粒体自噬小体形成后，召集细胞中的溶酶体，二者接触融合，整个线粒体自噬小体被逐步分裂降解，从而清除受损线粒体。

临床研究发现，糖尿病患者的肾脏中普遍存在着线粒体结构和功能障碍。线粒体自噬是清除受损线粒体的关键环节，也是维持细胞稳态和代谢的重要过程；因此，探讨糖尿病条件下的线粒体自噬调节，对于揭示糖尿病肾病的病理机制及开发新的治疗靶点具有重要意义。线粒体自噬在糖尿病肾病进程中的调控机制尚不明确，不同类型肾脏细胞中的线粒体自噬调节过程也存在差异。Chen等^［16］在糖尿病小鼠的肾小管上皮细胞中观察到了线粒体自噬水平降低，用Mdivi‑1抑制线粒体自噬会加速肾小管上皮细胞的衰老。Li等^［17］和Guo等^［21］发现高糖会抑制足细胞的线粒体自噬，通过沉默Parkin抑制线粒体自噬可诱导足细胞凋亡。此外，Wen等^［22］和Sun等^［23］分别发现在高糖环境中肾系膜细胞和肾小球内皮细胞LC3、PINK和Parkin等线粒体自噬相关蛋白的mRNA及蛋白表达下降。本研究也再次印证了这一观点：即在高糖条件下，肾脏细胞线粒体自噬会被抑制。需要特别指出的是，尽管线粒体自噬的抑制可能加重糖尿病肾病，但长期过度激活线粒体自噬仍然可以引起细胞损伤^［16］。有文献指出，线粒体自噬标志物p62的蛋白表达水平在不同糖尿病肾脏细胞模型中呈现不同的表达模式，例如有研究报道糖尿病小鼠的肾小管上皮细胞和肾足细胞中p62表达是上调的^{［11，23］}，而本研究结果却显示糖尿病小鼠肾组织匀浆中p62表达下降。这些结果表明，糖尿病肾病状态下不同肾脏细胞的线粒体自噬调节机制具有复杂的特异性，仍需进一步深入研究。

几项大规模临床试验证实了卡格列净、恩格列净和达格列净等SGLT‑2i类药物不仅具有明显的降糖效果，还展现出独立于降糖效应的多重器官保护作用，尤其是在肾脏和心血管系统的保护方面^{［24，25］}。虽然这类药物的疗效确切，但其发挥心、肾保护作用的机制仍不明确。Heerspink等^［26］建立了基于临床样本的网络模型来探索卡格列净在糖尿病肾病进程中的作用机制，观察到卡格列净可降低TNF受体、IL‑6、MMP7和FN1等炎症和纤维化相关因子，由此推测卡格列净的肾脏保护作用可能与抑制炎症反应、细胞外基质转换以及纤维化相关的分子过程有关。Yang等^［27］的代谢组学研究进一步揭示了卡格列净在糖尿病肾病模型中的潜在作用机制，卡格列净可以通过增加肾脏内必需氨基酸水平，激活氨基酸依赖的三羧酸循环，减轻肾脏的氧化应激，由此推测线粒体可能是其肾脏保护作用的关键。

本研究结果也进一步确证了线粒体自噬在卡格列净的肾脏保护中的重要角色。除了肾脏保护作用，卡格列净还有心血管疾病方面的获益。Zinman等^［24］的研究发现，卡格列净能够有效降低糖尿病患者的心衰住院率，并减少心血管事件的发生率。Wiviott等^［28］的研究进一步证实了SGLT‑2i类药物如达格列净在降低心血管风险和改善慢性肾病患者预后方面的明显疗效。值得注意的是，一篇近期发表的文章报道了卡格列净激活PINK‑Parkin依赖性线粒体自噬，并通过提高AMPK磷酸化水平缓解糖尿病心肌病的进展^［29］。这不仅完善了对卡格列净药理机制的探索，也扩展了未来SGLT‑2i类药物的临床应用范围。

综上，卡格列净能够改善由链脲佐菌素引起的糖尿病小鼠肾脏损伤，其作用机制可能是通过调节线粒体自噬，及时清除受损线粒体，降低氧化应激水平，进而减少肾脏细胞凋亡。糖尿病肾病领域仍有许多问题亟待解决，未来具备广阔前景的研究方向，不仅包括线粒体自噬在糖尿病肾病进程中的作用及调节机制，还有基于线粒体自噬调节靶标的新型药物设计及开发。

作者贡献度说明：

翁为华：设计实验方案、分析数据并撰写论文；张玄艳、苗倩、张传震：进行实验操作、整理原始数据；王舒婷：实验技术指导；云川：数据审核、修改论文格式；郑运思：提出研究思路及论文总体把关。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金(821QN403)

海南省自然科学基金(824QN263)